Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Возбудитель бруцеллеза в l-форме 12
1.1 Общее представление об L-формах бактерий 12
1.2 Роль L-форм микроорганизмов в течение заболевания 15
1.3 Бруцеллы в L-форме 17
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1 Штаммы микроорганизмов 40
2.2 Питательные среды 40
2.3 Диагностические препараты 43
2.4 Лабораторные животные 45
2.5 Используемые методы исследования 46
2.6 Основное оборудование и приборы 48
ГЛАВА 3. Конструирование питательных сред для по лучения, культивирования и выделения бруцелл в l-форме
3.1 Подбор питательных сред для получения экспериментальных L-трансформантов бруцелл
3.2 Конструирование питательных сред для бактериологической диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме 56
3.3 Испытание сконструированных питательных сред для выделения бруцелл в L-форме от больных людей и животных
ГЛАВА 4. Культурально-морфологические свойства бруцелл в l-форме
4.1 Культуральные свойства 70
4.2 Морфология клеток бруцелл в L-форме 72
ГЛАВА 5. Характеристика бруцелл в l-форме, полученных экспериментально и выделенных из диагности- ческого материала от больных бруцеллезом людей
5.1 Применение ПЦР при исследовании бруцелл в L-форме 79
5.2 Способность к реверсии 82
5.3 Изучение дифференциальных свойств бруцелл в L-форме 83
5.4 Вирулентность 86
5.5 Чувствительность к антибиотикам 87
5.6 Патоморфологические изменения при экспериментальном бруцеллезе у морских свинок
ГЛАВА 6. Характеристика антигенных препаратов, приготовленных на основе l-субкультуры b. abortus и 12 пассажа и сывороток, полученных к ним
6.1 Специфичность антигенных препаратов из бруцелл в S- и L-формах
6.2 Получение кроличьих сывороток против бруцелл в L-форме и их характеристика
Заключение 102
Выводы 114
Список использованной литературы 115
- Лабораторные животные
- Конструирование питательных сред для бактериологической диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме
- Морфология клеток бруцелл в L-форме
- Изучение дифференциальных свойств бруцелл в L-форме
Введение к работе
Актуальность исследования. Бруцеллез представляет социально-экономическую проблему для многих стран, в том числе и для России. Интенсивность эпидемиологических проявлений бруцеллеза зависит от активности эпизоотий среди сельскохозяйственных животных (Калиновский А.И., 1997; Черкасский Б.Л., Амиреев С.А., Кноп А.Г., 1988). Предполагается, что одной из причин длительного существования эпизоотических очагов бруцеллеза и низкой эффективности их оздоровления, является трансформация возбудителя из S- в R- или L-формы (Триленко П.А., 1976; Гордиенко Л.Н., Гертман О.Г., 1989; Ременцова М.М., Семенцова В.М., Нифантьев В.М. и др., 1989; Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., 2004). Недостаточные знания об условиях образования и свойствах возбудителя в L-форме, отсутствие надежных методов их выявления и идентификации, не позволяют в полной мере оценить их роль в эпизоотическом процессе и эпидемических проявлениях. Сложность лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, связана с изменением его биологических свойств, отсутствием соответствующих сертифицированных диагностических препаратов и питательных сред. Действующие нормативно-методические документы не решают полностью данную проблему (Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю. и др., 2005; МУ 3.1.7.1189-03; Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., 2009). До настоящего времени отмечены лишь единичные случаи выделения возбудителя инфекции в L-форме из организма человека и животных (Nelson E. L., Pickett M.J., 1951; Триленко П.А., 1976). Рекомендованные питательные среды для выделения бруцелл в L-форме, технологически трудоемки и не сертифицированы (МУ 3.1.7.1189-03). Поэтому конструирование питательных сред для культивирования и выделения бруцелл в L-форме, получение и изучение свойств экспериментальных L-трансформантов и изоля-тов бруцелл в L-форме, оптимизация лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, актуальны.
Цель работы. Получить бруцеллы в L-форме и изучить их биологические особенности для совершенствования методов лабораторной диагностики бруцеллеза.
Задачи исследования:
-
Подобрать оптимальные питательные среды и селекционировать штаммы бруцелл, находящиеся на различных стадиях L-трансформации.
-
Сконструировать питательные среды для получения, выделения и культивирования бруцелл в L-форме.
