Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений
2. Введение 4
3. Обзор литературы
3.1 ПАВ: получение, применение, биодеградация в окружающей среде 6
3.2 Полиароматические углеводороды 9
3.3 Методы определения НФ, ЛАС и ПАУ 17
3.4 Иммунохимические методы анализа 20
3.5 Получение иммунореагентов к низкомолекулярным веществам 31
3.6 Определение констант аффинности антител 37
3.7 Применение ПФИА для анализа объектов окружающей среды 40
4. Материалы и методы исследования 43
4.1 Материалы и оборудование 43
4.2 Синтез имм ногенов 44
4.3 Синтез трейсеров (конъюгатов с флуоресцеином) 45
4.4 Методика проведения ПФИА 50
4.5 Определение аналитических характеристик ПФИА 51
4.6 Методика проведения микропроточного иммуноферментного
анализа с хемилюминесцентной (ХЛ) детекцией (микрочипы) 52
5. Обсуждение результатов 53
5.1 Микропроточный иммуноферментный анализ на атразин с хемилюминисцентной детекцией 53
5.2 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на ацетохлор 55
5.3 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на нонилфенол 57
5.4 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на линейные алкилбензолсульфонаты 64
5.5 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на полиароматические углеводороды 70
6. Выводы 82
7. Литература
- Полиароматические углеводороды
- Получение иммунореагентов к низкомолекулярным веществам
- Синтез трейсеров (конъюгатов с флуоресцеином)
- Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на нонилфенол
Введение к работе
Актуальность темы, С каждым годом все более остро встает проблема загрязнения природных объектов и продуктов питания токсичными веществами. В число таких загрязнителей входят пестициды, поверхностно активные вещества (ПАВ) и полиароматические углеводороды (ПАУ).
Хлорсодержащие пестициды широко применяются в сельском хозяйстве и являются распространенными загрязнителями природных вод и почв. Наиболее используемыми в промышленности, в том числе при производстве детергентов, являются представители анионных ПАВ линейные алкилбепзолсульфонаты (ЛАС) и широко распространенная группа неионных ПАВ - нонилфенолполиэтоксилаты, которые в процессе биодеградации образуют стабильный продукт нонилфенол (НФ). ПАВ обладают эстрогенной активностью и значительно изменяют гормональный фон живых существ. ПАУ образуются в результате деятельности химической, металлургической, целлюлозно-бумажной промышленности. Этот класс органических соединений объединяет десятки веществ, для которых характерно наличие в химической структуре двух и более конденсированных бензольных колец. ПАУ представляют особую опасность, поскольку все эти соединения крайне устойчивы, многие из них являются токсичными, канцерогенными и мутагенными. ПАУ редко содержатся в пробах как индивидуальные соединения, чаще всего они представлены как сложная смесь, что делает затруднительным их детальный анализ.
В настоящее время для определения вышеперечисленных групп веществ широко применяют в основном традиционные физико-химические методы анализа. Однако эти методы при высокой чувствительности и точности являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа, основанные на уникальном специфическом взаимодействии аитиген-антитело. К наиболее экспрессным и простым в исполнении иммунохимическим методам относится поляризационно-флуоресцентный иммуноаналш (ПФИА), поэтому в рамках данной работы особое внимание уделялось разработке методик ПФИА.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей взаимодействия антител с антигенами и разработка иммунохимических методов анализа ряда ароматических соединений, являющихся загрязнителями окружающей среды. Основная часть работы посвящена ПФИА на пестициды, ПАВ и ПАУ.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
осуществить синтез иммунохимических реагентов - конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных пестицидов, ПАВ и ПАУ;
изучить влияние структуры иммуногенов на основные характеристики разработанных методов;
исследовать влияние различных факторов на результаты анализа и выбрать оптимальные условия определения пестицидов, ПАВ и ПАУ методами ПФИА и микропроточного иммуноферментного анализа;
- определить аналитические характеристики разработанных методик и охарактеризовать их использование для определения загрязнителей в реальных объектах.
Научная новизна. Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных ацетохлора, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ с флуоресцешюм (трейсеры). Впервые получены различные по структуре и составу конъюгаты производных НФ с белками, использованные для наработки антисывороток. Протестированы поликлональные и моноклональные антитела против этих и родственных соединений методом ПФИА. Исследовано влияние длины и разветвленности углеводородной ножки в структуре трейсера и иммуногена на характеристики иммуноанализа. В результате оптимизации структуры иммунореагентов впервые разработаны методики ПФИА на ацетохлор, ЛАС, НФ и ПАУ. Разработаны методики определения атразина, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ в водных образцах.
