Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. "Скрытый" метаболизм 11
1.1.1. Примеры реакций "скрытого" метаболизма И
1.1.2. Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина 14
1.1.3. Механизм токсического действия норлейцина 20
1.1.4. Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты 20
1.2. Пути метаболизма треонина в клетках . coli 22
1.2.1. Биосинтетическая треониндезаминаза 22
1.2.1. Аэробные пути деградации треонина 23
1.2.2. Анаэробный путь деградации треонина 27
1.2.3. Регуляция транскрипции tdcABCDEFG оперона 32
1.2.4. ТРР-зависимый путь деградации треонина 34
1.2.5. Метилцитратный цикл метаболизма пропионил-КоА 36
1.3. Синтазы ацетогидроксикислот в синтезе разветвленных аминокислот у Е. coli 39
1.3.1. Классификация синтаз ацетогидроксикислот и их метаболическая роль 39
1.3.2. Изоферменты AHAS у Е. coli 40
1.3.3. Субстратная специфичность и кинетические свойства AHAS 41
1.3.4. Регуляция экспрессии AHAS 42
1.3.4.1. Регуляция транскрипции ilvBN оперона 42
1.3.4.2. Регуляция транскрипции ilvGMEDA оперона 43
1.3.4.3. Регуляция транскрипции ilvIHоперона 45
Глава 2. Материалы и методы 47
2.1. Среды, условия культивирования штаммов 47
2.2. Трансформация, трансдукция бактерий, интеграция экспрессионных кассет 47
2.3. Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК 48
2.4. Бактериальные штаммы, использованные в данной работе 49
2.5. Эксперименты с рекомбинантной ДНК 52
2.6. Конструирование рекомбинантных плазмид 54
2.7. Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ 60
2.8. Анализ деградации Ь-[Ц-14С]треонина в штамме ITP290-3 61
2.9. Получение Ь-13С-треонина 61
2.10. Регистрация и обработка ЯМР-спектров 62
2.11. Измерение энзиматических активностей 63
2.11.1. Определение активности треониндезаминазы 63
2.11.2. Определение активности ацетолактатсинтазы 64
2.11.3. Определение активности изопропилмалатсинтазы 64
2.12. Определение времени полужизни треониндезаминазы и AHAS 65
2.13. Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина 65
2.14. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот 66
2.15. Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli 67
2.16. Компьютерные программы, использованные в данной работе 67
Глава 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях
контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию 68
3.1.1. Конструирование модельного штамма ITP290-3 68
3.1.2. Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии гена ilvA е 70
3.1.3. Анализ продуктов деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3 72
3.1.4. Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии 74
3.2. Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат 81
3.2.1. Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме ITP290-3 81
3.2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP290-3 83
3.2.3. Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле.85
3.3. Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот 85
3.3.1. Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона 86
3.3.2. Клонирование генов валин-чувствительных AHAS I и AHAS III 88
3.3.3. Клонирование генов AHAS I в составе оперона ТА-\Х-(ЬгА442В 89
3.3.4. Клонирование генов AHAS из М. methylotrophus 90
3.4. Изучение сверхсинтеза норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма
Е. coli, дефектного по AHAS 93
3.4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH 93
3.4.2. Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина...96 3.4.3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина 97
3.4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IPMS 99
Выводы 104
Список использованной литературы
- Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина
- Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК
- Конструирование модельного штамма ITP290-3
- Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути "скрытого" метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [1]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование "ненужных" путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться "скрытые" метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.
Мы столкнулись с явлением "скрытого" метаболизма при конструировании на основе Escherichia coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1.1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина -биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AHAS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата -предшественника изолейцина.
При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина,
поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина.