-
Выявить биологические особенности полученных штаммов бруцелл, находящихся на различных стадиях L-трансформации, а также изолятов из диагностического материала от больных бруцеллезом людей.
-
Получить и охарактеризовать антигенные препараты на основе бруцелл в L-форме и сыворотки, полученные к ним.
Научная новизна. С целью усовершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме:
Впервые получен и депонирован в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «М») Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», штамм Brucella abortus И-206 L-форма, которому присвоен номер Brucella abortus КМ 4. Штамм находится в стабильной L-форме.
Сконструированы высокочувствительные селективные питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в L-форме.
Изолированы и впервые охарактеризованы штаммы бруцелл в L-форме, длительно персистировавшие в организме больных бруцеллезом людей.
Показана возможность использования штамма бруцелл в стабильной L-форме при создании антигенного диагностикума, для выявления специфических антител в сыворотках крови больных людей и животных.
Разработан способ получения растворимого антигенного препарата из бруцелл в L-форме, пригодного для конструирования диагностических тест-систем (защищено патентом «Способ получения антигенного препарата из бру-целл в L-форме» № 241629, зарегистрированном в Государственном реестре изобретений РФ 20 апреля 2011 г.).
Получена высокоспецифичная и высокоактивная кроличья L-сыворотка для идентификации бруцелл в L-форме.
Практическая значимость. В процессе экспериментальных исследований разработаны питательные среды для выделения и культивирования бруцелл в L-форме, имеющие преимущества перед рекомендуемыми в действующих методических указаниях (МУ 3.1.7.1189-03). Питательные среды обладают выраженными селективными свойствами, подавляют полностью рост бруцелл в S-форме, не препятствуют при этом росту L-форм возбудителя. Среды просты в приготовлении, не требуют фильтрации и автоклавирования, могут готовиться в сухом виде, что увеличивает срок хранения, поэтому позволяет использовать их как в лабораторных, и, что особенно важно, в полевых условиях. Питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл на основе рыбного гидролизата прозрачна, что улучшает визуализацию при отборе колоний подозрительных на бруцеллы. С использованием предлагаемых питательных сред изолированы два штамма бруцелл в L-форме, длительно персистировавшие в организме больных людей с хронической формой заболевания, что позволяет рекомендовать их для совершенствования лабораторной диагностики бруцеллеза. «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл сухая» прошла испытания в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (акт медицинских испытаний от 24.10. 2012 г.) и во ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (акт медицинских испытаний от 26.10.2012 г.) и рекомендована для серийного производства.
Разработаны вставки для чашки Петри, применяемые при изучении ростовых свойств питательных сред, позволяющие улучшить визуализацию результатов, сократить количество лабораторной посуды и сэкономить питательные среды (защищено патентом «Вставка для чашки Петри» № 79562, зареги-
стрированном в Государственном реестре полезных моделей РФ 10 января 2009 г.).
Материалы исследований включены в «Методические рекомендации по выделению бруцелл в L-форме», утвержденные директором ФГУЗ Иркутск-НИПЧИ Сибири и ДВ Роспотребнадзора (протокол № 5 от 28 апреля 2010), Методические указания МУК 4.2.3010-12 «4.2. Методы контроля: биологические и микробиологические факторы. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 29.03.2012 г.
Диссертационная работа выполнена в рамках двух НИР: 010-2-10 «Разработка и совершенствование лабораторных методов выявления неманифестных очагов бруцеллеза» № ГР 01200511207 (2006-2010 гг.) и 010-2-11 «Оптимизация лабораторной диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме» № ГР 01201068221 (2011-2015 гг.).
Апробация работы. Материалы, посвященные вопросам L-
трансформации, свойствам бруцелл в L-форме, диагностике бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме, представленные в диссертации, апробированы: на двух международных научных конференциях (Санкт-Петербург, 2008; Ставрополь, 2010), трех всероссийских научных и научно-практических конференциях, конгрессах (Киров, 2008; Оболенск, 2010; Москва, 2012), научных конференциях Иркутского противочумного института (2008-2012). Диссертационная работа обсуждена и одобрена на научной конференции ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол № 1 от 10.01.2014 г).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный способ получения бруцелл в L-форме, основанный на постепенном увеличении концентрации антибиотика в питательной среде, позволяет получать бруцеллы на различных стадиях L-трансформации, в том числе в стабильной L-форме.