Практическая значимость работы. На основе полученных иммунореагентов и проведенных исследований впервые созданы методики для экспрессного определения ахетохлора, ЛАС, НФ и ПАУ методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, а также атразина методом микропроточного иммуноферментного анализа. Показано, что данные методы могут быть использованы для количественного определения пестицидов, ПАВ и ПАУ в водных образцах различного происхождения.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Международная конференция студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (Москва, Россия, 2000); Международное научное совещание "Применение биосенсоров в мониторинге окружающей среды" (Иркутск, Россия, 2000); Eighth Symposium on The Chemistry and Fate of Modern Pesticides (Copenhagen, Denmark, 2001); Fifth International Conference on Agri-Food Antibodies (Prague, Czech Republic, 2001); Fifth International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems (Monterey, USA, 2001); SETAC Conference "Organic Soil Contaminants" (Copenhagen, Denmark, 2001); Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксиколопи - современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, Россия, 2006).
В 2002 году автор стал лауреатом конкурса «Грант Москвы» в области наук и технологий в сфере образования.
Результаты, полученные в ходе работы, были применены при выполнении государственного контракта 02.434.11.7123 (заказчик - Федеральное агентство по науке и инновациям).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 5 статей в ведущих международных и российских журналах, 5 тезисов сообщений на научных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 112 ссылок. Работа изложена на 94 страницах, содержит 35 рисунков и 21 таблицу.
Полиароматические углеводороды
Алкилбензолсульфонаты находят практическое применение чаще всего в качестве детергентов. Поскольку сульфогруппа обладает ярко выраженными кислотными свойствами, то используют натриевые соли алкилбензолсульфонатов. Нейтральная органическая часть молекулы соли растворяется в жировых веществах, а её ионный конец - в воде. Поэтому соли таких сульфокислот обеспечивают растворение масел в воде. Моющее действие детергентов основано на том же принципе, что и действие мыла. Они как бы обволакивают частицу жира, образуя мицеллу.
Основное практическое преимущество ЛАС над обычным мылом (натриевой солью карбоновой кислоты) заключается в неодинаковой растворимости их различных солей. Магниевые и кальциевые соли мыла практически нерастворимы в воде. В так называемой "жёсткой воде" имеется достаточное количество обоих катионов, поэтому при использовании мыла в "жёсткой воде"? его магниевые и кальциевые соли выпадают в осадок. Это ограничивает использование для стирки некоторых сортов мыла. Вдобавок от выпавших солей на стираемых предметах образуется плёнка. ЛАС не обладают этими недостатками и успешно заменяют мыло при мытье и стирке.
Детергенты должны легко подвергаться биологическому разложению под действием микроорганизмов при попадании в окружающую среду. Вот почему при производстве детергентов пришлось отказаться от применения сильно разветвлённых алкильных групп, связанных с бензолсульфонатом, в пользу алкильных групп, не содержащих четвертичных атомов углерода. Иначе бактериям будет трудно разлагать («поедать») алкильные группы, в которых атомы углерода не соединены с водородными атомами [11]. Структуры алкилбензолсульфонатов представлены на рис. 1.
Алкилбензолсульфонаты: а - разветвлённый (не разлагается микроорганизмами), б -линейный (разлагается микроорганизмами) 3.1.2 Неионные ПАВ и их продукты биодеградации
Представителями одного из двух самых крупных классов неионных ПАВ -алкилфеиолполиэтоксилатов (АФПЭ) - являются нонилфенолполиэтоксилаты (НФПЭ). АФПЭ считаются вторым по распространённости классом (после алкоголь полиэтоксилатов) среди используемых в настоящее время неионных ПАВ. За год в мире выпускается порядка 300,000 тонн АФПЭ. АФПЭ широко используются при производстве чистящих средств, в бумажной промышленности как дисперсионные агенты, в текстильной промышленности и для очистки металлических поверхностей.
Поверхностную активность НФПЭ обуславливает их химическое строение, а именно наличие гидрофобной и гидрофильной части. Они способны концентрироваться на границах раздела несмешивающихся фаз, таких как воздух -вода, масло - вода, твёрдые вещества (например, биологические мембраны) - вода. Эти свойства делают возможным применение НФПЭ в качестве моющих, дезинфицирующих и эмульгирующих средств.
Исходным веществом при синтезе НФПЭ является фенол, который алкилируется смесью нониловых изомеров в кислой среде до нонилфенола (НФ). Этоксилирование НФ проводится под действием этанольного раствора КОН в присутствии оксида этилена. В результате получается смесь олигомерных гомологов с разной длиной полиэтоксилатной цепи [12].
Стабильным продуктом биодеградации НФПЭ является НФ. Структуры НФ и НФПЭ приведены на рис. 2. [ОСН2СН2]п
Липофильная природа НФ и других метаболитов НФПЭ с более короткой этоксилатной цепочкой означает, что эти вещества способны накапливаться в тканях. Живые организмы способны аккумулировать НФ, нонилфенол моноэтоксилат (НФ1Э) и нонилфенол диэтоксилат (НФ2Э) напрямую из воды и пищи. АФПЭ и НФПЭ способны только частично биодеградировать в природе, тогда как их метаболиты (в том числе и НФ) очень устойчивы к действию бактерий, являясь таким образом более токсичными благодаря хроническому воздействию. Токсичность НФПЭ повышается с уменьшением длины этоксилатной цепи и увеличением длины гидрофобной цепи, таким образом, токсичность исходного ПАВ всегда меньше, чем его продуктов деградации (НФ, НФ1Э, НФ2Э). Для живых организмов предельно допустимые концентрации НФ варьируются от 0,18 до 5,0 мг/л в зависимости от условий. Для сравнения, токсичность НФ10Э проявляется при концентрации выше 5,0 - 11,0 мг/л. Кроме того, НФ обладает эстрогенной активностью, проявляющейся в феминизации популяций и расстройстве репродуктивных свойств особей мужского пола. Таким образом, НФ губительно действует на обитателей природных водоёмов (например, лососевых рыб, трески, креветок).
В последнее время возрастает беспокойство по поводу острой токсичности и эстрогенности НФПЭ, что заставило многие европейские страны сократить (Германия) или даже вообще запретить (Италия и Швейцария) использование НФПЭ [12].
Получение иммунореагентов к низкомолекулярным веществам
Вместе с другими продуктами сгорания нефтепродуктов, угля, дерева, мусора, пищи, табака ПАУ поступают в воздух, там они могут быть в виде молекул в паровой фазе или адсорбироваться к частицам аэрозоля. Меньшие и легкие соединения этого класса от двух до четырех ароматических колец имеют достаточную упругость пара, что позволяет им находиться в паровой фазе, а ПАУ с высокими молекулярными массами главным образом существуют адсорбированными к другим частицам в атмосфере. При комнатной температуре все ПАУ - твердые кристаллические вещества. Температуры их плавления близки к 200С, а давление насыщенных паров очень мало. При охлаждении горячих газов, содержащих ПАУ, вещества эти должны конденсироваться и оседать в зоне их выбросов. На расстоянии нескольких километров от угольной ТЭС поверхность почвы загрязнена ПАУ. Но большая часть их уносится на дальние расстояния в виде аэрозолей. Прекрасным адсорбентом для ПАУ являются сажевые частицы. На 1 см2 сажевой поверхности могут разместиться 1014 молекул ПАУ. Это и приводит к тому, что загрязненный сажевым аэрозолем воздух городов содержит порой количества ПАУ большие, чем соответствующие давлению насыщенного пара этих веществ [14].
Вклад курильщиков в общее количество производящегося бенз(а)пирена невелик - 0,05 т/год. Но ошибочное мнение о малозначимости этого количества сменяется на противоположное при рассмотрении этих данных как о локальных концентрациях бенз(а)пирена. Некоторым утешением для некурящих служит то, что выпускаемый курильщиком табачный дым менее вреден, чем ими вдыхаемый. Аэрозольные частицы табачного дыма с адсорбированными на них молекулами бенз(а)пирена имеют различные размеры. Для организма особенно опасны частицы с размером 0,5-5 мкм. Частицы большего размера задерживаются на слизистых поверхностях курильщика, а частицы меньшего размера не задерживаются в легких. Таким образом, выдыхаемый курильщиком воздух частично отфильтрован от наиболее вредных дымовых частиц. Корреляция риска заболевания раком легких с годами курения очевидна.
Высокие концентрации ПАУ можно найти около индустриальных областей, а также и в областях с высокой плотностью грузового транспорта. Концентрация различных соединений ПАУ в воздухе может изменяться в пределах 0.1-100 нг/м3 [13,15,16]. ПАУ вводе Концентрация ПАУ в воде варьируется в зависимости от типа водного источника: поверхностные воды, грунтовые воды и питьевая вода. Поверхностная вода, например, речная вода и прибрежная вода может быть сильно загрязнена ПАУ промышленностью или верфями. Масло и нефтепродукты могут загрязнять эти воды случайно, из-за недосточных мер предосторожности или в результате сброса производственных отходов [17]. В дополнение к прямому загрязнению ПАУ имеется постоянный вклад к уровням ПАУ в поверхностной воде множеством различных источников. Корабли часто обрабатываются битумом, чтобы предотвратить коррозию, и гавани или речные насыпи могут обрабатываться с креозотом. Эти противокоррозионные покрытия и агенты пропитки постоянно выщелачивают ПАУ в воду.
ПАУ соединения могут также быть найдены в грунтовых водах, но обычно в очень низких концентрациях. ПАУ являются липофильными молекулами и имеют плоскую структуру благодаря их ароматическому характеру. Следовательно, они имеют отчетливую тенденцию адсорбироваться к многим липофильным поверхностям, типа органических веществ в почве, помимл этого они также плохо водорастворимы. Эти свойства объясняют отсутствие высоких уровней ПАУ в грунтовых водах незагрязненных мест. ПАУ концентрации в грунтовых водах незагрязненных мест варьируется вокруг 0-5 нг/мл. При тяжело загрязненных местах, однако, уровни могут достигать до 10 мкг/мл [18,19].
Из-за канцерогенного характера некоторых ПАУ уровни легирования в питьевой воде должны быть настолько низки насколько это возможно. Основной источник ПАУ в питьевой воде - часто не вода, поданная в распределительную систему, а распределительная система непосредственно. Особенно в старых распределительных системах, битум - обычно используемое защитное покрытие против коррозии на водопроводных трубах. Это делает текущий контроль качества воды очень трудным. Даже, когда водные источники постоянно контролируются, вода, достигающая потребителя, может быть загрязнена ПАУ соединениями. Регулярно находятся высокие уровни флуорантена, фенантрена и антрацена. Эти соединения находятся в рубероиде и имеют более высокую растворимость в воде, чем более тяжелые соединения ПАУ. Высокие уровни легирования этих лучше растворимых соединений ПАУ допускают более раннее детектирование в случае полного увеличения уровней всех ПАУ. Они, следовательно, могут быть хорошими индикаторами для качества питьевой воды.
Уровни ПАУ в питьевой воде значительно варьируют от 1 нг/л до 11 мкг/л. По нормам Всемирной организации здравоохранения допустимый предел суммарного содержания ароматических веществ в питьевой воде - 200 нг/л. Но основную часть этих соединений составляет малотоксичный (по сравнению с бенз(а)пиреном и другими ПАУ) бензол. Предельное же содержание бенз(а)пирена в питьевой воде - 2,0 нг/л.
Синтез трейсеров (конъюгатов с флуоресцеином)
Для получения специфичной антисыворотки очень важно правильно подобрать структуру гаптена для синтеза иммуногена так, чтоб получить высоко аффинные по отношению к антигену антитела. Идеальный гаптен должен с одной стороны максимально соответствовать по структуре определяемому веществу, а с другой - содержать функциональную группу, позволяющую осуществить «пришивку» к белку. Для получения идеального гаптена существует несколько возможных подходов. Обычно гаптен содержит ножку, с помощью которой его «пришивают» к белку-носителю. Это необходимо для предотвращения экранирования антигена белковой молекулой. Ножка не должна содержать активных групп, влияющих на химическую природу гаптена, иначе полученная антисыворотка будет содержать белки, специфичные к ножке. Наличие в ножке гетероатомов, электронодонорных или электроноакцепторных групп может изменять электронное распределение в молекуле определяемого вещества, тем самым препятствуя его распознаванию [80]. Такой случай описан в работе [81], где обсуждается дизайн иммуногена для получения антител против парацетамола. В качестве гаптена изначально был взят парацетамолгемисукцинид (ПГС), «пришитый» к белку-носителю. парацетамол ПГС
Антитела, полученные против такого конъюгата, обладали очень низкой аффинностью по отношению к парацетамолу, зато хорошо связывались с ПГС. Это свидетельствует о том, что в данном случае антитела главным образом распознают ножку между гаптеном и белком-носителем. Кроме того, при использовании гемисукцинидного метода «пришивки» теряется одна из трёх антигенных детерминант парацетамола - гидроксильная группа. Когда гидроксильная группа в иммуногене остаётся свободной (п-аминофенолгемисукцинид), антитела хорошо распознают парацетамол. Таким образом, от способа «пришивки» гаптепа зависит специфичность антител. Кроме того, из литературы [80-83] известно, что на свойства анитисыворотки влияет не только структура, но длина углеводородной ножки между гаптеном и белком-носителем. Ножка не должна быть ни слишком длинной, ни слишком короткой. В случае короткой ножки молекула гаптена экранируется белком, а слишком длинная ножка приводит к большой подвижности гаптена, тем самым уменьшая его воздействие на иммунную систему [80]. В работе [83] для разработки иммуноферментного анализа на дидецилдиметиламмоний хлорида (ДДАХ) "" ДЦАХ было синтезировано три иммуногена с разной длиной углеводородного фрагмента, против которых получены антитела. Наилучшая чувствительность и селективность анализа наблюдалась в случае максимального подобия гаптена определяемому веществу. В статье [82] описана разработка иммуноанализа на 4-нитрофенол. В качестве гаптена была использована 3-[2-гидрокси-5-нитробензол]-тиопропионовая кислота (НОМ). N02 Таким образом, обе антигенные детерминанты остаются доступными, а для сшивки с белком-носителем используется гетеробифункциональный реагент 3-меркаптопропионовая кислота. Такой дизайн иммуногена позволяет реализовать оптимальную длину ножки между антигеном и белком-носителем.
Антитела обладают способностью распознавать не только антиген, но и близкие ему по структуре вещества. Это свойство антител, называемое перекрёстное реагирование, можно использовать в аналитических целях. В работе [84], посвященной иммуноанализу на 2,4-динитрофенол, было показано, что антитела, полученные против иммуногена НОМ, обладали высоким перекрёстным реагированием по отношению к 2,4-динитрофенолу. Благодаря чему удалось, варьируя условия проведения эксперимента, разработать анализ на 2,4-динитрофенол. Таким образом, показана возможность расширения числа определяемых веществ с использованием уже готовых антител.
Подбирая дизайн иммуногена, можно добиться расширения специфичности антител и разработать групповой анализ. Моделируя структуру гаптена, ножки и её электронной конформации, можно получить иммуногены, вызывающие выработку антител с различным перекрёстным реагированием (высоким или низким) с родственным соединениям. Так в работе [85] проводили сравнение свойства антисывороток против 2,4,6-тринитротолула (TNT). Было использовано два иммуногена - в качестве гаптена в первом случае был взят динитротолуол (полученная антисыворотка Асі), а во втором - тринитрофенол (Ас2). Оказалось, что предел обнаружения для обеих антисывороток одинаков, но различие в структуре иммуногена приводит к различной аффинности по отношению к структурно родственным соединениям. Ас2 была селективна только к TNT, тогда как Асі способна распознавать важные родственные соединения при низких концентрациях и может быть использована для разработки группового анализа.
В 1998 году была опубликована работа, в которой предлагается новая концепция для синтеза иммуногена - концепция «уникального размера» [86]. Суть её заключается в том, что молекула гаптена должна содержать заместители, меньшие по размеру, чем у определяемого вещества. Тогда полученные антитела не будут связываться с родственными анализируемому соединению веществами, содержащими большие по размеру заместители. Эту модель авторы статьи использовали для разработки специфичного иммуноанализа на определяемое вещество в присутствии родственных соединений. Им удалось получить антитела против гербицида симазина, которые практически не распознавали атразин и пропазин.
Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ на нонилфенол
Основной характеристикой любого анализа является его предел обнаружения. Как уже описано выше, для ПФИА НФ он составил 4 мг/л. Невысокая чувствительность, конечно, является недостатком метода ПФИА. В данном случае полученная чувствительность попадает в диапазон допустимых концентраций НФ в природных водах (0,18-5 мг/л), а эстрогенная активность НФ проявляется при значительно больших концентрациях. Кроме того, данный метод применим для быстрого анализа природных образцов.
Ещё одна важная характеристика аналитического метода - это его специфичность. В целях выяснения специфичности разработанного метода было исследовано взаимодействие антисывороток с родственными фенольными соединениями и рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования как количественные характеристики специфичности (табл. 10).
Исследование перекрестного реагирования разработанного ПФИА на НФ с родственными соединениями показало возможность применения методики для анализа НФ на фоне фенолов с более коротким углеводородным остатком, тогда как наличие нонилфенолполиэтоксилатов и октилфенолов значительно влияет на анализ (коэффициенты перекрестного реагирования 20%. В случае антисыворотки анти-п-АФ процент перекрёстного реагирования для п-аминофенола равен 111%, что объясняется структурой иммуногена, использованного для получения этой антисыворотки - п-аминофенол-ГА-БСА. Т.е. можно сказать, что для антисыворотки анти-п-АФ п-аминофенол является антигеном, а НФ - перекрёстным реагентом.
Таким образом, были определены характеристики ПФИА на НФ: предел обнаружения метода составил 4 мг/л; изучение специфичности метода показало, что метод обладает достаточной специфичностью для определения НФ в присутствии родственных фенольных соединений.
При разработке любого метода ключевым моментом является его применимость для анализа объектов окружающей среды, которые могут быть загрязнены данным веществом. С целью апробации разработанного метода в образцы речной воды вводили НФ в разных концентрациях, соответствующих линейному диапазону градуировочного графика, после чего проводили тест на открытие методом «введено-найдено». Результаты эксперимента представлены в табл. 11.
На основании полученных данных (тест на открытие для любых концентраций больше 80%) можно утверждать о незначительном влиянии матрикса при определении НФ в речной воде. Недооткрытие НФ разработанным методом можно, вероятно, объяснить наличием в речной воде веществ, мешающих взаимодействию НФ с антителами. Поскольку ПФИА служит для быстрого скрининга природных образцов, его целью является не определение точной концентрации НФ, а выявление загрязненных регионов. Таким образом, полученные результаты теста на открытие вполне пригодны для этих целей. Итоги разработки ПФИА на НФ: Были подобраны иммунореагенты - антисыворотка анти-НФ9 и трейсер НФ9-ЭДФ, наиболее близкий по структуре к иммуногену, - и определены их оптимальные концентрации. Оценены аналитические характеристики метода - предел обнаружения, воспроизводимость, специфичность Показана возможность применения метода для анализа речной воды. При этом не требуется предварительная пробоподготовка и матрикс незначительно влияет на анализ. Таким образом, разработанный метод позволяет быстро оценить содержание НФ в речной воде, время анализа 10 образцов составляет порядка 10 минут.
При разработке ПФИА на ЛАС были синтезированы трейсеры, имеющие разные по длине и структуре углеводородные ножки. Структуры трейсеров представлены на рис. 26. Структуры иммуногенов, использованных для получения антисывороток, представлены на рис 27. Для проверки влияния длины ножки трейсера на его связывание с антисыворотками были построены кривые разведения антисывороток. Связывание одной антисыворотки анти-ЛАС43 с трейсерами, имеющими разную длину и структуру ножки, представлено на рис. 28. Титры антисыворотки для каждого трейсера приведены в табл. 12.
Кривые разведения антисыворотки анти-ЛАС43 с разными трейсерами Как видно из полученных результатов, лучше всего связывается с антисывороткой анти-ЛАС-43 трейсер ЛАС-43-ЭДФ, имеющий среднюю по длине и разветвлённости ножку и по структуре наиболее близкий к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдается ухудшение его связывания с антисывороткой анти-ЛАС-43. Таким образом, наилучшим сочетанием являлось использование трейсера, наиболее подобного по структуре иммуногену.
Для получения градуировочных графиков были использованы концентрации антисывороток, соответствующие 70%-му связыванию с трейсером. В качестве стандарта был использован ЛАС, содержащий смесь п-сульфофенилгексановой кислоты с ЛАС, имеющими разные углеводородные фрагменты. Градуировочные графики для антисыворотки анти-ЛАС-43 и разных трейсеров, представляющие собой зависимость относительной величины Y от концентрации ЛАС, представлены на рис. 29.