транспорт из клетки
включение в белки
анаэробные условия
2-амино-3-кетобутират
Tdh TdcB
—р>—s-— L-треонин ——?—s. * 2-кетобутират
ДН НАЛ+ V NH, рпп V КоА
NH3 рпв
сЕЬнсоон
IlvA
NH3 2-кетобутират
^КоА НАДН НАД+
7^4
ацетил-КоА
пропионил-КоА
L-глицин
2 Pta
,^КоА
пропионилфосфат АскА V АДФ
^ пируват
AHAS КоА
у^со2
2-ацето-2-гидрокси-бутират
TdcD V
пропионат
\ \ \
L-изолейцин
Рис. 1.1. Метаболизм L-треонина в Е. coli
Tdh - треониндегидрогеназа, КЫ - 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA -треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - синтазы ацетогидроксикислот; TdcB -треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутират-формиатлиаза, Pta - фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD - пропионаткиназы
К настоящему времени в клетках Е. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [2], и анаэробная деградация до пропионата [3] (Рис. 1.1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и АскА. Другие пути деградации треонина в клетках Е. coli к настоящему времени не охарактеризованы.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО "АГРИ" и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата. В процессе работы решались следующие задачи:
изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е. coli; идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в клетках Е. coli;
создание коллекции генетических конструкций, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е. coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот;
исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;
- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в Е. coll
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в модельном штамме Е. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvA е , кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvAIkR. Показано, что в клетках Е. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.
Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.
Получен штамм Е. coli с делениями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.
Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина
У микроорганизмов и растений для биосинтеза разветвленных аминокислот изолейцина, валина и лейцина используются общие метаболические пути, представленные на Рис. 1.4 [14]. Известно, что изолейцин и валин образуются из общего метаболического предшественника - пирувата, который в реакции, катализируемой синтазами ацетогидроксикислот (AHAS I, II и III, ЕС 2.2.1.6) конденсируется либо со второй молекулой пирувата с образованием 2-ацетолактата - предшественника валина и лейцина, либо с 2-кетобутиратом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата - предшественника изолейцина. Образование 2-кетобутирата из треонина в пути биосинтеза изолейцина осуществляет биосинтетическая треониндезаминаза (продукт гена ilvA, ЕС 4.3.1.19). Дальнейшее превращение 2-ацетолактата и 2-ацето-2-гидроксибутирата в изолейцин и валин катализируют изомероредуктаза кетокислот (продукт гена ilvC, ЕС 1.1.1.86), дегидратаза дигидроксикислот (продукт гена ilvD, ЕС 4.2.1.9) и трансаминазы В (продукт гена ilvE, ЕС 2.6.1.42) и С (продукт гена avtA, ЕС 2.6.1.66).
Особенностью бисинтеза лейцина является то, что он образуется из кетопредшественника валина - 2-кетоизовалерата (2-КИВ), в так называемом "пути удлиннения кетокислот" (Рис. 1.4).ниє белка в зерне. Известно, что накопление белка в зерне происходит в результате использования азотистых веществ, главным образом белков, накопленных в вегетативных органах до начала налива зерна и поглощения азота из почвы в период налива зерна. В среднем около 2/3 белка в зерне образуется в результате реутилизации азота и 1/3 - в результате поглощения азота из почвы. Соотношение между этими двумя источниками может сильно изменяться в зависимости от наличия азота в питательной среде в фазу налива зерна. При увеличении обеспеченности растений азотом увеличивается поглощение его из почвы в фазу налива зерна, а при уменьшении поступления азота из почвы увеличивается отток его из вегетативных органов [131, 138]. Это говорит о том, что хотя растение обладает большой способностью к реутилизации азотистых веществ вегетативных органов, но это количество азота недостаточно для формирования зерна с высоким содержанием белка. Поэтому растение должно быть обеспечено азотом не только в ранние, но и в поздние фазы развития [45, 49, 71, 88, 103, 116, 129 и др.]. Азот, поступивший в поздние фазы развития, используется главным образом на синтез клейковинных белков, вследствие чего увеличивается содержание общего белка, клейковины, а также улучшаются технологические свойства [56, 125, 130,151,164, 172, 179 и др.].
Эффективность дробного внесения азота в процессе вегетации озимой пшеницы подтверждают опыты многих исследователей [22, 49, 72, 88, ПО, 125, 129, 181, 189 и др.]. Наиболее целесообразным является внесение азота в 3 приема: 40 кг рано весной, 40 кг - в фазу выхода в трубку и 40 кг - в фазу колошения [151, 172].
Азотные удобрения усиливают устойчивость растения к засухе, но высокие дозы, увеличивая первоначально вегетативную массу и корневую систему, сильно иссушают почву. Недостаток влаги в последующие фазы приводит к снижению урожая. На подзолистых почвах одностороннее азотное питание или незначительно увеличивает урожай, или, вызывая полегание,
Известно, что ферменты лейцинового пути обладают широкой субстратной специфичностью. В частности, было показано, что IPMS Serratia marcescence способна использовать в качестве субстрата не только 2-кетоизовалерат (Km = 0.8 мМ), но и другие кетокислоты, например, пируват (Km = 3.4 мМ), 2-кетобутират (Km = 7.7 мМ), 2-кето-З-метилвалерат и 2-кетовалерат (Km = 9.0 мМ) [20].