-
Печеночный настой и рыбный гидролизат, выбранные в качестве базовых основ питательных сред, позволяют конструировать высокочувствительные и селективные питательные среды для выделения и культивирования бру-целл в L-форме.
-
L-трансформанты бруцелл, полученные экспериментально и выделенные из диагностического материала от больных бруцеллезом людей, по биологическим свойствам, в том числе по культурально-морфологическим, вирулентности, антибиотикочувствительности существенно отличаются от бруцелл в S-форме.
-
Полученные корпускулярные и водорастворимые антигены бруцелл в L-форме обладают высокой специфичностью и активностью, что определяет возможность конструирования на их основе диагностических тест-систем.
5. Применение двухцикловой схемы иммунизации инактивированным
антигеном из штамма B. abortus И-206 в L-форме 12 пассажа позволяет полу
чать высокоактивную и высокоспецифичную кроличью сыворотку к бруцеллам
в L-форме, пригодную для идентификации возбудителя бруцеллеза в L-
форме.
Публикации результатов. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, два патента на изобретения.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая позиция в научном обосновании исследования, планировании и проведении экспериментов и обобщении полученных результатов. В этапах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена экспериментальная работа, теоретический анализ, обсуждение полученных результатов и представление их в научных докладах и публикациях и внедрение их в практику.
Структура и объем диссертационной работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 130 страницах, иллюстрирована 30 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель содержит 145 источников, из которых 116 работ отечественных и 29 зарубежных авторов.
Лабораторные животные
cПри получении специфических сывороток к антигенам бруцелл в S- и L-формах использовали 35 кроликов породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг.
Изучение вирулентности и патоморфологических изменений в органах, подбор МИД, персистенцию возбудителя бруцеллеза, выделение бруцелл из организма зараженных животных и больных людей, получение ревертантов проводили на 250 морских свинках массой 250-300 г. Экспериментальных животных получали из питомника лаборатории подопытных животных (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Рос-потребнадзора). Животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвекцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животных эвтанизировали методом цервикальной дислокации пятого позвонка спинного мозга, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Страсбург, 1986 г.).
Все работы с микроорганизмами проводили с соблюдением требований биологической безопасности СП 1.3.1285-03 [95]. Учет, хранение передачу и транспортировку бруцелл и полученных из них антигенов осуществляли в соответствии с СП 1.2.036-95 [94].
Бактериологические, серологические исследования и отбор материала проводили согласно МУ 3.1.7.1189-03 [64]. Реакцию кольцепреципитации ставили по Асколи 1906 [66].
Определение специфической стерильности препаратов из бруцелл в S-и L-формах для получения гипериммунных сывороток и постановки серологических реакций осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациям по контролю специфической стерильности биологических препаратов, приготовленных из бруцелл» [59].
Чувствительность бруцелл в S- и L-формах к антибиотикам определяли согласно МУК 4.2.2495-09 [65] и инструкции по применению набора дисков для определения чувствительности к противомикробным препаратам.
При организации работы и проведении ПЦР руководствовались методическими указаниями [63], рекомендациями [55] и инструкциями по применению.
Отбор материала и бактериологическую диагностику проводили в соответствии с МУ 3.1.7.1189-03 [64].
Сбор, хранение и утилизацию медицинских отходов осуществляли согласно СанПиН 2.1.7.728-99, СП 1.3.1285-03 [91, 95].
Материалы для проведения электронной микроскопии готовили, руководствуюсь Методическими рекомендациями [57]. Препараты готовили из бактериальной массы бруцелл в концентрации не выше 1010 м.к., которую фиксировали 2,5 % глютаровым альдегидом (Serva) на ФСБ рН 7,2 в течение 15-20 мин. После фиксации микробную взвесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 1 % ОsO4 (Serva) на дистиллированной воде и фиксировали в течение двух ч, после чего взвесь снова центрифугировалась. Все манипуляции, связанные с фиксацией культуры, проводилась в бактериологическом боксе. Образовавшийся осадок заливали 5 каплями 2 % агара Дифко (Serva) в дистиллированной воде при температуре 50 оС, размешивали и разливали тонким слоем на предметное стекло. После застывания гель разрезали на кусочки размером 22 мм и окрашивали 3 % раствором уранилацетата (Serva) в 30о этиловом спирте течение двух ч. Для дегидратации использовали последовательное погружение в этиловый спирт 50о, 70о, 96о и двухкратно – в ацетон. Для изготовления блоков с исследуемым материалом использовали эпон-аралдитовую эпоксидную смолу (Serva). Для пропитки материал заливали смолой и выдерживали сутки, после чего полимеризовали при 65 оС в течение 24 ч. С целью увеличения твердости блоков их дополнительно выдерживали при комнатной температуре двое суток. Ультратонкие срезы (500 Ао) изготовляли с помощью ультратома LKB-8800 стеклянными ножами. Полученные срезы докрашивали 3 % уранилацетатом в течение 15 мин. Просмотр препаратов и получение фотодокументов проводили с помощью электронного микроскопа JEEL-100S (Япония) на увеличения 30000 и фотоувеличителя «Ленинград».
