Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Использование бактерий рода Bacillus в медицине 7
Глава 2. Ранозаживляющие лекарственные средства 26
Глава 3. Материалы и методы 38
3.1. Материалы исследований 38
3.2. Методы исследований 40
Глава 4. Обоснование состава и разработка технологии бактиспорин- пласта 43
4.1. Обоснование состава бактиспоринпласта и гомогенизация композиции коллаген — концентрат бактиспорина 43
4.2. Разработка режима сублимационного высушивания композиции 45
Глава 5. Изучение биологических, физико-химических свойств препарата 50
5.1. Изучение специфической активности бактиспоринпласта 50
5.2. Изучение физико-химических свойств препарата 56
5.3. Изучение стабильности бактиспоринпласта 60
Глава 6. Изучение ранозаживляющего действия бактиспоринпласта 66
Глава 7. Исследование безвредности нового препарата 95
7.1. Исследование хронической токсичности бактиспоринпласта 95
7.2. Изучение местного раздражающуго действия на слизистые оболочки 98
7.3. Исследование аллергизирующего действия препарата 98
Заключение 100
Выводы .112
Библиографический список литературы из
- Использование бактерий рода Bacillus в медицине
- Ранозаживляющие лекарственные средства
- Обоснование состава бактиспоринпласта и гомогенизация композиции коллаген — концентрат бактиспорина
- Изучение специфической активности бактиспоринпласта
Введение к работе
Актуальность темы. Профилактика и лечение гнойных ран является одной из важных задач современной научной и клинической медицины, так как ежегодно в России и странах СНГ регистрируется около 5 млн. больных с гнойно-воспалительными заболеваниями (А.А. Воробьев и др., 1996). В связи с повышением устойчивости бактерий к антибиотикам, возникла необходимость разработки альтернативных лечебно-профилактических мероприятий, среди которых важное место занимает использование -пробиотиков, в том числе из бактерий рода Bacillus, обладающих антимикробной активностью. Бактерии В. subtilis продуцируют более 70 различных антибиотиков (В.В. Смирнов и др., 1982, 2001). Лабильность структуры антибиотического вещества, продуцируемого живой бактериальной клеткой, предотвращает адаптацию возбудителя к препарату, не формируются устойчивые штаммы инфекционных агентов. Использование живых бактериальных клеток, продуцирующих широкий спектр антибиотиков в минимальных количествах, предотвращает подавление местного и системного иммунитета и развитие побочных осложнений в виде дисбактериоза или аллергических реакций (В.В. Смирнов, 2002; В.И. Никитенко, 2002).
Антибактериальная активность бактерий рода Bacillus усиливается действием продуцируемых литических ферментов, активно лизирующих клетки как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Синтезируемые этими бактериями протеолитические ферменты стимулируют регенерационные процессы тканей теплокровных, обладают тромболитическим действием (В.В. Смирнов, 2001). Пробиотики из бактерий рода Bacillus широко представлены препаратами для перорального применения. Однако их сложно использовать местно для лечения ран.
4 В последнее время получило развитие новое направление в совершенствовании лекарственных форм для местного лечения ран -разработка аппликационных покрытий для эпидермального введения биологически активных соединений в организм. Наиболее перспективным направлением является создание раневых покрытий на основе биодеградируемого природного полимера коллагена (Л.П. Истранов, 1984; Р.К. Абоянц, 1999; А.Б. Шехтер,1999).
Таким образом, разработка нового комплексного ранозаживляющего микробиологического препарата для местного применения на основе биорастворимого полимера - коллагена и Bacillus subtilis, а также изучение его фармакологической активности является актуальной задачей.
Цель исследования
Создание нового иммунобиологического препарата — бактиспоринпласта, изучение его специфической и фармакологической активностей.
Задачи исследования
Разработать медицинский микробиологический препарат на основе бактерий В. subtilis ЗН в форме коллагеновой губки для местного лечения ран и профилактики гнойных осложнений.
Изучить биологические свойства созданного препарата: количество живых клеток Bacillus subtilis, антагонистическую активность в отношении тестовых штаммов условно-патогенных микроорганизмов.
Определить оптимальные условия хранения и срок годности — бактиспоринпласта.
Провести оценку безвредности созданного препарата.
Изучить ранозаживляющую эффективность аппликационного лекарственного средства на животных.
