Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на значительные успехи в различных областях медицины, проблема нозокомиальных инфекций, вызываемых P. aeruginosa, ещё далека от разрешения. В настоящее время этот возбудитель способен быстро вырабатывать мультиустойчивость к антибиотикам самых различных классов, в связи с чем обычная терапия часто не приводит к положительным результатам (Strateva Т. and Yordanov D., 2009).
В России и зарубежом отсутствуют иммунопрепараты для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa. В то же время множество экспериментальных вакцин и моноклональных антител протестированы в доклинических испытаниях, а часть из них достигла клинической фазы исследований. В литературе имеется незначительное количество сообщений о рандомизированных контролируемых испытаниях по оценке эффективности вакцин против синегнойной инфекции у пациентов с кистозным фиброзом или пациентов из группы риска, однако ни одна из вакцин не получила разрешения на использование в практике здравоохранения (Doring G. and Pier G.B., 2008; JohansenH.K. and Gotzsche P.C., 2008).
По данным литературы, перспективными для разработки являются поликомпонентные конъюгированные генно-инженерные вакцины (Doring G. et ah, 2007), при создании которых используют наиболее иммуногенные антигены P. aeruginosa.
Синегнойная палочка обладает многочисленными факторами
патогенности, такими как гемолизин, лецитиназа, протеаза, эластаза,
экзотоксин S, экзотоксин А и другими. Существенную роль в поражении
организма хозяина при развитии синегнойной инфекции играет именно
экзотоксин А, ингибирующий синтез клеточных белков и вызывающий
летальный эффект у экспериментальных животных (Liu, P.V., 1973).
Установлено, что экзотоксин А продуцируют более 90% клинических штаммов
P. aeruginosa (Вертиев Ю.В. и др., 1982). Экзотоксин А синтезируется в виде
одной полипептидной цепи. Анализ кристаллической структуры показал, что его молекула состоит из трёх доменов: домен I (с 1 по 252 аминокислотные остатки), необходимый для связывания с рецептором на клетках-мишенях, домен II (с 253 по 404 аминокислотные остатки), осуществляющий трансмембранный перенос токсина в клетку, и домен III (с 405 по 613 аминокислотные остатки), обладающий токсической активностью (Allured, V.S. et al. 1986). Именно домен III инактивирует эукариотический фактор элонгации 2 при помощи АДФ-рибозилирования, ингибируя белковый синтез в клетках и апоптоз. Изменение аминокислотной последовательности домена III в ряде случаев приводит к снижению токсичности экзотоксина A (Douglas, СМ. andRJ. Collier, 1987).
Целесообразность включения экзотоксина А в вакцину против синегнойной инфекции не вызывает сомнений, однако иммунобиологические свойства его доменов практически не изучены, что затрудняет выбор наиболее иммуногенной и безопасной атоксичной формы экзотоксина А.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования является получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина А P. aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств.
Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи: 1. Создать генно-инженерные конструкции на основе плазмиды рЕТ28, несущие: а) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую полную рамку считывания гена экзотоксина А (ТохА), используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из P. aeruginosa; б) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домен I (aToxl); в) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую только домены I и II (aToxl,2); г) последовательность гена экзотоксина А, кодирующую домены I, II и часть домена III (аТох1,2,АЗ).
Получить бактериальные (Е. coli) продуценты рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2, aToxl,2,A3 и ТохА и оценить степень их экспрессии.
Получить очищенные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2, aToxl,2,A3 и ТохА.
Оценить токсичность полученных белковых препаратов для животных.
Изучить иммуногенные свойства рекомбинантных белков aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,АЗ на экспериментальных животных.
Изучить протективные свойства полученных белковых препаратов aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3.
Получить специфические иммунные сыворотки к рекомбинантным белкам aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,АЗ и оценить их защитные свойства.
Научная новизна
Впервые сконструированы штаммы-продуценты (Е. coli)
рекомбинантного экзотоксина А P. aeruginosa - ТохА и его атоксичных форм: aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3. Доказана идентичность токсических свойств рекомбинантного ТохА и нативного экзотоксина А. Впервые полученные делеционные рекомбинантные белки aToxl, aToxl,2 и aToxl,2,A3 оказались нетоксичными для животных. Выявлены иммуногенные свойства рекомбинантных белков - aToxl,2 и aToxl,2,АЗ; трехкратное их введение мышам индуцировало увеличение титра специфических антител в 8000 раз. Максимальную протективную активность проявлял рекомбинантный белок aToxl,2,АЗ с индексом эффективности 8,9. Иммунные сыворотки крови кроликов к рекомбинантному белку aToxl,2,АЗ (титр 1:420000) обладали протективными свойствами (индекс эффективности 7,3).
Практическая значимость
На основе очищенного рекомбинантного белка aToxl,2,A3 может быть сконструирован новый иммунобиологический препарат для иммунизации доноров с целью получения антитоксической плазмы, а так же возможно его использование в качестве компонента комплексной противосинегнойной вакцины.
Рекомбинантный экзотоксин А целесообразно использовать при разработке тест-систем, предназначенных для оценки антитоксической активности специфических иммунобиологических препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту
Сконструированные штаммы-продуценты (Е. coli) pET28-aToxl, pET28-aToxl,2, pET28-aToxl,2,A3 и рЕТ28-ТохА характеризуются высоким выходом целевых продуктов (на уровне 40 - 70 %). Технологические приёмы получения и очистки рекомбинантных белков позволяют наработать их в количествах, достаточных для биологического тестирования.
Полученный очищенный рекомбинантный белок ТохА (73,8 кДа) идентичен по токсическим свойствам нативному экзотоксину А. Очищенные рекомбинантные белки aToxl (38,6 кДа), aToxl,2 (49,0 кДа), aToxl,2,A3 (65,8 кДа) атоксичны, а варианты aToxl,2 и aToxl,2,A3 обладают иммуногенными и протективными свойствами.
Иммунная сыворотка к рекомбинантному белку aToxl,2,A3 способна защищать животных от введения экзотоксина А.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на: итоговой
конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках
приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и
разработки по приоритетным направлениям развития научно-
технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007);
Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); XII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); XII международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); IX межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ (Волгоград, 2008); II съезде микологов России (Москва, 2008); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009).
Апробация диссертации состоялась на конференции отдела микробиологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН 2 апреля 2010 года.
По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из которых 2 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 223 источника, из которых 31 отечественные.
Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрированного 15 рисунками и 7 таблицами.
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