Патологоанатомический материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине, заливали в целлоидин. Тканевые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и тионином [53]. Количественную оценку размеров структурных зон иммунокомпетентных органов проводили с помощью компьютерной программы «Motic Images Plus» (версия2). Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа «Zeiss» (Германия) с видеокамерой «Moticam 2000», разрешение 13921040 пикселей, об. 100.
Конструирование питательных сред для бактериологической диагностики бруцеллеза, обусловленного возбудителем в L-форме
При создании селективной питательной среды для выделения и культивирования бруцелл в L-форме использовали печеночную среду, на которой процесс L-трансформации проходил наиболее эффективно. Недостатками этой среды были: необходимость ее стерилизации, которая требовала применения специального оборудования, продолжительность приготовления, а также ухудшение качества среды за счет разрушения термолабильных компонентов. Поэтому нами предпринята попытка создания питательной среды, не требующей стерилизации, для чего в состав среды ввели 0,25 % кристали-ческого фиолетового. Концентрацию антибиотика, подавляющую рост бру-целл в S-форме, но не влияющую на рост бруцелл в L-форме, определяли, используя питательную среду на основе печеночного настоя с добавлением 20 % НЛС. Бициллин-3 вводили в концентрациях 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ЕД/мл среды и затем высевали штаммы бруцелл референтные (B. melitensis16 M, B. abortus 544, B. suis 1330), B. abortus И-206 (исходный), контролем служил B. abortus И-206 в L-форме. Результаты представлены в таблице 2. Примечание: отр. – роста нет
Из данных таблицы 2 видно, что исходный штамм B. abortus И-206 обладает некоторой повышенной устойчивостью к бициллину-3, так как, в отличие от референтных штаммов, растет на питательной среде с концентрацией антибиотика, составляющей 2000 ЕД/мл. Однако отмечено, что его время роста увеличено до 7-16 сут. Минимальная подавляющая концентрация бициллина-3 для этого штамма составила 3000 ЕД/мл среды. L-форма B. abortus И-206 (5 пассаж) резистентна к бициллину-3 и растет при его концентрациях от 2000 до 5000 ЕД/мл среды в течение 4-5 сут, а при концентрациях от 6000 до 8000 ЕД/мл – 8 сут. Таким образом, показано, что добавление в питательные среды бициллина-3 в концентрации не ниже 3000 ЕД/мл, полностью ин-гибирует рост бруцелл в S-форме и не препятствует росту бруцелл в L-форме.
Питательная среда на основе печеночного настоя, приготовленная в сухом виде, представляет собой светло-коричневый аморфный порошок, имеющий следующие физико-химические показатели: рН 7,2±0,2, аминный азот 0,7 %, потеря в массе при высушивании не более 7 %, прочность студня 505 г. Питательную среду легко приготовить, для чего количество среды, указанное на этикетке, растворяют в 1 л дистиллированной или кипяченой воды и кипятят в течение 2-3 мин. Расплавленная среда прозрачна, имеет бледно-сероватый оттенок. После охлаждения до 40±5 С в состав среды отдельно вносят стерилизованные заранее: 1 % глицерин, 20 % НЛС и 3107 ЕД бициллин-3, после чего среда мутнеет. На питательной среде, приготовленной из сухой основы печеночного настоя с генцианвиолетом (1:100 000), первые генерации возбудителя бруцеллеза в L-форме в виде мелких колоний появлялись через 5 сут при посеве 5102 м.к., а на 7 сут отчетливо видны мелкие колонии при посеве 102 м.к. Чувствительность этой среды составила в среднем 30 колоний (33,3 %) при посеве 100 м.к. и 126 колоний (25,2 %) при посеве 500 м.к. бруцелл в L-форме. На питательной среде, приготовленной из сухой основы для получения и культивирования бруцелл в L-форме, не наблюдалось роста колоний исходного штамма B. abortus И-206 в S-форме (контроль), который подавлялся добавлением в питательную среду бициллина-3.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения печеночного настоя как основы для создания сухих селективных сред, не требующих автоклавирования, для получения и культивирования бруцелл в L-форме, что очень важно для практического применения особенно в полевых условиях.