В связи с этим дисбаланс в пулах кетопредшественников изолейцина, валина и лейцина, который возникает в результате нарушения механизмов регуляции биосинтеза разветвленных аминокислот, может приводить к образованию в пути биосинтеза лейцина неканонических аминокислот - норвалина, норлеицина, гомоизолеицина и гомолеицина (Рис. 1.6).
Образование неканонических аминокислот норвалина и гомоизолеицина впервые наблюдали Kisumi с соавт. [21] в процессе биоконверсии треонина в изолейцин в штамме S. marcescens с устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазой. Поскольку питании истощение запасов подвижного фосфора происходит очень быстро. По данным А.Ф. Сафонова (1996), С.А. Шафрана (1985) и др. оптимальное содержание подвижного фосфора в дерново-подзолистой почве для зерновых составляет от 9,0 до 15,0 мг/100 г почвы.
В опытах В.Г. Минеева и М.М. Ивлева (1975), проведенных в условиях Белорусской ССР на дерново-подзолистых почвах со средним содержанием подвижного фосфора, прибавки урожая от фосфорных удобрений в нормах 20, 40 и 60 кг/га на фоне NK составили, соответственно, 1,0; 2,7 и 3,7 ц/га.
На бедных фосфором почвах фосфаты в дозе Род по фону ИбоКбо повышали урожай и белковость озимой пшеницы. На почвах, где уровень фосфора был в пределах 12-14 мг/100 г почвы, эффективны были азотные и азотно-калийные удобрения. Фосфор же слабо влиял на урожай и снижал белковость зерна [33].
Урожайность озимой пшеницы в 40 - 45 ц/га можно получить при содержании Р2О5 в количестве 12-13 мг/100 г почвы, но с обязательным внесением фосфорного удобрения в дозе 60 кг/га. Оптимальной дозой азота при содержании до 8 мг/100 г почвы Р2О5 является N9o, при большей обеспеченности - Ni2o. При средней окультуренности почвы по фосфору вносить его свыше Ріго-150 нерационально. Если содержание фосфора в почве низкое, оптимальное соотношение N:P:K в полном минеральном удобрении является 1:2:3, при среднем - 1:1:1, при повышенном - 2:0:1 [136]. Т.И. Иванова, Р.Н. Кожемякова, Л.П. Айрумов (1979) отмечают, что при низком содержании
Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК
Метеорологические условия в весенне-летний период по декадам представлены в приложении 2.
Для Московской области характерна засушливая погода в весенний период и повышенная влагообеспеченность с пониженным температурным режимом в летний.
Весенняя вегетация 1996 года в апреле, I и II декадах мая проходили в условиях очень теплой погоды (на 2,9 - 7С выше среднемноголетних), при отсутствии влагообеспеченности в первых двух декадах апреля и пониженной - в первых двух декадах мая (рис. 1). Это способствовало активному росту и развитию растений. Только в III декаде мая среднесуточная температура воздуха была пониженной при достаточной влагообеспеченности.
В 1997 году в весенний период температурный режим был на уровне среднемноголетних данных. Влагообеспеченность по декадам была неравномерной: во второй декаде апреля осадков выпало 1,5 нормы и гидротермический коэффициент (ГТК) составил 4,19. Первые две декады мая проходили в условиях теплой погоды (на 3,5-3,6С выше средних значений), а в III декаде было прохладно (на 3С ниже нормы). Первая декада мая была очень сухой (2 мм осадков) и ГТК составил всего 0,15 (рис. 1).
В условиях Московской области период налива зерна протекает в июне - июле. В этот период желательна сравнительно сухая погода (40-60 мм осадков в месяц) и среднесуточная температура воздуха - 16-22С, гидротермический коэффициент, показывающий отношение суммы осадков к сумме среднесуточных температур за определенный период развития растений, оптимален в пределах от 0,5 до 1,0 [163].