5 Научная новизна
Впервые:
разработана технология получения нового ранозаживляющего
лекарственного средства бактиспоринпласта для местного применения;
установлена стабильность биологических свойств бактерий штамма В. subtilis ЗН в созданной лекарственной форме;
показано, что бактиспоринпласт обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных бактерий;
показана высокая ранозаживляющая активность бактиспоринпласта на модели условно-чистых и гнойных ран экспериментальных животных.
Научно-практическая значимость
Создан новый препарат — Бактиспоринпласт для профилактики осложнений и лечения гнойных ран, показана его эффективность при заживлении экспериментальных ран у животных.
По результатам исследований разработана нормативно-техническая документация на Бактиспоринпласт.
Изготовлены экспериментально — производственные серии нового препарата - Бактиспоринпласта.
Основные положения, выносимые на защиту
- Создание нового лекарственного средства на основе эубиотика
бактиспорина и уксусно-кислого раствора коллагена в форме пластины для
нанесения на рану.
- Новая лекарственная форма превосходит по ранозаживляющей активности
пероральный препарат — «Бактиспорин сухой», а по спектру
антибактериальной активности, стабильности не уступает ему.
- Бактиспоринпласт представляет удобную лекарственную форму для
местного применения. При практическом использовании подавляет
инфекцию, очищает раны от гнойно-некротических тканей и стимулирует
репаративные процессы в ране.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов АН РБ и УНЦ РАН (Уфа, 2003); Межрегиональной науч. конф, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.Карпова. (Томск, 2003), Межрегиональной конф. биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья. (Оренбург, 2003), Всероссийской научной конференции молодых ученых. — «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 2 в центральной печати: «Экспериментальная и клиническая фармакология» и ЖМЭИ.
Объем и структура диссертационной работы.
Диссертация изложена на 132 страницах, иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы (2 главы), раздела собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и библиографического списка литературы, содержащего 182 источника, в том числе 121 отечественных и 61 зарубежных работ.
Использование бактерий рода Bacillus в медицине
С тех пор как было открыто свойство различных микробных культур, подавлять рост других микроорганизмов и особенно патогенных, виднейшие естествоиспытатели работали над проблемой практического использования явления антагонизма микробов (Л. Пастер, И.И. Мечников, Н.Ф. Гамалея и др.). Широкое признание и отражение в трудах многих биологов и врачей нашли идеи И.И. Мечникова, предложившего использовать для борьбы с инфекцией, преждевременным старением и другими недугами штаммы живых микробов-антагонистов. На современном этапе, в области медицинской микробиологии, такую целенаправленную коррекцию нарушенных биохимических и физиологических процессов за счет введения нужных бактерий-сапрофитов, продуцирующих БАВ, предлагается назвать «микробной сапрофитной фармакотерапией» (Л.А. Пирузян, Е.М. Михайловский, 1992).
В работах исследователей приводятся данные об успешной терапии различных патологических процессов с помощью живых культур Bacillus subtilis. Лечение инфицированных ран и ожоговых поверхностей проводилось путем применения повязок, смоченных взвесью живой микробной культуры В. subtilis (Rocchietta J., 1969; Haenel H., Bending J., 1975; Nozari-Renard J., 1978; Ю.С. Винник и др., 1998).
Югославские исследователи приводят данные по достоверному ускорению процессов заживления ран и царапин у пациентов, получавших перорально пищевые продукты или биопрепараты на основе живых бактерий рода Bacillus (Blaznik, 1976). В.И. Никитенко (1991) получил убедительный статистически достоверный терапевтический эффект в наблюдениях на более чем 250 хирургических больных с гнойными ранами при пероральном использовании препарата из бактерий рода Bacillus. На основе штамма В. subtilis 534, выделенного из негнойной раны больного, был создан препарат Споробактерин (В.И. Никитенко, 1989; Н.А. Михайлова и др., 1993). Его использовали для лечения гнойных ран, остеомелита, сепсиса, пиелонефрита, пневмонии у 276 человек. Полное излечение без применения антибиотиков отмечено у 197 (71,4 %) больных, улучшение состояния у 57 человек (20,7%) и только у 22 больных из-за отсутствия положительного эффекта применены другие способы лечения.