Дальнейшая работа по улучшению ростовых свойств питательных сред для выделения и культивирования бруцелл в L-форме проводилась путем подбора более дешевого сырья для получения гидролизатов и внесения различных добавок (рыбный гидролизат, рыбно-дрожжевой гидролизат, дрожжевой экстракт, сухая желчь) в базовую основу (БО), которая содержала на один литр питательной среды 0,1 г цистеина, 0,005 г витамина В1, 1,0 г глюкозы, 0,3 г крахмала, 0,05 г молибденово-кислого аммония, 0,03 г тиоглико-левой кислоты, 0,9 г агар-агара. Испытано 13 вариантов питательных сред, содержащих БО, с добавлением на один литр питательной среды, из них 9 плотных: 1) БО + 17 мл рыбного гидролизата №1; 2) БО + 20 мл рыбно-дрожжевого гидролизата; 3) БО + сухого рыбного гидролизата 1,0 г и дрожжевого экстракта 0,2 г; 4) БО + сухого рыбного гидролизата 1,0 г, дрожжевого экстракта 0,2 г и сухой желчи 0,1 г; 5) БО + сухой печеночной воды 2,0 г, дрожжевого экстракта 0,2 г; 6) БО + сухого рыбного гидролизата 1,2 г; 7) БО + 2 мл пекарских дрожжей и 1,0 г сухого рыбного гидролизата; 8) БО без ти-огликолевой кислоты + 17 мл рыбнодрожжевого гидролизата; 10) БО + 17 мл рыбнодрожжевого гидролизата и генцианвиолета в конечном разведении 1:500 000 – и четыре жидких: 9) БО + 17 мл рыбно-дрожжевого гидролизата и натрия двууглекислого до рН 7,2 ± 2; 11) БО с содержанием 0,03 % агар-агара и 17 мл рыбно-дрожжевого гидролизата; 12) БО с содержанием 0,03 % агар-агара, 17 мл рыбно-дрожжевого гидролизата и 10 % НЛС; 13) БО с содержанием 0,03 % агар-агара, 1,0 г рыбного гидролизата, 0,2 дрожжевого экстракта и 10 % НЛС. Для отбора образцов сконструированных питательных сред использовали разработанные фторопластовые вставки для чашки Петри с тремя или четырьмя секторами (рисунки 2, 3). Апробацию фторопластовых вставок проводили с использованием агаров: триптозного, Альбими, эритрита, печеночного, которые в количестве по 5 мл наливали в сектор. На каждый из секторов высевали B. abortus 19 BA по 10 м.к. и через пять суток проводили окончательный учет, из 10 м.к. на триптозном агаре выросло 3, а на остальных по 7 колоний бруцелл. Метод позволил в три – четыре раза сэкономить расход сред, улучшить визуализацию результатов.
Морфология клеток бруцелл в L-форме
Бруцеллы в L-форме отличаются выраженным полиморфизмом клеток. Установлено, что морфология клеток всех 18 штаммов бруцелл менялась в зависимости от концентрации трансформирующего агента в питательных средах. При фазово-контрастной микроскопии бруцеллы, выросшие на плотных питательных средах с концентрацией бициллина-3, составляющей 10 ЕД/мл (1 пассаж), имели обычный вид – мелкие кокко-бактерии, не отличающиеся от исходных форм (рисунок 8).
