Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Основные данные о метаболизме и биологической роли жирных кислот 14
1.1.1. Строение и номенклатура жирных кислот 14
1.1.2. Основные пути метаболизма ПНЖК со-3 и со-6 семейств 21
1.1.2.1. ПНЖК как энергетический субстрат 21
1.1.2.2. ПНЖК как субстрат перекисного окисления липидов и фактор антиоксидантной защиты организма 23
1.1.2.3. Фосфолипазный путь метаболизма ПНЖК 29
1.1.2.4. Пластическая функция ПНЖК 42
1.1.2.5. Роль ПНЖК в регуляции транскрипции генов
1.1.3. Роль ДЦ ПНЖК у детей первого года жизни 58
1.1.4. Недостаточность ЖК в питании и их пищевые источники 63
1.2. Антиоксидантная система организма: роль алиментарных факторов 66
1.2.1. Основные представления о свободно-радикальном окислении и перекисном окислении липидов 66
1.2.2. Понятие об антиоксидантах и их классификация 71
1.2.3. Роль алиментарных факторов в формировании антиоксидантной системы организма 78
1.2.4. Взаимодействие между антиоксидантами з
1.2.5. Окислительный стресе 92
1.2.6. Механизмы антиоксидантной защиты у детей 94
Глава 2. Материалы и методы исследования 105
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение .
3.1. Оценка возможной роли со-3 пнжк и отдельных антиоксидантов крови в формировании ее суммарной антиоксидантной активности 117
3.2. Изучение уровня антиоксидантной активности, мда и спектра жирных кислот в крови у беременных женщин с преэклампсиеи и с нормально протекающей беременностью 148
3.3. Изучение уровня суммарной аоа, мда и спектра жирных кислот в крови у недоношенных детей 159
3.4. Возрастные особенности аоа у детей 166
3.4.1. Возрастная динамика суммарной АОА сыворотки крови 167
3.4.2. Изучение АОА хроматографических фракций сыворотки крови детей 172
3.5. Изучение аоа и клеточной пролиферации у экспериментальных животных в зависимости от возраста 177
3.6. Изучение спектра лейкотриенов, образуемых лейкоцитами, аоа и пол в крови у детей в норме и при патологии 186
3.6.1. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ у условно здоровых детей 186
3.6.2. Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория 188
3.6.3. Изучение спектра ЛТ, уровня МДА и АОА сыворотки крови у детей с бронхиальной астмой 190
3.6.4. Изучение спектра ЛТ, ПОЛ и АОА крови у детей с ожирением 197
3.7. Изучение спектра жирных кислот мембран клеток крови при воспалительных заболеваниях у детей 199
Заключение 211
Выводы 248
Список литературы
- Строение и номенклатура жирных кислот
- Основные представления о свободно-радикальном окислении и перекисном окислении липидов
- Изучение уровня суммарной аоа, мда и спектра жирных кислот в крови у недоношенных детей
- Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория
Введение к работе
Актуальность проблемы. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), принадлежащие к числу незаменимых факторов питания, служат предметом значительного внимания исследователей как в нашей стране (Левачев М.М., 2002, Тутельян В.А., Погожева А.В., 2000), так и за рубежом (Koletzko B., 1997, 2001, Carlson S., 1997, Calder P., 2001, Uauy R., 2002, 2009). За два последних десятилетия накоплен большой объем научных данных, указывающих на важную роль этих соединений в реализации многочисленных физиологических и биохимических процессов в организме в норме и при патологических состояниях. К их числу относятся: формирование иммунного статуса, воспалительные реакции, регуляция системы гемостаза, поддержание тонуса сосудов и гладкой мускулатуры, процессы роста, когнитивные функции.
Изучены многие стороны метаболических превращений ПНЖК, лежащих в основе указанных процессов. В то же время, ряд путей метаболизма жирных кислот и, особенно, взаимодействие этих путей, в значительной мере определяющее их функциональные эффекты, остаются малоизученными. Это, в частности, относится к участию ПНЖК в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты, образовании различных классов эйкозаноидов и построении и функционировании биомембран. Изучение взаимодействия этих путей представляет особый интерес с точки зрения поиска новых биомаркеров метаболизма ПНЖК у детей и беременных женщин.
Роль ПНЖК в процессах ПОЛ в течение многих лет обоснованно связывалась с их функцией как субстратов ПОЛ (Семенов Н.Н., 1956, Эммануэль Н.М., 1958 , Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972, Тутельян В.А., 2003, 2009, и др.). Вместе с тем, в литературе имеются единичные указания на их возможное антиоксидантное действие (Бурлакова Е.Б., 1975, Dormandy S., 1983, Budovsky, 1996, Храпова Н.В., 1997, Сторожок Н.Б., 2000, Погожева А.В., 2000, King V.R., 2006, Leung, 2006). В связи с этим возникает вопрос о возможной роли длинноцепочечных (ДЦ) ПНЖК в формировании антиоксидантной активности (АОА) крови. С этой точки зрения значительный интерес представляет изучение АОА и химического состава отдельных хроматографических фракций сыворотки крови, в которых возможно присутствуют ДЦ ПНЖК, а также параллельная клинико-биохимическая оценка показателей ПОЛ, АОА и жирнокислотного состава плазмы крови у беременных женщин и недоношенных детей.
Следует подчеркнуть, что роль системы ПОЛ/АОА не может рассматриваться только с позиций патогенетического механизма развития заболеваний. В ряде исследований показана тесная связь между балансом этих систем и процессами клеточной пролиферации и роста (Бурлакова Е.Б., Пальмина Н.П., 1985, Скулачев В.П., 1999, Henry P.D., 2000, Pierce G.N., 2004, 2010). В связи с этим целесообразно проведение исследования возрастной динамики АОА крови у человека и экспериментальных животных, а также изучение возможной связи между АОА крови и показателями клеточной пролиферации в тканях животных.
В многочисленных работах установлены пути образования из ю-6 и ю-3 ПНЖК различных серий одного из видов эйкозаноидов - лейкотриенов (ЛТ) (Lee T.N. et al., 1985, Okamoto M. et al., 2000). Эти исследования ограничены, однако, изучением, преимущественно, ЛТ 4-й серии, тогда как ЛТ 5-й серии остаются изученными недостаточно. При этом изучение образования ЛТ у детей проведено лишь в немногочисленных исследованиях, посвященных оценке продукции ЛТ 4-й серии при некоторых патологических состояниях. В то же время, спектр ЛТ у здоровых детей остается практически неизученным. В связи с этим представляется важным провести детальный анализ всего спектра ЛТ как 4-й, так и 5-й серии у условно здоровых детей, а также у детей с бронхиальной астмой и ожирением. При этом особого внимания заслуживает выявление возможной корреляции между уровнем ПОЛ/АОА и продукцией ЛТ как двух альтернативных путей метаболизма ПНЖК у человека.
Как было уже упомянуто, ПНЖК принимают участие в регуляции процессов воспаления в качестве субстратов ПОЛ и предшественников ЛТ, что сопровождается значительным расходом этих соединений. В то же время, ПНЖК входят в состав фосфолипидов клеточных мембран (КМ) и в значительной мере определяют их структурные и функциональные свойства (Uauy R., 2002, Северин Е.С., 2005). В связи с этим представляется целесообразным изучение возможных изменений спектра жирных кислот (ЖК) КМ у детей при различных видах воспалительных заболеваний, относящихся к числу распространенной патологии детского возраста, характеризующейся тяжелым хроническим течением. При этом представляло интерес сравнить ЖК КМ крови (эритроцитов, лейкоцитов) у детей при двух видах воспаления (аллергическом и альтеративно- экссудативном).
Изучение указанных биохимических показателей (МДА, АОА, ЛТ и ЖК состав крови) представляется важным не только с позиций решения фундаментальных задач биохимии, но и с позиций проблемы расширения спектра биомаркеров как скрининговых показателей различных метаболических процессов в норме и при патологии. В связи с этим представляло интерес изучить возможность использования указанных трех групп показателей в качестве биомаркеров метаболизма ю-3 и ю-6 ПНЖК в организме детей и беременных женщин.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР НИИ питания РАМН в рамках тем №051 «Обоснование оптимального белкового и липидного компонентов рационов питания для детей различных возрастных групп» и № 074 «Разработка системы диагностики, профилактики и лечения ожирения у детей раннего, дошкольного и школьного возраста».
Цель и задачи исследования:
Цель: Изучение роли длинноцепочечных ПНЖК в формировании антиоксидантной системы и соотношения основных путей метаболизма ПНЖК: процессов ПОЛ, участия в построении клеточных мембран и образования лейкотриенов в крови детей и беременных женщин.
Задачи:
-
Изучить роль ю-3 и ю-6 ПНЖК в формировании антиоксидантной системы (АОС) крови у взрослых мужчин и женщин и у детей.
-
Исследовать особенности участия ю-3 и ю-6 ПНЖК в формировании антиоксидантного потенциала у беременных женщин (при физиологически протекающей беременности и преэклампсии (ПЭ)) и у недоношенных детей.
-
Исследовать возрастную динамику АОА крови у детей и экспериментальных животных и оценить возможную роль АОА крови в процессах клеточной пролиферации.
-
Провести параллельное изучение интенсивности ПОЛ, уровня АОА и образования лейкотриенов крови в норме и при патологии (бронхиальной астме, ожирении).
-
Изучить состав жирных кислот клеточных мембран в норме и при воспалительных заболеваниях органов желудочно-кишечного тракта и бронхиальной астме.