В 1996 году в летний период создались не очень благоприятные условия для формирования качественного зерна. В июне температура воздуха была выше среднемноголетней на 1,2 - 2,4С, при неравномерной влагообеспеченности по декадам. Наибольшее количество осадков выпало во II и III декадах месяца (в 1,6 - 1,7 раза выше среднего уровня). Пшеница заколосилась 5 июня, что на 8 - 10 дней раньше среднемноголетних данных и 15 июня зацвела.
Первые две декады июля были оптимальными для развития растений: температура была выше нормы, влагообеспеченность пониженная (рис. 1); а III декада - отличалась несколько пониженной температурой при повышенной влагообеспеченности, что обусловило высокое значение ГТК 2,34 (в период налива зерна).
Восковой спелости зерно озимой пшеницы достигло 26 июля, полной спелости - 5 августа, т.е. в сроки, близкие к среднемноголетним данным.
Фаза колошения - наиболее важный период в жизни растения и его называют критическим: растения нуждаются в повышенном количестве питательных веществ и влаги. Озимая пшеница - растение длинного дня, поэтому формирование колоса зависит от продолжительности светового дня и температуры воздуха. В период колошения озимая пшеница более требовательна к теплу.
В 1997 году в летний период были более благоприятные погодные условия, чем в 1996 году: среднесуточная температура в фазу колошения - цветения была выше на 2,9С, а в фазу цветение - полная спелость - на 1,8С (рис.2, приложение 3).
В 1997 году среднесуточная температура воздуха в июне была выше среднемноголетних данных на 4,7С. Наибольшее количество осадков выпало в I декаде, что в 4,4 раза выше нормы ив 1,5-2 раза выше оптимальных значений (рис. 1). Необходимо отметить, что более половины осадков выпало в I декаде за сутки. Ливень сопровождался шквальным ветром и ураганом, однако полегания растений не было. В фазу колошения озимая пшеница вступила 11 июня (обычно 15-21 июня), цветения - 19 июня.
Июль месяц оказался очень сухим (21 мм осадков), в III декаде осадков не было. Среднесуточная температура в I и III декадах июля была выше средних значений на 3,3 и 4,0С соответственно, а во II декаде - ниже.
Низкая температура во II декаде июля (15,5С) и низкая влагообеспеченность задерживали рост и развитие озимой пшеницы.
Август по температурному и водному режиму оказался благоприятным: температура была высокой, влагообеспеченность ниже средних данных (приложение 2). Озимая пшеница достигла фазы восковой спелости в I декаде августа, полной - 30 августа, что на 20 дней позже средних значений.
В 1997 году в фазу налива зерна был оптимальный температурно-влажностный режим. Среднесуточная температура была высокой (19,3С) при достаточном количестве осадков, что обусловило значение ГТК - 0,61 (рис.2 и 3, приложение 3).
Обобщая представленные данные двух лет можно отметить, что метеоусловия весенне-летнего периода 1996 года были менее благоприятными для получения качественного зерна озимой пшеницы, по сравнению с 1997 годом.
Периоды налива и созревания в 1996 году сопровождались избыточным увлажнением, поэтому значения ГТК были повышенными, и это могло отрицательно сказаться на формировании качественного зерна озимой пшеницы. Наступление фаз развития растений озимой пшеницы проходило в сроки, близкие к среднемноголетним значениям.
В 1997 году среднесуточная температура воздуха в период налива и созревания зерна озимой пшеницы была более высокой, чем в 1996 году -19,3С (на 1,8С), значение ГТК оптимальным - 0,61. Такой температурно-влажностный режим в период налива и созревания зерна обеспечил получение более качественного зерна озимой пшеницы. Пониженная температура во II декаде июля и низкая влагообеспеченность в июле (21 мм осадков) задерживали рост и развитие растений озимой пшеницы, поэтому наступление фаз налива и созревания зерна проходило с опозданием, однако на качестве и урожайности зерна это не сказалось.
Конструирование модельного штамма ITP290-3
Наиболее высокая урожайность была получена при более благоприятных погодных условиях в 1997 году, что в среднем на 0,67 т/га выше по сравнению с 1996 годом. Практически все варианты опыта в 1996 и 1997 годах обеспечивали прирост урожайности озимой пшеницы в большей или меньшей степени (табл. 7). В блоке без защиты растений на фоне РК-удобрений прибавки урожая от доз азотных удобрений в 45, 90 и 135 кг/га в среднем составили 0,18; 0,31 и 0,49 т/га соответственно (в контроле урожайность - 4,44 т/га).