Проведено изучение препаратов L-субкультур B. abortus И-206 5 и 12 пассажей методом электронного микроскопирования. При анализе и описании полученных результатов опирались на проведенные ранее работы [87]. В ультратонких срезах, приготовленных из L-субкультуры B. abortus И-206 5 пассажа (концентрация бициллина-3 2000 ЕД/мл), наблюдали клетки сферо-пластного типа, имеющие наружную и цитоплазматическую мембраны, ци-топлазматическое пространство расширено (рисунок 18). На срезах L-субкультур B. abortus И-206 12 пассажа (концентрация бициллина-3 9000 ЕД/мл) отмечали различные морфологические формы клеток: крупная бинарно делящаяся клетка, имеющая нарушенную клеточную мембрану, недалеко от нее небольшая клетка – элементарное тело (рисунок 19); в группе протопластов – бинарно делящийся протопласт и элементарное тело (рисунок 20), протопласты, а также элементарное тело (рисунок 21), гигантская клетка со значительно расширенной вакуолью, занимающей центральную часть клетки, хорошо видны наружная клеточная мембрана, отслоенная от ЦПМ. В расширенном пространстве между КС и ЦПМ расположены морфологические структуры, напоминающие элементарные тела в стадии формирования. К гигантской клетке примыкает протопласт, не имеющий наружной мембраны (рисунок 22).
Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что в морфологической картине ультратонких срезов L-субкультур B. abortus И-206 наблюдается выраженный полиморфизм, обусловленный присутствием клеток типичных для бруцелл в L-форме: сферопластов, протопластов, клеток с частично нарушенной клеточной стенкой, элементарных тел, гигантских клеток.
ПЦР, обладая высокой специфичностью, позволяет в короткие сроки (4-6 ч) идентифицировать возбудителя бруцеллеза. Поэтому с целью установления возможности идентификации бруцелл в L-форме с помощью ПЦР проведено сравнительное исследование исходных штаммов B. melitensis 342 и B. abortus И-206 и их L-субкультур 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 пассажей, полученных на искусственных питательных средах с концентрациями бициллина-3 (2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 ЕД/мл среды). Установлено, что все исходные штаммы бруцелл и их L-субкультуры дают положительный результат, выражающийся в амплификации специфических фрагментов размером 299 и 175 п.н., что свидетельствует об их генетической однородности и принадлежности к Brucella spp. (рисунки 23, 24, 25).С целью установления возможности реверсии L-субкультуры штамма B. abortus И-206 12 пассажа и двух культур, выделенных от людей, их пассировали на питательных средах без трансформирующего агента и на биопробных животных. Реверсию проводили под контролем фазово-контрастной микроскопии, постановкой слайд-агглютинации на стекле и РА с поливалентной бруцеллезной сывороткой, L-сывороткой (ФКУЗ Иркутский противочумный институт Роспотребнадзора). На питательной среде без трансформирующего агента проведено 67 пассажей B. abortus И-206 в L-форме, с культурами, выделенными от больных людей, – 53 пассажа. Во всех случаях в мазках у всех изучаемых культур наблюдались характерные морфологические признаки бруцелл в L-форме. В серологических реакциях все штаммы с поливалентной бруцеллезной сывороткой не агглютинировались.
На морских свинках путем шести последовательных пассажей проведена попытка реверсии культуры, выделенной от больной «З» и экспериментального штамма B. abortus И-206 в L-форме. В результате проведенных опытов ревертанты получены не были.
В результате проведения реверсии на питательных средах и эксеримен-тальных животных двух культур, выделенных от больных людей, и L-субкультуры B. abortus И-206 12 пассажа ревертанты получить не удалось, что свидетельствует о том, что культуры находятся в стабильной L-форме. При этом отработана заражающая доза 21010 м.к. и более, позволяющая выделять культуры из органов и крови морских свинок, особенно результативно – из костного мозга. При выделении культур из организма морских свинок подмечена особенность, заключающаяся в том, что наибольшее количество культур при пассажах выделяли через 7-14 суток после заражения, а не через 30 суток, как при традиционном способе при работе с бруцеллами в S-форме [31,70].
Изучение дифференциальных свойств бруцелл в L-форме
На основании полученных нами данных экспериментальные L-трансформанты бруцелл всех пассажей значительно отличаются по дифференциальным свойствам от исходных штаммов. Бруцеллы в L-форме, выделенные от больных людей, хоть и близки по своим дифференциальным свойствам к B. melitensis, однако, более точное определение может позволить молекулярно-генетическое изучение штаммов.
Вирулентность L-субкультур B. abortus И-206 (5 и 12 пассаж) изучали на 45 морских свинках. Каждой группе из пяти особей подкожно вводили 108, 109, 1010 м.к. Контрольных животных заражали исходным штаммом B. abortus И-206. Бруцеллы в L-форме при всех дозах заражения удалось выделить только из лимфатических узлов. Индекс инфицированности морских свинок, зараженных бруцеллми в L-форме, был значительно ниже, чем у контрольной группы и составлял 2,2-5,5 и 75-79, соответственно. При этом в РХ с корпускулярным бруцеллезным L-диагностикумом (ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора) антитела к бруцеллам в L-формах выявляли в 75-100 %, а с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА была отрицательной. Сыворотки от контрольных животных, напротив, положительно реагировали с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА и не взаимодействовали с корпускулярным антигеном из L-субкультуры B. abortus И-206.