Споробактерин в опытах in vitro подавляет от 80 до 100 % штаммов стафилококка, стрептококка, патогенной кишечной палочки, дизентерии, сальмонелл, протея, синегнойной палочки, возбудителей газовой гангрены и столбняка. Кроме того бактерии, входящие в препарат, продуцируют широкий набор протеолитических ферментов, способствующих очищению очагов повреждения от некротизированных тканей при местном применении (В.И. Никитенко и др., 2002).
Препарат Бактиспорин, действующим началом которого является штамм В. subtilis ЗН, высокоэффективен при лечении острых кишечных инфекций и дисбактериозов у детей и взрослых, а также для профилактики гнойно-септических осложнений в предоперационной подготовке (О.В. Галимов и др., 1999; Л.Н. Мазанкова и др., 1997; А.А. Фазылова и др., 1998, 1999, 2000, Т.В. Хасанова и др., 2001). Показан лечебно-оздоровительный эффект использования бактиспорина у рожениц групп риска (Р.Х. Гатауллина и др., 2001, 2002). Особенно эффективным Бактиспорин оказался в случае применения его при дисбактериозах, вызванных кандидозными грибками, листериями и псевдомонадами (Н.С. Бродинова и др., 1999). Показана перспективность его использования в комплексном послеоперационном лечении лейкоплакии шейки матки (Р.Р.Загидуллина, Н.Н.Глебова, 2000) и для восстановительной терапии туберкулезных больных (Э.С. Симонова и др., 2000, Р.Х. Гисматов, 2004). Бактиспорин применяли для лечения детей с термической травмой. Препарат назначался перорально и в виде повязок на ожоговые раны и пересаженные аутотрансплантаты, что позволило устранить случаи дисбактериоза и в два раза сократить сроки очищения и заживления ран (Е.Б. Свечникова и др., 1999). При использовании бактиспорина повышается чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам, что значительно повышает эффективность лечения инфекционных заболеваний в хирургических стационарах (Т.В. Хасанова, 2001, 2002).
Применение Бактиспорина в лечении хирургических больных позволило предохранить больных от инфицирования госпитальной флорой, обеспечивало нормализацию клинических показателей (температуры тела и уровня лейкоцитов в крови), снижение количества гнойно-воспалительных осложнений в 2-3 раза и санацию раны на 2-3 дня быстрее, чем при использовании традиционной терапии (Т.В. Хасанова, 2003).
Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, считают, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Отсутствие патогенности у штаммов В. subtilis и всех других близкородственных им бактерий послужило основанием для присвоения им Управлением по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США статуса CRAS (generally regarded as safe)- вполне безопасных организмов (К. Харвуд, 1992).
Механизмы лечебного действия этих культур изучались широко в экспериментах на животных. Предполагается, что лечебный эффект определяется комплексом факторов, в их числе: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; образование высокоактивных ферментов: протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и других; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения В. subtilis элиминируется из крови (В.В. Смирнов, и др. 1982,1985,1988,1992; А.Т. Слабоспицкая и др., 1990; К. Харвуд, 1992).
Антагонистическое действие бацилл осуществляется за счет продукции различных по природе биологически-активных веществ: полипептидных антибиотиков, лизоцима, литических и протеолитических ферментов (В.В. Смирнов и др., 1993; Г.К. Олейникова и др, 1995; И.Г Ахапкина и др, 1995; И.Б.Сорокулова, 1996; Kugler М. et al., 1990, Loeffler W. etal., 1990).
Ранозаживляющие лекарственные средства
В настоящее время в результате селективного прессинга антибиотиков, применяемых в медицинской практике, антибиотикорезистентность приняла глобальный характер (А.З. Смолянская, 1993). Устойчивость к антимикробным препаратам имеет огромное социально-экономическое значение и в развитых странах мира рассматривается как угроза национальной безопасности. Значимость этой проблемы отражена в ряде документов, принятых международными и национальными организациями. К основным из них относятся "Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию антибиотикорезистентности" (2001) и "Копенгагенские рекомендации", принятые странами Европейского союза в 1998 г. В России в 2000 году создан Научно-методический отдел Министерства здравоохранения РФ по мониторингу антибиотикорезистентности.
Гнойная рана — сложное и многоплановое явление. Оновными возбудителями гнойных хирургических инфекций считаются стафилококки и грамотрицательные бактерии, принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae и к большой группе неферментирующих бактерий (Н.С. Богомолова, 1990; А.В. Конычев, 1991). Существенную роль в этиологии раневой инфекции играют облигатные неспорообразующие анаэробные бактерии (М.И. Кузин, 1990). В настоящее время наибольшее внимание исследователей вызывают следующие проблемы, имеющие фундаментальный характер: факторы микроорганизмов, оказывающие влияние на другие микроорганизмы и на макроорганизм, системы антибактериальной защиты организма, регуляция иммунного ответа при гнойной инфекции. В практическом плане важна разработка принципов патогенетического лечения гнойных ран и их осложнений (Dowsett С, 2002). Основные принципы деления процесса заживления ран на фазы были разработаны С.С. Гирголавом (1956), R. Ross (1968), В.И. Стручковым (1975) и М.И. Кузиным (1990). По современным представлениям, определяющим патогенетическую направленность лечебных мероприятий, раневой процесс разделяют на 3 фазы: воспаления, регенерации и реорганизации рубца с эпителизацией. В фазе воспаления вначале преобладают сосудистые реакции, характеризующие механизм воспаления, а затем происходит очищение раны от погибших тканей. Вторая фаза связана с образованием грануляционной ткани. Реорганизация рубца и эпителизация являются основными компонентами, завершающими течение раневого процесса (Attinger С.Е., 2001; Gilmore М.А., 1991). Особое место в терапии гнойных ран отводится лекарственным препаратам для местного применения, использование которых позволяет создать необходимую концентрацию активного вещества в очаге поражения и снизить дозу лекарственных препаратов, предназначенных для системного введения.
Различные лекарственные препараты для местного лечения ран могут иметь однонаправленное действие или оказывать комплексное и разностороннее влияние на раневой процесс. Н.А. Ляпунов с соавт. (1995) сформулировали основные задачи местного лечения гнойных ран (Н.А. Ляпунов, 1995).
Современные подходы к лечению гнойных ран предполагают дифференцированное применение лекарственных средств в зависимости от фазы раневого процесса.
Для местного лечения ран используются антимикробные препараты (антибиотики и антисептики) (А.П. Красильников, 1992; М.И. Кузин, 1990; Т.Я. Пхакадзе, 1996; В.И. Стручков, 1975), протеолитические ферменты (Т.В. Нарциссов, 1992; Р.К. Рахманов, 2002; Н.А. Ляпунов, 1995), дегидратирующие и противовоспалительные растворы и мази (Э.А. Нечаев, 1993; А.П. Чадаев, 2003). Широко применяются в хирургической практике комбинированные лекарственные средства, такие как многокомпонентные мази на гидрофильной основе ("Левомеколь", "Левосин , "Нитацид" и др.) (СВ. Добыш, 2001; А.П. Чадаев, 2003), пенные аэрозоли ("Диоксизоль", "Цимезоль" и др.) (Е.П. Безуглая, 1995), сорбенты ("Полисорб", "Регенкур" и др.) (В.М. Буянов, 1993; А.А. Адамян, 1998; Э.О. Шилова, 2002), антиоксиданты (А.А. Иванян, 1998).
Имеются данные о высокой результативности в лечении и профилактике гнойных ран "Амбипора" — биосовместимого полимера с иммобилизованными в нем порошкообразными антибактериальными препаратами (А.В. Воленко, 1999). Duckova К. с соавт. (1997) сообщают об антимикробном и иммуностимулирующем эффектах дисперсионного состава из плейрана грибов Pleurotus ostreatus, хлоргексидина и сульфата цинка (Duckova К., 1997).
В первой фазе раневого процесса актуальной является борьба с инфекцией, которая подразумевает использование антисептиков и антибиотиков. Однако в связи с приобретением антибиотикоустойчивости патогенными и условно-патогенными штаммами микроорганизмов, возникает необходимость поиска новых лекарственных средств. Иммунобиологические препараты занимают ведущее место среди высокоэффективных средств воздействия на микробиоценоз человека. В связи с появлением новых штаммов бактерий, резистентных к антибиотикам, растущей аллергизации населения, интерес к лечебным медицинским иммунобиологическим препаратам возрастает.
Использование микробов-антагонистов (пробиотиков) для борьбы с болезнетворными бактериями предложено еще в 1903 году И.И. Мечниковым (И.И. Мечников, 1961). Фундаментальные исследования современной науки позволили разработать и внедрить в практику многие пробиотики, основу которых составляют живые микробные культуры (Бактиспорин, Биоспорин, Бактисубтил и др.). Имеются основания для использования пробиотиков при лечении гнойных ран (Е.И. Дерябин, 2000; 1992), а также в качестве иммуномодулирующего и антиаллергенного средства (Т.К. Лопатина, 1996).
Совершенствование местного лечения направлено в основном на применение самых современных эффективных препаратов, и сложность подбора этих препаратов заключается в динамичном и многогранном течении процесса в зависимости от индивидуальных особенностей конкретного пациента (Т.В. Нарциссов, 1992).
В последнее время получило развитие новое направление в совершенствовании местного лечения ран: разработка носителей лекарственных средств. Положительное значение носителей лекарств было обнаружено еще в отношении иммобилизованных на них протеиназ (В .К. Гостищев и др., 1995) (В.К. Гостищев, 1995). На первых этапах внедрения в практику раневых покрытий использовались марлевые салфетки. Впоследствии при лечении ран применялись покрытия с разнообразными фиксирующими материалами — от фильтровальной бумаги до многослойных многофункциональных материалов и перевязочных средств. (И.А. Ерюхин, 2003; F. Granel, S., 1999).
Особое значение приобретают носители при лечении больших раневых поверхностей или раневых процессов, протекающих на фоне нарушения микроциркуляции в тканях, так как известные традиционные способы местного лечения либо несовершенны, либо очень дороги. Наложение мазей на рану снижает интенсивность заживления из-за нарушения газо-, влаго- и теплообмена. Кроме того, при формировании грануляционной ткани мазевые повязки прилипают к раневой поверхности, а при смене их происходит повреждение грануляций. Большое значение при разработке различных носителей придается в настоящее время не только вопросу повышения эффективности медикаментов, но и непосредственному воздействию фиксирующих материалов на раневой процесс. Максимально отвечают вышеуказанным требованиям коллагеновые покрытия.
Обоснование состава бактиспоринпласта и гомогенизация композиции коллаген — концентрат бактиспорина
Для изготовления бактиспоринпласта использовали концентрат бактиспорина, обладающий антибактериальной, иммуностимулирующей, ранозаживляющей активностями и в качестве формообразующей основы 2% раствор коллагена.
Экспериментально было установлено, что уксуснокислый раствор коллагена совместим с концентратом бактиспорина, образует композицию бежевого или желтовато — бежевого цвета, при этом КОЕ не снижались. После замораживания и сублимационного высушивания тонкого слоя композиции получили пористые губки, представляющие собой удобную форму раневого покрытия.
Равные соотношения коллагена и концентрата Большая часть коллагена Большая часть концентрата бактиспорина Пористые губки, удобные в применении Губки очень хрупкие, рассыпчатые Губки тонкие не пористые Состав компонентов (коллаген - концентрат бактиспорина) в соотношении 1:1 явился оптимальным, т.е. 1кг 2 % коллагена и 1 л концентрата. Для отработки технологии важно было получить однородную массу коллаген - концентрат бактиспорина. С этой целью жидкую композицию тщательно перемешивали в гомогенизаторе при скорости вращения лопастей мешалки 2000 оборотов в минуту в течение 3 минут до абсолютной однородности.
Предварительные эксперименты показали, что увеличение содержания бактериальных клеток в пластине выше 5x109 нецелесообразно, так как это существенно не влияет на повышение антибактериальной активности. В препарате «Бактиспорин сухой» для перорального применения 1 доза содержит не менее 1x109 кл/мл и является дозой, оказывающей клинически выраженный эффект (В.В. Смирнов, 1982). Исходя из литературных данных и проведенных нами исследований, установили, что для получения бактиспоринпласта необходимо смешение коллагена с концентратом биомассы, содержащей (2-5)х109 кл/мл. Дальнейшие эксперименты проводили исходя из вышеуказанной концентрации препарата в бактиспоринпласте. 4.2. Разработка режима сублимационного высушивания композиции
После гомогенизации полученную композицию коллагена с концентратом бактиспорина разливали в кассеты из нержавеющей стали размером (240x240x50) мм по 500 мл (высота столба жидкости не превышала 8 мм), далее подвергали сублимационному высушиванию.
Для оптимизации процесса сублимационной сушки проводили определение эвтектических зон методом электропроводности для коллагеновой композиции и остаточной влажности конечного продукта. Эвтектическую зону выявило измерение сопротивления при замораживании и оттаивании композиции.
На температурной кривой наблюдаются перегибы, соответствующие фазовым превращениям при 0 С, минус 8 С. Перегибы выражены не очень четко. На кривой же резистивности наблюдаются резкие перегибы при переходе препарата из жидкого состояния (малое значение резистивности) в твердое (большое значение резистивности) и обратно. Точки пересечения этих кривых, спроецированные на температурную ось, показывают, что температура замораживания и плавления препарата равна соответственно — О С, минус 8 С. При использовании вышеуказанных значений температур, не наблюдалось вспенивание препарата при вакуумировании и последующем высушивании методом сублимации, что подтверждает точность измерений.
Таким образом, была определена пороговая температура, превышение которой в период собственно сублимации могло бы привести к коллапсу материала.
Режим замораживания и сублимации отрабатывали совместно с микробиологом финишного цеха Филиала ФГУП НПО «Микроген» «Иммунопрепарат» Т.И. Варламовой на сублимационной установке ТГ-50 (Германия).
Рабочий вакуум в процессе сублимации не превышал 15 Па, температура конденсатора минус (50-60) С. Расчетная температура оптимального прогрева полок в период постоянной скорости сушки при рабочем вакууме 15 Па составила 10 С (И.В.Звягин и др, 1981), что позволило удерживать температуру материала ниже эвтектической в процессе всего периода собственно сублимации. На рисунке представлен режим сушки коллагеновой смеси при полной загрузке камеры. С целью быстрого замораживания и предупреждения расслоения компонентов, кассеты с разлитой массой устанавливали на охлажденные до минус (20 — 30) С полки сублиматора. После заморозки продукта до минус 20 С камера вакуумировалась до равновесной рабочему давлению 15 Па (минус 40 С). Далее устанавливалось стандартное течение процесса, период собственно сублимации. На 16 часу сушки на графике отмечается температурный скачок, означающий окончание возгонки свободной воды, после чего происходит удаление связанной воды. На 30 часу температура материала совпадала с температурой полки, при которой препарат досушивали еще в течение (9±2) часов. Показания вакуума колебались в пределах 15-16,7 Па. Температура досушивания соответствовала (30±2) С. Влажность конечного продукта находилась в прямой зависимости от длительности процесса. При длительности высушивания (33±3) часов остаточная влажность составляла (7-12) %, при сокращении времени сублимации до (30±2) часов влажность достигала 15 %, что удовлетворяло требованиям, предъявляемым к готовому препарату.
При масштабировании технологического процесса получения бактиспоринпласта использовали гомогенизатор. Для этого в простерилизованный реактор загружали 2% раствор коллагена и концентрат бактиспорина. Композицию тщательно перемешивали мешалкой в течение 3 минут со скоростью до 2000 оборотов в минуту. Приготовленную композицию разливали по 0,5 л в кассеты из нержавеющей стали размером 240x240x50 мм и сушили в аппарате ТГ—50. Замораживание и сублимационную сушку проводили по выше изложенному методу. Листы пластин кондиционировали в течение 24 часов при относительной влажности 70 % и температуре (18-24) С в боксовом помещении. Полученные листы пористых губок разрезали, герметично упаковывали в полимерные пакеты, маркировали, затем контролировали согласно разработанным проектам ФСП на бактиспоринпласт. Технология производства ранозаживляющего покрытия — бактиспоринпласта изложена в проекте регламента производства бактиспоринпласта.
Изучение специфической активности бактиспоринпласта
Сравнительное изучение свойств штамма B.subtilis ЗН в концентрате биомассы и экстрагированного из бактиспоринпласта.
Бактерии штамма B.subtilis ЗН в бактиспоринпласте, образуют новую композицию, описания которой нет в литературе. При лиофильном высушивании бактиспоринпласта могла произойти сорбция или иммобилизация бактерий на коллагене. Поскольку бактерии рода Bacillus обладают выраженной адаптивной изменчивостью свойств, в зависимости от условий существования, проведено изучение стабильности основных свойств штамма B.subtilis ЗН, экстрагированного из бактиспоринпласта.
Изучение морфологических свойств штамма B.subtilis ЗН до соединения с коллагеном и после экстракции из бактиспоринпласта показало, что морфологические свойства сравниваемых бактерий аналогичны друг другу и характерны для первой группы рода Bacillus подгруппы В: грамположительные спорообразующие палочки, размером (0,3;0,7 - 1,8) мкм, клетки не раздуваются при спорообразовании, споры элипсовидные, расположены центрально, не образуют глобул в цитоплазме клеток при выращивании на глюкозном агаре.
Проведено сравнительное изучение основных биохимических свойств штамма B.subtilis ЗН в концентрате биомассы до соединения с коллагеном и экстрагированного из бактиспоринпласта: на способность продуцировать протеазу, желатиназу, амилазу, каталазу, лецитиназу; ферментировать глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу; гидролизовать крахмал, мочевину; расщеплять тирозин и утилизировать цитрат; образовывать аммиак, индол и сероводород.
Установили, что штамм B.subtilis ЗН экстрагированный из бактиспоринпласта не отличается по этим свойствам от биомассы штамма до ее соединения с коллагеном. Поскольку свойства продукции протеазы является важным в процессе лечения ран, была изучена зона гидролиза казеина у бактерий в концентрате биомассы и после экстракции из пластины, зона расщепления составила (4,0±0,5) мм.
Таким образом, созданная новая лекарственная форма «Бактиспоринпласт» не изменяет морфологических и биохимических свойств штамма B.subtilis ЗН.
Изучение специфической активности бактиспоринпласта В процессе изготовления бактиспоринпласта изучали показатели специфической активности: количество живых клеток/мл B.subtilis ЗН и антагонистическую активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
Определение содержания живых микробных клеток В. subtilis ЗН (КОЕ) проводили в исходном концентрате биомассы до соединения с коллагеном, в жидкой композиции с коллагеном и в губке после сублимационного высушивания (для определения КОЕ в готовом препарате готовили экстракт из пластины, метод описан в гл.З). Количество живых бацилл определяли путем последовательных десятикратных разведений с последующим высевом на картофельно-глицериновую среду.
На рисунке представлены колонии штамма В. subtilis ЗН через 1 сутки после титрования. Все колонии образуют R-формы, диаметром 2-2,5 мм, шероховатые с волнистым краем, непрозрачные, бежевого или желтовато бежевого цвета, сухой консистенции. В процессе изготовления пластин не происходило диссоциации микробной популяции, так как все клетки образовывали только R-колонии.
Приведенные данные указывают, что морфологические свойства бактерий В. subtilis ЗН в процессе получения бактиспоринпласта остаются стабильными. Одна пластина бактиспоринпласта содержит 3 мл концентрата биомассы или 6 мл композиционной смеси бактиспорина. Как следует из данных таблицы, не происходит снижения концентрации бактериальных клеток на последовательных стадиях изготовления бактиспоринпласта, то есть изготовление пластин идет в щадящем режиме для бацилл.
В препарате после высушивания 18±2 17±3 18±1 18+2 13±1 31±3 18±2Г Проведенные исследования показали, что бактериальные клетки, находящиеся в композиции с коллагеном, сохраняют высокий уровень антагонистической активности в отношении тестовых штаммов. Задержка роста в тесте отсроченного антагонизма к штаммам St. aureus «Никифоров», St. aureus «Филипов», Рг. mirabilis, Рг.vulgaris, Е. coli 157, S. flexneri составляет 11-20 мм, а С. albicans до 34 мм.
Как следует из выше представленных данных показатели специфической активности (количество живых микробных клеток и антагонистическая активность) препарата в процессе его изготовления (в концентрате, жидкой композиции и сухом препарате) не имели достоверных отличий (р 0,05). Препарат стабилен на данных технологических этапах в трех сериях препарата.
Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов Контроль экспериментально — производственных серий на отсутствие посторонней микрофлоры проводили в два этапа. На первом этапе просматривали мазки, приготовленные из экстракта препарата и окрашенные по Грамму, в которых выявляли только характерные для бацилл грамположительные спороносные палочки. На втором этапе высевали препарат на чашки Петри с питательными дифференциальными средами для выявления посторонней микрофлоры согласно ВФС 42-2904-97 на «Бактиспорин сухой».
При контроле препарата было выявлено отсутствие роста посторонних микроорганизмов и грибов на питательных диагностических средах, что является основанием для заключения об отсутствии контаминации в пластинах.