От одних только гербицидов произошло так же незначительное увеличение урожайности - на 0,28 т/га (рис. 9). В блоке с применением гербицидов от различных доз азотных удобрений (45, 90 и 135 кг/га) прибавки урожая были более существенны и составили 0,86; 1,10 и 1,17 т/га соответственно.
На фоне отсутствия азотных удобрений (варианты B2N0 и B3N0) баковая смесь пестицидов обеспечивала прибавку урожайности относительно контроля на 1,08 и 0,76 т/га соответственно, т.е. в несколько раз больше, чем при использовании одних только гербицидов.
Современная интенсивная система земледелия возделывания озимой пшеницы предусматривает оптимальное обеспечение растений азотом, что в комплексе с защитой растений гарантирует высокую урожайность.
В наших исследованиях максимальная урожайность 6,5 т/га была получена при комплексном использовании азотных удобрений в дозе 90 кг/га и интегрированной системы защиты растений. Та же доза удобрений без пес тицидов позволила получить всего 4,75 т/га (на 1,75 т/га меньше). Увеличение дозы азота до 135 кг/га без пестицидов практически не изменило среднюю урожайность, она оказалась равной 4,93 т/га, а с применением пестицидов - 6,4 т/га. Пестициды на фоне повышенных доз азотных удобрений (90 кг/га) обусловили увеличение урожайности почти на 37%, а по сравнению с контролем - на 46% (приложение 13).
Системы защиты растений в целом обеспечивали большую прибавку урожайности озимой пшеницы по сравнению с азотными удобрениями. От интегрированной и стандартной систем защиты произошло увеличение урожайности, в среднем по блокам, на 1,45 и 1,14 т/га соответственно, по сравнению с блоком без защиты растений (табл. 6).
Эффективность азотных удобрений зависит от систем защиты растений. При интегрированной системе защиты растений максимальная урожайность была получена при внесении азотных удобрений в дозе N90- Увеличение дозы до 135 кг/га оказалось не эффективным. При стандартной системе защиты доза азота в 135 кг/га была более эффективна, по сравнению с N90, в среднем на 0,46 т/га (табл. 7, рис. 9).
В целом, комплексное использование средств химизации (N90-135 + гербициды + фунгициды + ретарданты) обеспечивало устойчивую прибавку Зфожайности около 2,0 т/га (по годам в пределах от 1,02 до 2,53 т/га). Результаты исследований показали, что в зависимости от доз азотных удобрений и систем защиты растений элементы структуры урожая претерпевали заметные изменения (табл. 8, 9).
Так, число продуктивных стеблей в зависимости от вариантов, в сред-нем за два года, варьировало в пределах 510 - 646 шт/м , число колосков в колосе - от 12,2 до 15,2 шт, число зерен в колосе - от 23,2 до 31,4 шт, масса зерна с 1 колоса - от 0,79 до 1,09 г, высота пшеницы - от 88 до 104 см.
Число продуктивных стеблей в меньшей степени изменялось под действием азотных удобрений и в большей - от систем защиты растений: от интегрированной - увеличивалось на 17%, от стандартной - на 15% (рис. 10, 11, приложения 13, 14).
Наибольшее число продуктивных стеблей наблюдалось при интегрированной системе защиты растений: в 1996 году - 569 , в более благоприятном 1997-622 шт/м2 (табл. 8).
Не всегда наблюдалась прямая зависимость между числом продуктивных стеблей и урожайностью. Например, в 1996 году в блоке с интегрированной системой защиты при внесении азотных удобрений в дозе N45 число продуктивных стеблей составило 666 шт/м , а при внесении 90 и 135 кг/га -550 и 563 шт/м2 соответственно. Но, несмотря на разницу почти в 100 стеблей, по последним двум вариантам урожайность была выше на 0,56 т/га, чем при N45.
На высоту растений азотные удобрения не оказали никакого влияния (в среднем высота составляла 96-97 см), а при интегрированной и стандартной системах защиты происходило снижение высоты растений в среднем на 10 см, по сравнению с блоками, где не применялись фунгициды и ретарданты. Видимо ретарданты в баковых смесях приостанавливали рост междоузлий соломины, что повышало их устойчивость к полеганию.
Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот
Валориграф используют для определения водопоглотительной способности муки (ВПС) и изучения свойств теста в процессе замеса его.