При определении вирулентности изолятов бруцелл в L-форме от людей использовали 60 морских свинки, которых заражали подкожно дозами: 109, 2109, 5109, 1010, 21010, 41010 м.к. На 7 и 14 сут после заражения животных выводили из эксперимента под наркозом, для бактериологического исследования забирали регионарные и отдаленные лимфатические узлы, паренхиматозные органы и кровь.
Визуально в месте введения на 7–14 сут после заражения у большинства морских свинок, зараженных высокими дозами: 1010, 21010, 41010, наблюдали некротические изменения, располагающиеся в дерме, отмечался отек подкожной клетчатки и мышечного слоя, а также кровоизлияния и кровенаполнение сосудов.
При бактериологическом исследовании патологического материала от лабораторных животных с использованием питательных сред для выделения бруцелл в L-форме при дозах заражения 109–5109 м.к. из лимфатических узлов изолированы (регионарная форма инфекции) единичные колонии. При более высоких дозах заражения (1010-41010 м.к.) культуры бруцелл в L-форме выделяли из лимфатических узлов, селезенки и крови, что свидетельствует о генерализованной форме инфекции.
Сыворотки животных, от которых были выделены культуры, реагировали с бруцеллезным L-антигеном и не взаимодействовали с диагностикумом бруцеллезным цветным для РА.
Таким образом, L-трансформанты бруцелл, полученные экспериментально и изолированные от больных людей, обладали слабой вирулентностью, но в высоких дозах были способны вызывать генерализованную форму инфекции, а также образование специфичных антител, к бруцеллам в L-форме.
Клинические наблюдения показали, что применяемая антибиотикоте-рапия мало эффективна при лечении обострения при хроническом бруцеллезе у людей. Поэтому культуры бруцелл в S- (референтные и исходный штаммы) и L-формах (выделенные от людей и экспериментальный) изучили на чувствительность к некоторым антибиотикам (таблица 7).
Результаты, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что по чувствительности к антибиотикам бруцеллы в S- и L-формах различаются между собой. Так все бруцеллы чувствительны к нетилмицину, тетрациклину, левомицетину, а также, за исключением культуры от больной «М» к си-зомицину, тобрамицину. Испытуемые штаммы бруцелл полностью не чувствительны к оксациллину и цефотаксиму. Референтные штаммы и B. abortus (S) чувствительны к гентамицину, в то время как экспериментальный B. abortus (L) и культуры от человека проявляют к нему промежуточную устойчивость. Особенный интерес представляет результат, полученный при испытании штаммов с полимиксином, при котором все бруцеллы в S-форме были устойчивы и высокоустойчивы, а в L-форме – чувствительны или обладали промежуточной устойчивостью, что можно использовать как тест для дифференциации бруцелл в L-форме от бруцелл в S-форме.
Экспериментальный L-трансформант штамма B. abortus И-206 по чувствительности к некоторым антибиотикам отличается от бруцелл в L-форме, изолированных от людей. Он чувствителен к неомицину, стрептомицину, ка-намицину, в то время как культуры от больных были к ним либо не чувствительны, либо промежуточно чувствительны. Отмечено, что к антибиотикам группы цефалоспоринов референтные штаммы проявляют неодинаковую чувствительность, так высокую устойчивость практически ко всем представителям проявляет B. abortus 544, из 7 антибиотиков этой группы B. meliten-sis 16M чувствителен к трем (цефалоклор, цефотаксим, цефтриаксон), а B. suis 1330 – к четырем и к двум – промежуточно устойчив. Бруцеллы в L-форме к цефалоспоринам в целом устойчивы или высокоустойчивы, за исключением культуры от больной «М», которая оказалась чувствительной к цефоперазону.
Из полученных результатов следует необходимость и важность проведения более широких бактериологических исследований, направленных на выделение возбудителя бруцеллеза, изучение его чувствительности к антибиотикам, что, несомненно, будет способствовать индивидуальному подходу для более успешного этиотропного лечения больных бруцеллезом людей.