Научная новизна исследования
Впервые доказана важная роль высокомолекулярного липопротеинового комплекса, содержащего длинноцепочечные ю-3 и ю-6 ПНЖК, в формировании антиоксидантного (АО) потенциала крови. Установлено, что АОА сыворотки крови максимальна в раннем возрасте у детей и экспериментальных животных и коррелирует со скоростью клеточной пролиферации. Показано, что обогащение рациона беременных женщин с ПЭ ю-3 ПНЖК увеличивает уровень АОА их крови и подавляет ПОЛ, повышенное при ПЭ. Впервые доказано, что соотношение различных видов ЛТ у детей в норме и при патологии меняется при изменении в организме уровня ю-3 ПНЖК. Установлено существование реципрокных отношений между ЛТ различных серий (4-й и 5-й) и различных видов (В, С, Д, Е). Недостаточный уровень в организме детей ю-6 ПНЖК вследствие их сниженного поступления (недоношенные дети) или повышенного расхода на образование провоспалительных эйкозаноидов (бронхиальная астма) сопровождается снижением уровня ПОЛ, а обогащение их рациона ПНЖК приводит к нормализации уровня ПОЛ. На основании параллельного изучения ПОЛ, АОА и образования ЛТ сформулировано положение о реципрокности метаболических превращений ПНЖК. Впервые установлено, что различные виды воспаления - альтеративно-экссудативное и аллергическое, а также состояние недоношенности у детей вызывают сходные изменения в составе различных типов КМ (эритроцитов и лейкоцитов) и в плазме крови, заключающиеся в накоплении в них эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), снижении докозагексаеновой кислоты (ДГК) ю-3 и общего уровня ю-6 ПНЖК. На основании результатов исследования показана возможность использования указанных трех групп показателей (ПОЛ/АОА, лейкотриены, жирнокислотный состав биомембран) в качестве биомаркеров метаболизма ПНЖК.
Научно-практическое значение работы
Выявленный в работе факт взаимодействия трех исследованных путей метаболизма ПНЖК (участие в формировании АОС и регуляции ПОЛ, образование ЛТ и построение биомембран), позволивший сформулировать положение об их реципрокности, открывает новые направления в изучении особенностей биохимической регуляции этих соединений в организме. Не описанный ранее феномен накопления в крови ЭПК в сочетании со снижением уровня ДГК и ю-6 ПНЖК при патологических состояниях у детей вносит новые представления в концепцию патогенеза этих состояний. Обнаружение АО свойств у ДЦ ПНЖК расширяет спектр известных к настоящему времени АО факторов и указывает на перспективность использования этих соединений в клинической практике. Полученные данные раскрывают новые стороны метаболизма ПНЖК и могут способствовать пониманию их физиологической роли у детей, а также служат теоретической основой для разработки новых подходов к диетотерапии болезней детского возраста. Данные о положительных эффектах обогащения рациона беременных женщин ю-3 ПНЖК используются в комплексной терапии ПЭ у беременных женщин.
Апробация диссертации
Результаты работы были доложены на Всероссийских и международных конференциях: Y и VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998, 2002); Y и YII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2000); Y Конгрессе педиатров России (Москва, 1999), International Congress of Pediatrics (Амстердам, Нидерланды, 1998), Международном симпозиуме "Питание XXI века. Медико- биологические аспекты, пути оптимизации" (Владивосток, 1999), Международном семинаре
"Проблемы беременности высокого риска" (Москва, 1999); I Всероссийском Конгрессе с международным участием "Питание детей: XXI век" (Москва, 2000); II российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2002); YII Всероссийском Конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); Second International Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (Мюнхен, Германия, 2004); 38th, 42th, 44th Annual Meetings of the European Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (ESPGHAN) (Порто, Португалия, 2005; Будапешт, Венгрия, 2009; Сорренто, Италия, 2011); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), I Всероссийском съезде диетологов и нутрициологов «Диетология: проблемы и горизонты» (Москва, 2006); конгрессе «Внутриутробный ребенок и общество. Роль перинатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии» (Москва, 2007); 10th European Nutrition Conference (Париж, Франция, 2007); World Congress of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition (Сан-Паоло, Бразилия, 2008); IX, X, XI, XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010).
Публикации и внедрение в практику
По теме диссертации опубликовано 64 работы, из них 19 публикаций - в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, другие издания - 10 публикаций, материалы научных конференций - 35 публикаций, 1 методические рекомендации, 4 главы в коллективных монографиях. Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры питания детей и подростков ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (354 ссылки). Объем работы составляет 280 страниц, содержит 50 рисунков и 35 таблиц.
Строение и номенклатура жирных кислот
Специфичность включения ЖК в состав тех или иных сложных липидов определяется их строением и физико-химическими свойствами. В энтероцитах ЖК включаются в разные сложные липиды: насыщенные, главным образом, - в триглицериды, ПНЖК с длинной цепью (20 и более атомов углерода) и большим числом двойных связей преимущественно - в фосфолипиды в силу стерических ограничений их встраивания в триглицериды [57, 58, 111, 120, 206]. Фосфолипиды составляют 40-90% от всех липидов клеточных мембран. В макрофагах и нейтрофилах в 40% фосфатидилэтаноламинов положение sn-2 занимает арахидоновая кислота (20:4). В нейтрофилах человека - 75% арахидоновой кислоты найдено в плазменилэтаноламине. Клетки, принимающие участие в воспалительных процессах, могут содержать до 20 различных фосфолипидов, в состав которых входит арахидоновая кислота. Тем не менее, основная ее доля находится в 1-(алк-1-енил)-2-арахидоноил-5п-глицеро-3-фосфоэтаноламине [120]. Фосфатидилхолины печени содержат до 40-50% арахидоновой кислоты и 25-30% линолевой. В сердце примерно каждый третий фосфолипид - плазмалоген, при этом 75% плазменилэтаноламина содержат арахидоновую кислоту [35]. Насыщенные, моно-, ди- и триеновые ЖК могут встраиваться и в триглицериды, и в фосфолипиды [58, 254]. В то же время, определенную роль в распределении ЖК по липидным пулам может играть и количество внеклеточных, так называемых, экзогенных, ЖК. В частности, показано, что специфичность включения экзогенной арахидоновой кислоты в тот или иной липидный пул во многом определяется концентрацией самой арахидоновой кислоты. Существуют пути, по которым арахидоновая кислота, добавленная к клеткам в высоких концентрациях, может включаться в триацилглицеролы [76, 327]. В опытах in vitro для нейтрофилов показано, что существует прямая зависимость между концентрацией экзогенной арахидоновои кислоты и ее количеством, появляющимся в триацилглицеролах. До сих пор точно не установлено, используется ли in vivo обнаруженный in vitro путь включения арахидоновои кислоты в триацилглицеролы.
Известно лишь, что некоторые типы клеток содержат в триглицеридах заметное количество арахидоновои кислоты, например, это клетки, относящиеся к легочной системе, такие, как тучные клетки, альвеолярные макрофаги, нейтрофилы легких [327]. Повышенное содержание арахидоновои кислоты в триацилглицеролах считается маркером хронического воспаления. При этом триацилглицеролам отводится роль накопительного пула для арахидоновои кислоты, которая высвобождается при хроническом воспалении из активированных клеток. Связывание избыточной арахидоновои кислоты в триглицеридах позволяет поддерживать низкий внутриклеточный уровень свободной кислоты. Параллельно включению в триглицериды емкость клеток по арахидоновои кислоте может увеличиваться также за счет ее вхождения в уникальный фосфолипидный пул, представленный 1,2-диарахидоноил-.?/7-глицеро-3-фосфатом [76]. Таким образом, ЖК являются основным компонентом различных видов липидов. Они выполняют в организме важные функции: служат аккумулятором энергетических запасов организма, выполняют пластическую и регуляторную функции.
Источниками энергии в организме, как известно, являются пищевые вещества -белки, жиры, углеводы. Из всех пищевых веществ максимальной энергетической ценностью обладают липиды: при окислении 1 г липидов образуется 9 ккал энергии - в 2 раза больше, чем при окислении углеводов и белков. Являясь компонентами липидов, ЖК обладают свойством аккумулировать в организме энергию, заключенную в их химических связях. Эта энергия извлекается при окислении ЖК в митохондриях [2, 29, 54, 197]. Как правило, энергетическим субстратом, окисляемым в митохондриях, служат насыщенные ЖК, а ПНЖК используются для пластических целей и в качестве предшественников биологически активных соединений. ЖК могут быть перенесены к клеткам двумя разными путями: активным и пассивным. Активным путем клетка сама регулирует поступление насыщенных ЖК путем синтеза апоЕ/В-100 рецепторов [56]. Активным путем насыщенные ЖК поступают в клетки через апоЕ/В-100 рецепторы в форме триглицеридов при поглощении клеткой переносящих их ЛПНОП, при этом гидролиз и освобождение насыщенных ЖК происходит в клетке. Пассивным путем насыщенные ЖК поступают в клетки не в форме триглицеридов, а в форме свободных ЖК Гидролиз триглицеридов происходит при этом не в клетке, а в крови, когда триглицериды ЛПОНП гидролизуются под действием постгепариновой липопротеидлипазы. Освобожденные ЖК связываются в крови с альбумином и транспортируются им к клеткам, встраив аясь в мембрану путем пассивной диффузии [199] и существенно нарушая при этом состав мембран [56]. Неэтерифицированные ЖК (НЭЖК) могут проникать в клетку также через транспортеры (FATP- fatty acid transport proteins - белки-переносчики жирных кислот или FAT - fatty acid transporters - транспортеры ЖК). НЭЖК быстро трансформируются в клетке СоА ЖК с помощью FATP [140] или ацилСоА синтетаз [126]. ПНЖК доставляются к клеткам с помощью ЛПНП и ЛПВП [54, 56]. Когда ЖК проникают в клетки в виде сложных липидов они гидролизуются липазами до НЭЖК, которые быстро превращаются в СоА ЖК, сохраняя очень низкий уровень НЭЖК в клетке. Уровень СоА ЖК в клетке также сохраняется низким. НЭЖК и СоА ЖК связываются с FABP - fatty acid binding protein - белком, связывающим ЖК и АСВР- acyl-CoA-binding protein - белком, связывающим - ацил-СоА - белками, транспортирующими ЖК в различные внутренние отделы клетки для последующего метаболизма [185] или в ядро для взаимодействия с факторами транскрипции [349]. Основная масса СоА ЖК быстро ассимилируется в сложные полярные и неполярные липиды, меньшая часть их подвергается (3-окислению в митохондриях (с образованием макроэргических соединений ацетил СоА и АТФ).
Часть СоА ЖК подвергается Р-окислению в пероксисомах [197]. Данный путь окисления является, в частности, промежуточным этапом образования ДЦ ПНЖК - ДГК со-З семейства [111, 311]. ПНЖК могут также подвергаться моноокислению в микросомах [197].
Основные представления о свободно-радикальном окислении и перекисном окислении липидов
Токоферолы (Тк) (от др.-греч. тбкос; — «деторождение», и cpepsiv — «приносить») — класс химических соединений, представляющих собой метилированные фенолы. Многие токоферолы— а-, (3-, у-, 5-, а также соответствующие им токотриенолы, являются биологически активными и в совокупности называются витамином Е [278]. Наиболее высокой витаминной и антиоксидантной активностью среди них обладают а-Тк содержащиеся в пищевых продуктах в наибольшем количестве по сравнению с другими видами Тк. Витамин Е относится к жирорастворимым витаминам и защищает от окисления ПНЖК, в том числе входящие в состав клеточных мембран. Биологические мембраны содержат примерно 1 молекулу а-Тк на 1000 молекул липидов. Способность а Тк реагировать с пероксильными радикалами намного больше, чем с ПНЖК, поэтому в клеточной мембране при достижении цепной реакцией ПОЛ молекулы витамина Е происходит обрыв реакции [61, 62, 106, 278]. Тк являются ингибиторами свободнорадикальных процессов и тормозят скорость окисления за счет реакции взаимодействия с перекисными радикалами (обрыв цепей). Константы скорости обрыва для Тк на 1-2 порядка выше аналогичных констант для большинства синтетических фенолов - антиоксидантов (АО) [51, 62]. Тк обладают рядом особенностей АО действия. Окисленные (хинонные) формы Тк практически не реагируют с перекисными радикалами. Для Тк характерно образование активных феноксильных радикалов, способных участвовать в реакциях передачи цепи, что обуславливает двойственность их действия (анти- и прооксидантов) и существенную зависимость от субстрата окисления [62]. Вещества, реагирующие с токофероксильными радикалами с частичной регенерацией фенольных форм АО, являются синергистами и значительно увеличивают эффективность действия Тк. К таким веществам относятся аскорбиновая кислота, аминокислоты, фосфолипиды (ФЛ), которые, не являясь АО, способны участвовать в регуляции скорости ПОЛ биомембран [62, 278]. В основе эффективности ТФ лежит их уникально высокое сродство к перекисным радикалам: даже незначительные изменения в концентрации Тк существенно меняют скорость обрыва цепей [51, 62]. Переход АО из одной формы в другую со значительным изменением антирадикальной активности можно рассматривать как способ быстрого изменения интенсивности ПОЛ. Токофероксильные радикалы могут выполнять роль буфера, поддерживающего скорость окисления на определенном уровне для разных концентраций АО (регуляция концентрацией) и для субстратов с различной степенью ненасыщенности (регуляция субстратом) [62]. ФЛ разного состава, являющиеся синергистами Тк, увеличивают эффективность их действия в зависимости от ненасыщенности их жирных кислот (см. раздел 1.2.4.). Физиологические условия окисления липидов (низкая температура, невысокие скорости инициирования, ненасыщенность субстратов, присутствие ФЛ) являются наиболее благоприятными для проявления максимальной активности Тк [62, 278].
Поскольку перекиси, образующиеся в ходе цепных реакций, формируются не только в липидной среде мембран, но и в водной фазе, для контроля реакций, происходящих в водной среде, нужны водорастворимые антиоксиданты. Основной представитель этой группы соединений, получаемый с пищей, — аскорбиновая кислота (витамин С). Это вещество защищает ЛПНП и другие липиды в жидкостях организма от окислительного повреждения и захватывает свободные радикалы ранее достижения ими мембраны. Полагают, что аскорбиновая кислота — наиболее важный антиоксидант внеклеточных жидкостей. По мнению большинства исследователей, механизм действия витамина С связан с его способностью восстанавливать окисленную форму витамина Е, образовавшуюся при взаимодействии а-Тк с липоперекисями, тем самым возвращая веществу свойства антиоксиданта. Витамин С рассматривают, поэтому, как синергист витамина Е [166, 257].
Каротиноиды представляют собой группу красных, оранжевых и желтых пигментов, обнаруженных в растительной пище, особенно во фруктах и овощах. Важнейшими пищевыми каротиноидами считают а- и Р-каротины, ликопин, лютеин, зеаксантин и р-криптоксантин [278]. Р-Каротин, в отличие от других каротиноидов, представляет собой предшественник витамина А. АОА одного из каротиноидов томатов -ликопина - в несколько раз выше, чем у р-каротина, однако его витаминная активность близка к нулю. Однако, очевидно, что связь с витамином А не исчерпывает механизмы атиоксидантного действия каротиноидов [12, 87, 88, 89, 105, 139]. Каротиноиды, не способные к образованию витамина А, играют роль эффективных ловушек синглетного кислорода, особенно при низком давлении кислорода [12, 181, 224, 225, 226, 23]. Улавливающая способность этих соединений связана с их свойством поглощать энергию без химических изменений (раздел 1.1.2.2). При низком давлении кислорода каротиноиды могут также действовать по иному механизму, выступая в качестве антиоксидантных соединений, обрывающих цепи ПОЛ.
К истинным антиоксидантм (соединениям, взаимодействующим с образовавшимися свободными радикалами и предотвращающим образование новых путем их перехвата и обрыва цепей свободно-радикального окисления) относятся только витамины Е, С, Р-каротин и флавоноиды [3, 22, 278]. В то же время, антиоксидантными свойствами могут обладать представители многих классов химических соединений. Это действие могут осуществлять не только классические антиоксиданты, проявляющие свое антирадикальное действие in vitro, но и компоненты сложной, многоуровневой системы, включающей и вещества, которые in vitro способны проявлять и прооксидантное действие. Так в мембранах существует несколько путей, определяющих антиоксидантный статус организма, которые изменяют скорость окисления липидов и которые можно рассматривать как регуляторные [61].
Изучение уровня суммарной аоа, мда и спектра жирных кислот в крови у недоношенных детей
Результаты электрофоретического определения содержания общих липидов во фракциях с минимальной (А) и максимальной (Б) АОА. Фракции получены в результате хроматографического разделения сыворотки крови взрослых людей на колонке "Sephadex G-200" А и Б - электорофореграммы (2) и денситограммы (1) фракций с низкой (№3) и высокой (№2) АОА, соответственно. Гели окрашены специфическим для общих липидов красителем "Oil Red ". С целью изучения вклада низкомолекулярных пищевых антиоксидантов, а именно, витаминов А и Е, в суммарную АОА было изучено содержание этих витаминов во фракции с максимальной АОА (№2) и в цельной сыворотке. Результаты представлены в таблице 128 Таблица 16. Содержание витаминов-антиоксидантов в сыворотке крови и во фракции с максимальной АОА (№ 2), полученной при хроматографическом разделении сыворотки крови на колонке "Sephadex G-200" Витамины Цельная сыворотка Фракция с максимальной АОА Витамин А, мкг/дл 79,9 0 Витамин Е, мг/дл 1,81 0,054 Как видно из таблицы, содержание витаминов А и Е в цельной сыворотке крови было несколько выше нормы (30-70 мкг/дл витамина А и 0,8-1,5 мг/дл витамина Е). Однако, во фракции с максимальной АОА витамин А обнаружен не был, а витамин Е присутствовал в ней в незначительном количестве.
Таким образом, проведенные исследования по фракционированию сыворотки крови на колонке с «Sephadex G-200» показали, что основным компонентом фракции №2 с максимальной АОА являются липиды, включая холестерин, триглицериды, фосфолипиды, а также аполипопротеин В. В то же время ТФ и ЦП отсутствовали в этой фракции, но были выявлены во фракциях с 6 по 11 с максимальным содержанием в 8 фракции - ТФ и с 4 по 10 фракцию с максимальным содержанием в 6 фракции - ЦП. Фракция с максимальной АОА характеризовалась высокой молекулярной массой содержащихся в ней биополимеров (приблизительно 600-1000 кДа и содержала небольшое количество витамина Е. Эти данные позволяют заключить, что основной вклад в АОА сыворотки крови вносят не низкомолекулярные соединения, а липидсодержащие соединения, скорее всего липопротеины.
Разделение сыворотки крови на колонке «Sephadex G-200» в использованной системе имело следующие недостатки: 1) большая продолжительность анализа (от нескольких часов до нескольких дней), по-видимому, сопряженная с потерей нативных свойств белков и низкомолекулярных компонентов сыворотки крови, в частности витаминов; 129 2) плохая воспроизводимость метода, связанная, очевидно, с длительным временем анализа; 3) неспособность геля «Sephadex G-200» эффективно разделять высокомолекулярные компоненты с молекулярным весом больше 200 кДа. В связи с этим, на следующем этапе работы нами была использована система для аналитической эксклюзионной хроматографии с носителем «Superose-б», лишенным указанных недостатков и способным разделять белки с молекулярной массой от 5 до 5000 кДа. Небольшая продолжительность анализа - 1 час, позволяет сохранить нативные свойства белков и, возможно, низкомолекулярных компонентов фракций.
Изучение АОА сыворотки крови и ее фракций, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови людей на колонке с «Superose- 6». Было проанализировано более 20 сывороток крови взрослых людей и 5 сывороток пуповинной крови. Типичные результаты изучения АОА фракций, полученных при хроматографическом разделении сыворотки крови на колонке с «Superose- 6», приведены на рис. 28. Как видно на рисунке, профиль АОА сыворотки крови, разделенной на носителе «Superose-6», характеризовался четко выраженным максимумом во фракции №13. Определение молекулярной массы данной фракции по калибровочной кривой дало значение 585 кДа, близкое к молекулярной массе фракции с максимальной АОА, выявленной в предыдущих опытах с использованием колонки с носителем «Sephadex G-200». Наблюдался также еще один пик АОА в области около 67 кДа, образуемый 15 и 16 фракциями.
Величина АОА во фракциях, полученных при хром ато граф и ческом разделении сыворотки крови на колонке с S uperose-б, ус л .ед. АОА, усл.ед. ф АОА Содержание белка по Кумасси G-250, м к г/ фракцию Содержание белка во фракциях, усл.ед.опт.пл. при 280нм Во всех полученных фракциях было проведено иммунохимическое определение содержания ТФ и ЦП. Результаты определения содержания этих белков приведены на рис. 29. Как видно на рисунке, ТФ определялся во фракциях №16 и №17 (рис. 29А), а ЦП - во фракциях №15, №16, частично, в 17 (рис. 29В). Во фракции с максимальной АОА, т.е. в 13 фракции, ни ТФ, ни ЦП обнаружены не были.
Иммунохимическое определение содержания белков-антиоксидантов во фракциях показало, что АОА в 16 фракции сыворотки крови взрослых людей определяется, следовательно, присутствием ТФ и ЦП. Содержание этих белков в цельной сыворотке крови составило 231 и 45 мг%, для ТФ и ЦП, соответственно, и было в пределах нормы для взрослых людей.
Таким образом, результаты опыта по фракционированию сыворотки крови человека на «Superose-б с последующим определением АОА, ТФ и ЦП в полученных фракциях показали, что максимальная АОА связана с высокомолекулярной фракцией (№13), не содержащей ТФ и ЦП. Определение молекулярной массы фракции №13 по калибровочной кривой дало значение 585 кДа, т.е. близкое к молекулярной массе одной из фракций с максимальной АОА, выявленной в опыте, проведенном с использованием носителя «Sephadex G-200».
Изучение спектра ЛТ, АОА и ПОЛ в крови у детей в условиях детского клинического санатория
ЛПВП могут противостоять способности оЛПНП стимулировать апоптоз путем непосредственного влияния на сигнальные пути эндотелиальной клетки, т.к., по данным литературы, предварительная совместная инкубация ЛПВП с оЛПНП не снижала проапоптотического действия о ЛПНП [323].
Показано существование АО А у подклассов ЛПВП, особенно 2-го и 3-го, связанной 1) с наличием собственных антиоксидантных ферментов ЛПВП -параоксоназы-1 [148] и др. [175, 330], 2) антиоксидатной активности, присущей апоА-1 [254] и 3) липидному компоненту ЛПВП, а именно переносимым этим липопротеидом фосфолипидам, компонентами которых являются ПНЖК. АОА фосфолипидов тем выше, чем выше степень ненасыщенности, а, следовательно, и длина углеродной цепи входящих в состав фосфолипидов ПНЖК [30, 52, 62].
Предполагают, что антиапоптотической активностью может обладать липидный компонент ЛПВП, поскольку их защитный эффект, как показано, не зависел ни от антиоксидантного фермента параоксоназы, ни от действия апоА-1, ни от влияния на захват клетками оЛПНП [323, 258]. Установлено, что липидная фракция ЛПВП может увеличивать в эндотелиальных клетках внутриклеточную концентрацию кальция, который регулирует такие ключевые процессы как пролиферация, апоптоз, синтез простагландинов иЖ)[261, 189]. АОА в липидной фракции ЛПВП могут обладать, наряду с уже упомянутыми обычными фосфолипидами, плазмалогены, в состав которых также входят длинноцепочечные ПНЖК и количество которых в клеточных мембранах может достигать 30% от суммы всех фосфолипидов [35].
Известны данные о стимулирующем действии на рост злокачественных опухолей молочной железы -6 ПНЖК: ЛК, АК и образующихся из нее эйкозаноидов (ПГЕ2, ЛТВ4, 12-НЕТЕ) [293]. Увеличение потребления ш-3 ПНЖК приводило к снижению в организме уровня со-6 ПНЖК и их активных метаболитов и тормозило пролиферацию данного вида опухолей [101, 102]. В то же время, при раке простаты данные о роли со-6 и со-3 ПНЖК в прогрессировании заболевания противоречивы. По одним данным рост пролиферации опухоли связан с повышенным потреблением общего жира и со-6 ПНЖК [101, 102, 293], по другим - прямо пропорционален потреблению а-линоленовой кислоты со-3 семейства ПНЖК [293]. С другой стороны, как было упомянуто выше, ДЦ ПНЖК как со-6 (АК), так и со-3 семейства (ДГК) в составе фосфолипидов и ЛП крови обладают АОА (глава З.1.). Таким образом, связь АОА и пролиферативной активности клеток печени и тимуса в совокупности с литературными данными о стимулирующем действии со-6 ПНЖК на пролиферацию злокачественных опухолей молочной железы и простаты, косвенно подтверждает вывод, сделанный нами в главе 3.1. о роли ДЦ ПНЖК в формировании АОА.
В то же время другим липидным компонентом, регулирующим клеточный цикл, могут быть сфинголипиды. Nofer et al. [258] сообщили, что выделенные из ЛПВП лизосульфатид и сфингозилфосфорилхолин активируют фосфоинозитол-специфическую фосфолипазу С в фибробластах и способствуют клеточной пролиферации. Однако не ясно, влияют ли сфинголипиды на АОА ЛПВП.
Авторы, наблюдавшие увеличение АОА клеточных липидов в период прохождения клеткой фазы G1 [1], трактовали полученные результаты в свете представлений о важной роли липидов для построения клеточных мембран и определения их физико-химических свойств. Поскольку АОА является отражением именно физико-химических свойств липидных компонентов, ее изменение могло быть связано с теми процессами, которые происходят на мембранных структурах, в частности с образованием комплекса нуклеопротеидов с липопротеидами мембран, необходимого для репликации ДНК [1]). Важно подчеркнуть, что по данным литературы АОА обладают в первую очередь представители именно со-3 класса, как наиболее длинноцепочечные и ненасыщенные представители жирных кислот [30, 52, 103, 202]. Именно их встраивание в клеточные мембраны может изменять физико-химические свойства последних, способствуя максимально эффективной передаче сигналов, стимулирующих пролиферативные процессы в клетках. И, наконец, можно предположить, что для делящихся в период активного роста организма клеток необходимо большое количество ДЦ ПНЖК, а именно АК и ДГК, входящих в состав фосфолипидов клеточных мембран. Эти ДЦ ПНЖК в то же время обладают в составе фосфолипидов АОА. Таким образом, ДЦ ПНЖК в период активного роста могут выполнять множественные функции: быть «строительным материалом» для мембран новых клеток, обладать защитными свойствами в отношении СРО и стимулировать рост путем ускорения прохождения клеткой фазы G1. Конкретные механизмы указанных взаимодействий требуют дальнейшего изучения.
Полученные нами данные об участии со-6 и со-3 ПНЖК в формировании АОА сыворотки крови в составе липопротеинов, влиянии их дополнительного приема на рост АОА крови и снижение интенсивности процессов ПОЛ у беременных женщин с ПЭ, а также данные о снижении АОА крови у недоношенных детей, имеющих низкий уровень 186 со-6 и co-3 ДЦ ПНЖК, указывают на способность этих ДЦ ПНЖК проявлять антиоксидантные свойства. В то же время, эти соединения являются основным субстратом ПОЛ. Таким образом, со-6 и со-3 ПНЖК, с одной стороны, выступают в качестве субстратов ПОЛ, с другой стороны, участвуют в формировании антиоксидантного потенциала. Более того, сложные метаболические взаимоотношения, в которых участвуют ДЦ ПНЖК, дополняются еще одной группой метаболических реакций: со-6 и со-3 ПНЖК являются предшественниками различных классов эйкоза- и докозаноидов, причем их образование включает в качестве промежуточных метаболитов продукты ПОЛ [342].
Многообразие путей как превращения ПНЖК, так и путей образования и превращения различных видов эйкозаноидов, в частности, лейкотриенов (ЛТ), позволяет предполагать возможность их реципрокных взаимоотношений, вытекающих из факта единого источника этих метаболических путей - пула со-3 и со-6 ПНЖК, образующихся в результате их поступления с пищей и освобождения из тканевых депо. Несмотря на всю очевидность данных представлений, эта гипотеза не была рассмотрена ранее в литературе. В связи с этим, в работе была проведена оценка данной гипотезы, включающая исследование спектра ЛТ, в том числе редко изучаемых ЛТ 5 серии - производных со-3 ПНЖК с противовоспалительной активностью, с параллельным изучением уровня одного из показателей ПОЛ - МДА и АОА крови у условно здоровых детей, детей с бронхиальной астмой (БА) и ожирением.
![Изучение метаболизма оксида азота при бронхиальной астме [Электронный ресурс]](/i/i/4333/207471.png "Изучение метаболизма оксида азота при бронхиальной астме [Электронный ресурс] Климанов Игорь Александрович")