Важным показателем при выпечке хлеба является способность муки поглощать воду. Благодаря этому свойству увеличивается выход готовых изделий. Водопоглотительная способность муки сильных пшениц составляет 75%, слабых - около 50%.
При расшифровке валориграмм и фаринограмм определяют время образования и устойчивость теста, степень разжижения, валориметрическую оценку, показатель качества.
Устойчивость теста характеризует сопротивляемость (стойкость) теста механическому воздействию лопастей тестомесилки.
Показатель степени разжижения теста у сильных пшениц должен быть не более 60, ценных - не более 80, средних - не более 150 и слабых - более 150 е.ф. (приложение 4).
Показатель валориметрической оценки для пшениц различного качества может колебаться от 20 до 100 е.в.: для сильных пшениц - не менее 70, ценных - не менее 55, средних - не менее 30-45, слабых - менее 30 е.в.
По времени образования, устойчивости теста и числу качества классификационные нормы пока не разработаны.
Физические свойства теста из муки, выработанной из зерна озимой пшеницы урожая 1996 года, определяемые на валориграфе, были ниже, чем в 1997 году (табл. 19,20).
Водопоглотительная способность (ВПС) муки находилась в пределах: в 1996 году - от 60,0 до 67,2%, в 1997 - от 70,2 до 79,2%. Между ВПС и объемным выходом хлеба установлена тесная корреляционная связь (г=0,66±0,14).
Применение гербицидов и баковой смеси пестицидов (на фоне РК-удобрений) в зависимости от года, по-разному влияло на показатель ВПС: в 1996 году - снижало на 1,4-4,8%, в 1997 - незначительно увеличивало, либо оставляло его без изменений. При различных системах защиты внесение N45 приводило к некоторому снижению ВПС как в 1996, так и в 1997 году.
Повышенные дозы азота (135 кг/га) в блоке без защиты растений также снижали показатель ВПС, а при комплексном использовании азотных удобрений (135 кг/га) и систем защиты растений ВПС муки несколько увеличивалась: в среднем на 0,7-1,8%.
Относительно контроля, существенное увеличение ВПС наблюдалось в 1997 году: от N135 при минимальной и от Ngo при интегрированной системах защиты - на 5,0 и 3,4% соответственно. Показатели времени образования и устойчивости теста, как и водопо-глотительной способности муки, были выше в 1997 году, чем в 1996.
Установлены высокие коэффициенты корреляции (при п=32) между временем образования, устойчивостью теста и валориметрической оценкой (г=0,89±0,08 и г=0,84±0,10), показателем качества по фаринографу (г=0,91±0,07 и г=0,93±0,07), разжижением теста (г=-0,69±0,13 и г=-0,68±0,13), энергией деформации теста (г=0,73±0,13 и г=0,62±0,14), объемным выходом хлеба (г=0,76±0,12 и г=0,69±0,13), общей хлебопекарной оценкой (г=0,55±0,15 иг=0,58±0,15 соответственно).
В 1996 году время образования теста было низким - от 1,5 до 3,0 мин, что характеризует пшеницу как слабую. Тесто имело устойчивость от 1,5 до 3,5 мин. Максимальная устойчивость теста (3-3,5 мин) наблюдалась на вариантах, где вносились повышенные дозы азотных удобрений (N90 и Ni3s) В 1997 году тесто из пшеничной муки имело более высокие показатели времени образования и устойчивости теста. Устойчивость теста от 4,0 до 5,0 мин наблюдалась на вариантах с применением азотных удобрений в дозах 45, 90 и 135 кг/га (табл. 19, приложения 21-24).
В годы проведения исследований снижения времени образования и устойчивости теста относительно контроля не было. В блоке без защиты растений время образования теста и устойчивость теста увеличивались от азотных удобрений, в среднем за два года: от N45 - на 25%, от N9o - на 50 и 100%, от N]35 - на 100 и 125% соответственно (приложение 19).
Применение баковой смеси пестицидов на фоне РК-удобрений увеличивало время образования и устойчивость теста - на 0,5 и 1,0 мин соответственно, относительно контроля.
При интегрированной системе защиты увеличение времени образования и устойчивости теста, в среднем за два года, происходило от повышенных доз азотных удобрений - на 50 и 75% соответственно, при стандартной системе от N90 - на 100, от N135 - на 75%, относительно контроля (приложение 19).
Похожие диссертации на Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот
