Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
2.1. Общая характеристика фосфорорганических соединений 9
2.2. Механизм действия фосфорорганических пестицидов на организм 12
2.3. Диагностика и средства лечения при отравлении фосфорорганическими пестицидами 17
2.4. Альтернативные модели в токсикологических исследованиях 25
2.4.1. Применение культур клеток в токсикологических исследованиях 28
Собственные исследования 32
3.1. Материалы и методы исследований 32
3.2. Результаты собственных исследований 37
3.2.1. Исследование цитотоксичности карбофоса и хлорофоса на перевиваемых культурах клеток 37
3.2.1.1. Изучение воздействия хлорофоса на перевиваемые культуры клеток MDBK и ВНК-21/13-02 37
3.2.1.2. Изучение воздействия карбофоса на перевиваемые культуры клетокМБВК и ВНК-21/13-02 39
3.2.2. Использование культур клеток MDBK и ВНК -21/13-02 для скрининга холинолитиков 43
3.2.2.1. Цитотоксичность хлорофоса на фоне воздействия различных холинолитиков 43
3.2.2.2. Цитотоксичность карбофоса на фоне воздействия различных фармакологических средств 47
3.3. Изучение влияния ФОП и холинолитиков на гладкомышечные органы кролика 52
3.3.1. Воздействие хлорофоса на моторику изолированного отрезка тощей кишки кролика 52
3.3.2. Воздействие холинолитиков на моторику изолированного отрезка тощей кишки кролика 56
3.3.3. Действие холинолитика А-7 на гладкомышечный препарат подвергнутый воздействию хлорофоса 58
3.4. Определение острой токсичности новых холинолитиков 61
3.5. Разработка антидотной рецептуры АЛ-7 66
3.6. Влияние антидотной рецептуры АЛ-7 на динамику показателей крови животных 70
3.6.1. Биохимические и гематологические показатели крови животных при введении антидотной рецептуры АЛ-7 70
3.6.2. Терапевтическая эффективность антидота АЛ-7 при отравлении белых крыс хлорофосом 73
3.6.3. Терапевтическая эффективность применения антидотной рецептуры АЛ-7 при экспериментальной затравке кроликов фосфорорганическими пестицидами 76
3.7. Исследование сердечной деятельности кроликов, отравленных
хлорофосом и леченных антидотной рецептурой АЛ-7 97
4. Обсуждение результатов исследований 105
Выводы 121
Практические предложения 122
Список использованной литературы 123
Приложение 150
- Механизм действия фосфорорганических пестицидов на организм
- Применение культур клеток в токсикологических исследованиях
- Изучение воздействия карбофоса на перевиваемые культуры клетокМБВК и ВНК-21/13-02
- Определение острой токсичности новых холинолитиков
Введение к работе
Актуальность темы. Широкое использование лекарственных средств является одним из основных способов профилактики и терапии болезней животных. Создание новых лекарственных веществ предполагает поиск биологически активных соединений и их клиническое испытание. В последнее время все чаще для оценки токсичности лекарственных средств применяют методы биотестирования на различных биологических моделях (Г.Ф. Леванова, 2002; Т.В. Бойко, 1999; В.А. Антипов, А.Н. Трошин, 2009).
Вопрос внедрения альтернативных методов, в том числе культуральных, для изучения токсичности и безопасности лекарств в систему доклинических исследований в России остается незавершенным. Между тем, в Европе оценка токсичности препаратов in vitro активно используется во многих сферах биотехнологии наравне с клиническими испытаниями. Основными мотивами для внедрения альтернативных методов являются этические соображения, исключающие эксперименты на животных и экономические, предусматривающие снижение материальных затрат на оценку безопасности потенциальных лекарственных препаратов (А.И. Марченко и др., 2000; Л.П. Михайлов, 2002; Г.Т. Айтдинов и др., 2008; Л.В. Коломбет и др., 2008). Интеграция России в европейские экономические структуры, в частности, предполагаемое вступление в ВТО, потребует принятия аналогичных европейским законодательных актов, ограничивающих использование животных для токсикологических испытаний (М.В. Тертичная, 2005; А.П. Еськов и др., 2003; Т.П. Денисова, Е.В. Симонова, 2008).
