Изучение вторичной и третичной структуры рибосомных белков из малой 30S субчастицы Escherichia coli Гогия Зураб Валерьянович

Содержание к диссертации

Введение

1. Универсальные принципы структурной организации рибосом 10

1. Общая характеристика рибосом 10

2. Построение рибосом из двух неравных субчастиц. 10

3. Другие характерные особенности структуры рибосом 14

4. Разборка и самосборка рибосомных субчастиц 15

2. Взаимное расположение белков и РНК в 30s субчастице 18

3. Структура компонентов 30s субчастицы рибосом 27

1. Конформация I6S РНК в растворе и в составе 30S субчастицы 27

2. Состав и некоторые физико-химические характеристики рибосомных белков 30S субчастицы Е.соїі 31

3. Конформация рибосомных белков в составе 30S субчастицы рибосом 33

4. Конформация изолированных рибосомных белков в растворе 33

4. Выделение индивидуальных белков из 30S субчасти цы рибосом 46

1. Введение 46

2. Экстракция рибосомных белков из субчастиц 46

3. Ионообменная хроматография белков из 30S субчастицы рибосом 49

4. Сравнение методов выделения 52

5 Экспериментальная часть

1. Выращивание бактерий 55

2. Выделение рибосом 55

3. Выделение рибосомных субчастиц 56

4. Выделение тотального белка рибосомных 30S субчастиц методом экстракции 67% уксусной кислотой 57

5. Двумерный гель-электрофорез белков 30S субчастицы рибосом 58

6. Полиакриламидный гель-электрофорез рибосомных белков в К- ацетатном буфере рН 4,5 в присутствии 6,5 М мочевины 60

7. Полиакриламидный гель-электрофорез рибосомных белков в присутствии додецилсулъфата натрия в пластинах 61

8. Хроматографические процедуры при фракционировании белков рибосомной 30S субчастицы 63

9. Концентрирование белковых препаратов 64

10. Получение чистых препаратов индивидуальных рибосомных белков из малой 30S субчастицы рибосом 64

11. Выход индивидуальных белков и оценка чистоты полученных препаратов 76

12. Определение N-концевых аминокислот 77

13. Анализ аминокислотного состава белков 78

14. Равновесное центрифугирование 78

15. Приготовление белков для физических исследований 79

16. Определение концентрации белка в растворе 80

17. Вычисление коэффициентов молярной экстинкции. 80

18. Спектрофотометрические измерения 81

19. Измерение спектров кругового дихроизма 82

20. Определение вторичной структуры из спектров кругового дихроизма 83

21. Спектры протонного магнитного резонанса (ПМР) 85

22. Сканирующая микрокалориметрия 85

23. Нейтронное рассеяние 86

24. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей 87

6 Результаты и обсудцение

1. Растворимость рибосомных белков 91

1. Введение 91

2. Постановка задачи 91

3. Подбор буферов для оптических исследований рибосомных белков 92

4. Подбор буферов для изучения третичной струк туры рибосомных белков методами ПМР-спектроскопии и нейтронного рассеяния 993

5. Резюме 93

7. Спектры поглощения в ближней ультрафиолетовой области и коэффициенты молярной экстинкции индивидуальных рибосомных белков из 30S субчастицы 94

1. Постановка задачи 94

2. Спектры поглощения индивидуальных белков в ближней ультрафиолетовой области 95

3. Коэффициенты молярной экстинкции индивидуальных белков 30S субчастицы 104

8. Спектры кругового дихроизма индивидуальных белков 30S субчастицы рибосом 106

1. Введение 106

2. Постановка задачи 107

3. Характеристика спектров кругового дихроизма белков 30S субчастицы рибосом 108

4. Расчет содержания различных типов вторичной структуры белков 30S субчастицы рибосом 117

9. Третичная структура и компактность "сердцевинных" белков S4, S7, S8, S15 и S16 из малой субчас тицы рибосом E.coli в растворе 119

1. Введение 119

2. Конформация белка S4 в растворе 119

3. Конформация белка S15 в растворе 130

4. Конформация белка S7 в растворе 135

5. Конформация белка S8 в растворе 140

6. Конформация белка S16 в растворе 143

10. Обсуждение результатов 153

1. Спектры поглощения рибосомных белков 30S субчастицы 153

2. Вторичная структура рибосомных белков 30S субчастицы 154

3. Третичная структура сердцевинных белков S4, S7, S8, S15 и S16 157

4. Заключительные замечания 164

Выводы 166

• Построение рибосом из двух неравных субчастиц.
• Состав и некоторые физико-химические характеристики рибосомных белков 30S субчастицы Е.соїі
• Полиакриламидный гель-электрофорез рибосомных белков в присутствии додецилсулъфата натрия в пластинах
• Характеристика спектров кругового дихроизма белков 30S субчастицы рибосом

Введение к работе

Структурное исследование рибосом является одной из интереснейших задач молекулярной биологии. В этой молекулярной "машине" используются самые разнообразные формы молекулярного взаимодействия и организации. Исследование рибосом важно для изучения структуры и функций высокомолекулярной РНК, белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий. Кроме того, рибосома является объектом для глубокого изучения принципов самосборки сложных биологических объектов. Пожалуй, нет ни одной области структурных исследований в молекулярной биологии, вплоть до изучения конвергенционнои эволюции биомолекул, интересы которой так или иначе не пересекались бы с определенными областями структурного исследования рибосом. Такая многоплановость рибосомы как объекта исследования объясняется исключительной сложностью этой субмикроскопической частицы.

Уже первые структурные исследования рибосом дали важные результаты относительно принципов строения нуклеопротеидных частиц: это обнаружение высокополимерной РНК, открытие асимметричности нуклеопротеидной частицы, выяснение каркасной роли высокополимерной РНК в организации четвертичной структуры макромолекул, получение биологически активных частиц из индивидуальных компонентов (т.е. имитация самосборки in vivo ), обнаружение универсальности четвертичной структуры рибосом и консервативности в третичной структуре многих ее компонентов.

Однако, выяснение детальной структурной организации рибосомы с высоким пространственным разрешением затруднено из-за чрезвычайно сложной ее организации. Поэтому, усилия многих исследователей сосредоточились на изучении изолированных структурных компонентов рибосомы и на применении непрямых путей для установления пространственного расположения и конформации этих компонентов в составе рибосомы.

Изучение структуры изолированных компонентов рибосом является одним из возможных путей приближенного изучения детальной структуры рибосомы. При таком подходе, естественно, возникает вопрос о соответствии структуры рибоеомных компонентов в составе частиц и в свободном состоянии. Однако, некоторые принципиальные вопросы могут быть решены и в этом случае так, например, вопрос о способности компонентов рибосомы к формированию определенной пространственной структуры в изолизованном состоянии. Выяснение этого вопроса представляется особенно интересным с той точки зрения, что рибосома является самособирающейся частицей.

К началу этой работы о свойствах изолированных рибоеомных белков было известно очень мало, и имевшиеся данные носили во многом противоречивый характер. Единственное, в чем сходились мнения многих авторов, это то, что, по-видимому, большинство рибоеомных белков в изолированном состоянии имеет малое число внутренних контактов и по сути является белками, не способными самостоятельно формировать уникальную пространственную структуру.

Представление о неструктурированности изолированных рибоеомных белков в растворе находилось в согласии с данными, по-

лученными методом иммунно-электроннои микроскопии, о вытянутой и даже разветвленной конформации многих рибосомных белков in situ /103, 105, 109/. Таким образом, к 1978 г. благодаря совокупности всех имевшихся к тому времени экспериментальных данных, сложилось представление о рибосомных белках, как особом классе белков, которые в изолированном состоянии не имеют сформированной пространственной структуры, а в составе рибо-сомной субчастицы, благодаря взаимодействиям с РНК и друг с другом, принимают вытянутую, а в отдельных случаях даже нитевидную, конформацию. Эти необычные свойства рибосомных белков заставили обратить внимание на их первичную структуру в силу общепринятых представлений о том, что первичная структура белков определяет в конечном счете их вторичную и третичную структуру. Однако, в аминокислотном составе рибосомных белков не было обнаружено каких-либо уникальных особенностей, более того, анализ первичных последовательностей указал на возможность формирования обычной глобулярной конформации для ряда рибосомных белков /217/. Кроме того, опубликованные в 1978 году данные, полученные в нашем институте показали, что при тщательной ренатурации и подготовке препаратов белков для измерения их свойств физическими методами, по крайней мере некоторые из них в изолированном состоянии обладают характеристиками, типичными для нормальных глобулярных белков /170,222/. Эти результаты поставили под сомнение вывод о вытянутой конформации рибосомных белков и показали необходимость тщательного исследования структуры рибосомных белков в растворе.