Одной из причин высокой заболеваемости и падежа животных является экологическая обстановка и несоблюдение санитарно-гигиенических требований. По данным Всемирной организации здравоохранения, значительную долю токсических экологических факторов составляют пестициды. Среди них одно из лидирующих мест занимают фосфорорганические пестициды (ФОП). В этой связи разработка средств для лечения животных при отравлениях данными соединениями остается актуальной задачей ветеринарной фармакологии и токсикологии (Д.П. Елизаров и др., 2001; А.В.Иванов, 2007, 2009; СВ. Шабунин, 2009;).
Несмотря на большое количество препаратов, предназначенных для лечения острых интоксикаций ФОП, остается необходимым дальнейшее изыскание новых антидотных средств в связи с дороговизной и недостаточной эффективностью существующих препаратов (К.Х. Папуниди, М.Я. Тремасов, P.M. Асланов, 2009).
В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» синтезирован ряд новых холинолитиков, эффективность которых предстояло установить. Кроме того было важно проследить особенности фармакологических и токсикологических эффектов химических препаратов на биообъектах разного уровня организации, начиная от клеточного (культура клеток) и органно-тканевого (изолированный отрезок тощей кишки кролика) до организменного (животные).
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ отдела токсикологии ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» по заданию «Токсикологическая безопасность» (№ гос. регистрации 01200202603).
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение фармако-токсикологических свойств новых холинолитиков и возможности использования клеточных культур, органно-тканевого комплекса для первоначального скрининга холинолитиков и разработать антидотную рецептуру для защиты животных от отравлений ФОП.
Исходя из поставленной цели, решались следующие задачи:
1. Определить токсические дозы хлорофоса и карбофоса на перевиваемых культурах клеток почек крупного рогатого скота (MDBK), сирийского хомячка (ВНК - 21/13-02) и провести сравнительную оценку вновь синтезированных холинолитиков при совместном культивировании с ФОП на перевиваемых культурах клеток.
2. Определить влияние ФОП совместно с холинолитиками на изолированный отрезок тощей кишки кролика. 3. Определить параметры острой токсичности синтезированных холинолитиков и разработать антидотную рецептуру для лечения животных при отравлении ФОП.
4. Изучить гематологические, биохимические и электрокардиографические показатели при экспериментальной затравке лабораторных животных ФОП и лечении антидотной рецептурой.
Научная новизна работы. Впервые в сравнительном плане изучены токсические эффекты ФОП с использованием биообъектов разного уровня организации (культура клеток — изолированный нервно-мышечный препарат — организм). На основе нового холинолитика разработана антидотная рецептура АЛ-7, показана ее терапевтическая эффективность. Исследованы гематологические, биохимические и электрокардиографические показатели лабораторных животных при экспериментальной затравке и лечении разработанным антидотом.
Практическая значимость. На основании полученных данных рекомендовано использование перевиваемых культур клеток и изолированного нервно-мышечного препарата для определения токсичности пестицидов и для первоначального скрининга веществ с потенциально антидотными свойствами. Разработаны антидотная рецептура АЛ-7, предназначенная для лечения острых отравлений фосфорорганическими пестицидами, а также инструкция по применению антидота АЛ-7 для лечения животных при отравлении фосфорорганическими пестицидами, утвержденная начальником Главного Управления ветеринарии Кабинета Министров РТ от 12.11. 2009г.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2009 гг.; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Достижение молодых ученых - в производство» -(Казань, 2008), пятом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученных «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Втором съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе одна статья - в издании, рекомендованном ВАК РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- Обоснование возможности использования клеточных культур и изолированного нервно-мышечного препарата для оценки токсического действия фосфорорганических пестицидов и скрининга препаратов с потенциально антидотными свойствами.
- Разработка антидотной рецептуры (АЛ-7) с изучением влияния на организм животных и оценка её терапевтической эффективности.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 155 страницах компьютерного текста и включает: общую характеристику, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 235 источников, в том числе 44 зарубежных авторов.
Механизм действия фосфорорганических пестицидов на организм
ФОП проявляют свое токсическое действие вследствие наличия как и у фермента холинэстеразы определенного сходства в строении с естественным субстратом холинэстеразы - ацетилхолином, как стереохимически, так и по реакционной способности. При достижении активного участка холинэстеразы их взаимодействие с ферментом сводится к фосфорилированию (или карбамилированию) гидроксила серина. Различия при взаимодействии холинэстеразы и с ацетилхолином, и с ФОП заключаются в том, что в первом случае образуется ацетилированный фермент - весьма непрочное соединение, быстро подвергающееся гидролизу, в результате чего активные центры холинэстеразы освобождаются для новых реакций с ацетилхолином. При взаимодействии холинэстеразы и ФОП образуется устойчивый к гидролизу фосфорилированный фермент, неспособный реагировать с молекулами ацетилхолина и поэтому утратившими свою каталитическую функцию (Ю.С. Каган, 1977; И.А. Тараканов, 1994; В.В. Колбасов, А.И. Ельнин, 1997; И.В. Маркова, 1999).
Взаимодействие с ФОП происходит в две стадии. На первой стадии за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий образуется комплекс типа Михаэлиса, на второй — возникает ковалетная связь ингибитора с серином в эстеразном центре фермента. Комплекс ингибитор-фермент на первой стадии легко распадается, в то время как на второй - становится более прочным. Его прочность в значительной мере определяет длительность эффекта фосфорорганических соединений. Переход обратимого ингибирования к необратимому происходит постепенно и зависит от температуры, строения и концентрации ингибитора (Е.А. Лужников, 1999; Е.Е. Ермолаева и др., 2008).
Фосфорилирующая способность ФОП зависит от прочности эфирной связи фосфора с кислотным остатком и от дефицита электронов вокруг атома фосфора. Важное значение имеют стерические факторы и гидрофобные взаимодействия. Гидролиз фосфолирированной холинэстеразы происходит очень медленно (Д.Д. Полоз, 1961; В.И. Розенград, О.Е. Шерстобитов, 1978; Л.А. Гущин, 1996; В.И. Салоцкий и др., 2003).
Поскольку реакция ФОП с холинэстеразой в конечном итоге сводится к фосфолирированию гидроксила серина, естественно, что многие из них способны реагировать с другими ферментами относящимися к гидролазам, в частности с трипсином, хемотрипсином, печеночной эстеразой, с ферментами, участвующими в метаболизме фосфорной кислоты: фосфороглюкомутазой, фосфорилазой А, алиэстеразой, сукциндегидрогеназой, цитохромоксидазой, ацетилхолинтрансферазой, фосфодиэстеразой, фосфолипазой С. Помимо этого известно, что ФОП обладают способностью ингибировать не только холинэстеразу, но и другие эстеразы, характеризующиеся широкой субстратной специфичностью (Н.М. Гусейнова, 1991; D. Davies, 1983; Е. Mutch, 2006).
В связи с тем, что холинэстераза и холинорецептор имеют в своем строении много общего, в механизме действия антихолинэстеразных соединений определенное значение имеет их взаимодействие не только с ферментом, но и с холинорецептором. При этом некоторые ФОП могут проявлять как возбуждающее, так и блокирующее действие на холинорецепторы (С.Н. Голиков, 1961; Н.М. Гусейнова, 1991; И.В. Маркова и др., 1999).
Как известно, ФОП, обладая высокой липофильностью, подвергаются активному окислению, в процессе которого инициируют образование свободных радикалов, что ведет к резкому нарастанию перекисного окисления липидов (С.Н. Голиков и др., 1986; В.А. Мышкин и др., 2003; Д.В. Срубилин и др., 2005).
Результатом этого процесса является увеличение проницаемости и изменение физического состояния мембран клеток, сопровождающееся массовым вхождением и выхождением ионов кальция, что может стать причиной их гибели. Опасность представляет и активация окисления липидов митохондрий, поскольку при этом нарушается энергетическая функция с возникновением тканевой гипоксии (Н.Р. Багданов, М.Г. Мигранов, 1996; Э.Р. Нагиев, М.М. Газимагомедова, 2003).
Экспериментальные исследования показывают, что ФОП, которые проникают через центральную нервную систему, могут вызывать непосредственное угнетение дыхательного центра. Иногда угнетению дыхания предшествует фаза возбуждения. Ее наличие может быть связано как с непосредственным действием ФОП на дыхательный центр, так и с возбуждением холинорецепторов каротидного клубочка. Наряду с прямым и рефлекторным влиянием ФОП на дыхательный центр важная роль в происхождении расстройств дыхания принадлежит бронхоспазму. Бронхоспазм приводит к нарушению легочной вентиляции, затрудняет дыхание и играет важную патогенетическую роль в развитии интоксикации. Третьим значимым патогенетическим механизмом нарушения дыхания является паралич дыхательной мускулатуры. Он возникает в связи с постепенным ухудшением нервно-мышечной проводимости (В.А. Закордонец, 1967; Ю.С. Каган, 1977; Е.В. Гембицкий и др., 1978; С.Н. Голиков, 1986; С.А. Куценко, 2004).
Действие ФОП на сердечно-сосудистую систему проявляется изменением сердечной деятельности и артериального давления. В основе этих влияний лежит взаимодействие ФОП с холинореактивными системами. Изменение сердечной деятельности в эксперименте на лабораторных животных и в клинике у больных с отравлением ФОП изучалось методом электрокардиографии. Исследованиями Ю.С. Кагана (1977) установлено, что ФОП вызывают замедление сердечной деятельности и увеличение высоты зубца R. Эти изменения обнаруживались сравнительно рано, еще до появления видимой интоксикации и свидетельствовали о повышении тонуса блуждающего нерва. При введении токсических и смертельных доз ФОП отмечались удлинение интервалов P-Q и Q, замедление ритма сердечной деятельности, увеличение высоты зубцов Р и R, замедление ритма было сильно выражено в агональном периоде (Ю.С. Каган, 1981; М.Я. Тремасов, А.Н.
Применение культур клеток в токсикологических исследованиях
При широком применении пестицидов в сельском хозяйстве необходима ускоренная токсикологическая оценка этих химических соединений с помощью тестов, позволяющих быстро выявить специфику действия их на организм животных." Использование культуральных моделей позволяет сократить сроки биологических испытаний и оценить степень риска отдаленных последствий различных ксенобиотиков (Т.В. Бойко, 1999; СИ. Успенская и др., 1999; О.Б. Серегина, Н.Б. Леонидов, 2000; A. Warshavsky et al, 2001; J. Kialy et al, 2008).
Во второй половине восьмидесятых годов прошлого столетия в токсикологии начали широко применяться системы клеточных культур, и именно в этот период были определены теоретические и практические границы «токсикологии in vitro» в качестве научной дисциплины (Л.В. Коломбет и др., 2008).
Токсикологические исследования с использованием культур клеток условно могут быть разделены на три группы: экспресс тесты по оценке жизнеспособности, долговременные тесты на выживаемость и промежуточные исследования, где для оценки жизнеспособности используются такие показатели, как пролиферативная способность клетки или параметры метаболизма (Е. Kuchowwicz, К. Rudsinski, 1999).
Так, культуры клеток используют при определении степени токсичности химических соединений до экспериментов на животных. Для выяснения механизмов взаимодействия ксенобиотиков разной природы с клеткой и ее отдаленными структурами, для изучения мутагенного действия химических веществ, оценке токсичности химиотерапевтических противовирусных средств, а также токсичности препаратов микробиологического синтеза (В.А. Фрадкин,. 1995; Г.П. Червонская и др., 1998; Л.А. Дуева, А.В. Карамышева, 2001; Г.Т. Айдинов и др., 2008; А.А. Алтаева и др., 2008).
" В настоящее время широко признается, что в основе комплекса ответных реакций клеток, имеющих защитный характер и обеспечивающих адаптацию к меняющимся условиям в ответ на воздействие различных неблагоприятных факторов, в том числе и токсических агентов, лежат единые механизмы, приводящие к сходным изменениям на морфологическом и молекулярном уровнях (М.Ю. Еропкин и др., 1997; J. Yang et al, 1996).
Культуры клеток представляют собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях. Исследователь может изменять эти условия в определенных пределах, что позволяет ему оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов -рН, температура, концентрация аминокислот, витаминов и др. Эти реальные преимущества по сравнению с исследованиями на целых животных ставят клеточные культуры как экспериментальную модель в один ряд с культурами микророганизмов (Z. Yu et al, 1997; V. Rodiella et al, 1997; A. Warshavsky et al, 2001; J. Blasiak et al, 2002; R. Macnair et al, 2007).
Поскольку клетки в культурах легкодоступны для различных манипуляций, то при работе с ними токсины, гормоны, биостимуляторы и т.д. могут быть введены в заданной концентрации и в течение конкретного периода времени. Количество этих соединений может быть на порядок меньше, чем при эксперименте на животном. Исчезает опасность того, что исследуемое соединение метабилизируется печенью, кумулируется мышцами и экскретируется почками. При использовании клеточных культур, как правило бывает, нетрудно установить, что при такой-то концентрации добавленное в культуру вещество находиться в контакте с клетками в течение данного периода времени (Л.П. Михайлов и др., 2002).
Известно, что клетки, переведенные в условия существования in vitro, теряют органные и тканевые взаимосвязи, лишаются компенсаторных и дезинтоксикационных возможностей. Вполне естественно, поэтому, ожидать, что они окажутся более чувствительны к действию химических агентов, чем целостный организм животного и человека (А.Ф. Василос и др., 1982).
Проявления токсического эффекта многообразны, происходят они по крайней мере на трех уровнях: органно-тканевом, клеточном и субклеточном. Наиболее типичные формы токсического действия можно прогнозировать в культурах клеток разного вида и происхождения. К ним относятся летальные, сублетальные и скрытые повреждения клеток, выражающееся в торможении роста, их адгезивной способности, угнетения синтеза РНК, ДНК, ферментативной активности. Проявляется оценка токсичности с помощью культур клеток, роговицы глаза в качестве скрининг-теста.
Нет ни одного вида животных или токсикологических групп, которые могли бы быть идеально пригодными для прогноза отдаленных последствий в результате воздействия на организм человека вероятных токсических факторов. Вместе с тем, эксперименты на животных необходимы для развития медико-билогических наук, поскольку позволяют лучше понимать законы и механизмы жизненных процессов, происходящих на уровне целого организма (Г.П. Червонская и др., 1998; С. Clemendson et al, 2002).
Клеточные культуры животных и человека позволяют по целому ряду причин более эффективно - быстрее, гуманнее, дешевле, технически проще и т.д., определять воздействие химических веществ. Главное преимущество культивируемых клеток, которое полностью используется клеточными биологами, это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа. Существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются здоровые клетки и то, что они сохраняют жизнеспособность в течение всего эксперимента (Л.В. Колонбет и др., 2008; В. Annex, 1995; В. Blaauboer, 1996; В. Chlopkicz, 2001).
Тем не менее, при проведении токсикологических исследований необходимо учитывать, что только комплексное использование методов in vitro и in vivo позволяет наиболее полно оценивать степень опасности исследуемых веществ.
Изучение воздействия карбофоса на перевиваемые культуры клетокМБВК и ВНК-21/13-02
Исследование защитной эффективности антидотной рецептуры АЛ-7 при отравлении хлорофосом изучалось на кроликах обоего пола массой 2,5 -3 кг. Животные были разделены на 3 группы по принципу аналогов, по 6 голов в каждой.
Первая группа служила контролем. Этим животным вводили хлорофос перрорально в дозе 525 мг/кг, которая является среднесмертельной дозой для данного вида животных. Второй группе вводили вышеуказанный препарат в тех же дозах, но при развитии характерных клинических признаков (саливация, атаксия, бронхоспазм) внутримышечно вводили антидот АЛ-7.
Клинические признаки интоксикации проявлялись у контрольных животных в виде угнетения через 5-10 мин с момента введения яда, через 15-27 мин отмечались легкие хрипы, тремор, бронхоспазм, а спустя 43-45 мин у кроликов наблюдали усиление хрипов, обильное истечение из носовой и ротовой полости, развивались клонические и колонико-тонические судороги. Через 70-140 мин пали 3 контрольных кролика.
Животным второй группы внутримышечно вводили водный раствор антидота при проявлении таких клинических признаков как атаксия, бронхоспазм и судороги. Через 8-12 мин с момента введения антидота происходило улучшение дыхания, прекращались судороги. Через 20-25 мин животные начинали передвигаться по клетке, реагировать на внешние раздражители, однако нужно отметить, что у животных продолжался отказ от корма и воды на протяжении 6-8 часов.
Состояние кроликов 3-й группы, т.е. биологического контроля в течении всего периода проведения эксперимента было удовлетворительным. Они хорошо поедали корм и воду, адекватно реагировали на внешние раздражители.
С целью изучения динамики показателей крови кроликов проводились гематологические и биохимические исследования. Кровь брали до начала опыта (фоновый показатель), а так же на 3, 7, 10, 15, 20, 25, 30 сутки после отравления хлорофосом и лечения антидотной рецептурой АЛ-7. В ходе экспериментов были изучены следующие гематологические показатели: содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, скорость оседания эритроцитов, а так же лейкоформула и биохимические показатели: содержание общего белка, белковых фракций, содержание глюкозы, активность ферментов ацетилхолинэстеразы, аланинаминотрансферазы, аспартататаминотрансферазы, щелочной фосфатазы. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 24-31.
По данным таблицы 24можно отметить, что у кроликов, подвергнутых пероральной затравке хлорофосом без лечения на 3-й и 7-й сут происходило снижение содержания эритроцитов в среднем на 2,3%, на 10-и сут исследования данный показатель был ниже фонового показателя на 8,6%, на 20-и сут на 4,9%, на 30 сут отмечалось снижение количества эритроцитов на 2,1%. Количество лейкоцитов в крови на 3-й сут снизилось на 24,5%, на 10-е - на 35,8%), на 20-е сут исследований - на 29,6% , на 25-е сут - на 12,8%, к 30-м сут этот показатель был ниже на 15,7%. Содержание гемоглобина в крови на 3-й сутки снизилось на 8,7% , на 7 сут снижение произошло на 9,4%, на 20-е сут происходило восстановления показателя до уровня фона. СОЭ достоверно не изменялась на протяжении всего периода эксперимента. Из представленной ниже лейкоцитарной формулы (таблица 25), следует увеличение количества сегментоядерных нейтрофилов на 3-й сутки на 22,3% с последующим снижением и к 15-м сут данный показатель достигал 18,6%, на 30-е сут произошло увеличение на 5,8%. При изучение содержания палочкоядерных нейтрофилов на 3-й и 7-е сут исследования отмечено резкое увеличение их числа на 71,2% и 68,9% , на 10-е сут увеличение составило на 84,6%, к 30-м сут данный показатель был выше фонового на 28,7%. Содержание количества эозинофилов находилось на уровне фона. На 25-е сутки количество моноцитов соответствовало исходным значениям. На 3 сут исследования было отмечено снижение количества лимфоцитов на 27,5%, на 10-и и 15-и сут показатель уменьшился на 22,9%) и 19,8%, соответственно. К концу эксперимента содержание лимфоцитов соответствовало уровню фона.
Определение острой токсичности новых холинолитиков
Стремительное развитие химической, фармацевтической промышленности, интенсивная химизация сельского хозяйства, использование большого ассортимента химических средств в быту создают угрозу глобального загрязнения внешней среды химическими веществами, среди которых встречаются соединения, представляющие как потенциальную, так и реальную опасность (П.Г. Жминько, 1991; R. Repetto, S. Baliga, 1996).
Большую часть химических соединений, которые попадают во внешнюю среду и оказывают неблагоприятное воздействие на организм, составляют фосфорорганические пестициды, широко используемые во всем мире для защиты растений от вредителей, болезней и сорняков (В.Г. Артоманова, Н.Н. Шаталов, 1996).
Важным свойством ФОП является их малая стойкость, связанная со способностью быстро, в течение нескольких суток гидролизоваться в щелочной среде при воздействии высокой температуры. Однако в кислых почвах или при наличии слабокислой среды в растениях и животных тканях некоторые ФОП могут сохраняться более длительное время (Н.В. Кокшарева, 1977; А.Е. Лужников, 1999; С.А. Куценко, 2004; J. Kialy, 2008).
В основе биохимического действия ФОП лежит угнетение биологической активности холинэстераз, приводящее к замедлению ферментативного гидролиза ацетилхолина, медиатора нервных импульсов, накоплению его в холинергических синапсах, в результате чего в области всех холинергических нервных окончаниях и ганглиях (холиномиметичесое действие) наступает эффект, подобный возбуждению (Ю.С. Каган, 1977; И.С. Баженов, 2006; Malich G., 1998).
Принятие профилактических мероприятий при использовании пестицидов в сельском хозяйстве не может исключить отсутствие случаев отравления данными веществами и на сегодняшний день продолжают регистрироваться отравления полезных насекомых, животных и людей ФОП.
Исходя из этого, дальнейший поиск и внедрение в практику работы лечебных учреждений новых фармакологических препаратов и методов эффективной терапии являются важной проблемой, стоящей перед современной наукой и практикой (А.В. Иванов, 2009; К.Х. Папуниди, 2009).
Классическим приемом определения токсичности веществ является использование теплокровных животных. Однако, проблема адекватности традиционной схемы доклинических исследований, длительность и высокая стоимость токсикологических тестов, а также этические вопросы использования животных в таких исследованиях делает весьма актуальной задачу поиска альтернативных моделей в токсикологии, в частности, замену высших животных на беспозвоночных, применение клеточных и молекулярных моделей (Л.В. Коломбет и др., 2008; В. Chlopkicz, 2001; S. Coeke, 2006).
В Европе оценка токсичности препаратов in vitro активно используется во многих сферах биотехнологии наравне с клиническими испытаниями. Интеграция России в европейские экономические структуры, в частности, предполагаемое вступление ее в ВТО потребует принятия аналогичных европейским законодательных актов, ограничивающих использование животных для токсикологических испытаний (А.П. Еськов и др., 2003).
Альтернативные методы, несмотря на трудности и нерешенные проблемы, уже широко признаны и применяются во все возрастающих масштабах. Необходимость в повышении скорости и качества токсикологических экспериментов в перспективе неминуемо приведет к сокращению использования лабораторных животных (М.Ю. Еропкин, Е.М. Еропкина, 2003; А.П. Еськов и др., 2008; R. Macnair et al., 2007).
В представленной работе показана перспективность альтернативных методов скрининга потенциальных антидотов с использованием культур клеток классическим тестам на экспериментальных животных в токсико-фармакологических исследованиях. Они позволяют значительно уменьшить расход биологического материала и сократить сроки исследования, а также предоставляют возможность установления характера биологической активности на клеточном уровне (А.С. Лукьянов и др., 1999; И.А. Калашников и др., 2008).
Основными мотивами для решения этой проблемы являются как этические соображения об исключении экспериментов на животных, так и экономические в целях снижения материальных затрат на оценку безопасности потенциальных лекарственных средств. В тоже время, обнаружение эффектов изученных веществ на культурах клеток является не достаточным и предполагает обязательные завершающие исследования на теплокровных животных по традиционной схеме.
Все вышесказанное подтверждает, что рассматриваемая в работе проблема является актуальной, это и определило цель диссертации.
В исследованиях по поиску антидота целесообразным явился скрининг холинолитиков, полученных в лаборатории химического синтеза ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», а также создание и изучение эффективности вновь созданного антидота АЛ-7.
Изучение влияния ФОГТ, в частности действие хлорофоса и карбофоса, а также первоначальный скрининг веществ, обладающих потенциально антидотными свойствами, проводился на перевиваемых культурах клеток MDBK и ВНК-21/13-02.
Определение острой токсичности новых холинолитиков исследовалось на белых мышах. Разработка антидотной рецептуры проводилась на белых крысах, терапевтические свойства разработанной антидотной рецептуры АЛ-7 изучалась на белых крысах и кроликах.
Похожие диссертации на Разработка средств лечения при отравлении животных фосфорорганическими пестицидами