Задача, стоявшая:, перед нами, заключалась в получении оптических характеристик индивидуальных белков 30S субчастицы

и более подробном исследовании конформации так называемых сердцевинных белков S4, S7, S8, S15 и SI6, три из которых, по данным литературы считались классическим; примером вытянутых белков, обладающих якобы малым количеством внутренних контактов.

Для исключения возможности артефактов исследование структуры белков проводилось с применением совокупности физико-химических методов исследования, а именно: кругового дихроизма, ПМР-спектроскопии высокого разрешения, сканирующей микрокалориметрии, нейтронного и малоуглового рентгеновского рассеяния. Целью работы было получение однозначного вывода относительно конформации исследовавшихся рибосомных белков в растворе на основе данных, полученных различными методами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРУКТУРА МАЛОЙ СУБЧАСТЙЦЫ БАКТЕРМЛЬНОИ РИБОСОМЫ И ЕЕ КОМПОНЕНТОВ

,1. УНИВЕРСАЛЬНЫЕ ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИЙ РИБОСОМ

I. Общая характеристика рибосом

В электронном микроскопе рибосомы выглядят как компактные

о округлые частицы размером около 250 А. Молекулярный вес рибосом примерно 2,3 х Ю^б /258, 45, 50, 47, 46/ и коэффициент седиментации примерно 70S . Химически рибосома представляет собой рибонуклеопрогеид. В рибосомах E^coli 63% от сухого веса приходится на РНК, а 37% на белок. Необходимыми низкомолекулярными компонентами интактных рибосом являются ионы Mg²⁺ (от части и Са^⁺), а также ионы К⁺ и/или нн . Рибосомы могут содержать определенное количество диаминов и полиаминов (путренцина, кадаверина, спермидина и др.) /25/.

2. Построение рибосом из двух неравных субчастиц

Рибосомы всех организмов представляют собой комплекс двух лабильно ассоцированных субчастиц. Это отчетливо проявляется при понижении концентрации щелочноземельных катионов в растворе: рибосомы обратимо диссоцируют на две неравные субчастицы. Диссоциация на две неравные субчастицы - универсальное явление, свойственное рибосомам всех организмов. В частности, прокариотические 70S рибосомы диссоцируют на 30S и 50S субчастицы /218/. Построение рибосом из двух неравных субчастиц, было обнаружено и при электронно-микроскопических наблюдениях /98/. На рис.1 показана модель рибосомы E^coli , построенная на основании электронно-микроскопических исследо-

Рис.1, Модель 70S рибосомы Е.еоіі в двух проекциях 30S субчастица - светлая частица; 50S - темная /273/.

ваний Д.В.Васильева /273/

Малая 30S субчастица рибосом Е.соіі имеет молекулярный вес около 0,847 х 10 . В электронном микроскопе 30S субчастица выглядит как вытянутая ассиметричная структура с соотно-

шением осей 2:1 и длиной 230 А. Морфологически малую 30S субчастицу подразделяют на головку, тело и боковой выступ, отделяемый от тела глубокой бороздкой /б, 229/.

Измерения размеров и формы 30S субчастицы методом малоуглового рентгеновского диффузного рассеяния дают радиус инер-

ции около 70 А, что соответствует компактной частице такого молекулярного веса. Из анализа кривой малоуглового диффузного рентгеновского рассеяния следует та^же, что эту частицу можно приблизительно аппроксимировать еішюонуїому.: эллйпе'о"йдувращения с соотношентем осей 1:2 /167/.

Рибосомная РНК 30S субчастицы E.coli , составляющая 61% сухого веса, представлена одной ковалентно-непрерывной молекулой с молекулярным весом 0,5 х 10 /45,50,113/. Коэффициент седиментации изолированной РНК в безмагниевом буфере в присутствии одновалентных катионов равен 16S.

Белковый компонент 30S субчастицы рибосом E.coli состоит из двадцати одного полипептида /ИЗ, 106, 255/. Исследование распределения бежового и РНК-вого компонентов в субчастице методом вариации контраста в нейтронном рассеянии показало, что основная часть РНК расположена ближе к центру масс субчастицы, а белковый компонент ближе к периферии /187, 141/.

Большая 50S субчастица рибосом 5^Soli имеет молекулярный вес 1,45 х 10 . Электронно-микроскопическими исследованиями было показано, что ее форма напоминает скошенную полусферу со

сложным рельєфом поверхностей. Модель 50S субчастицы, построенная В.Д.Васильевым на основании анализа электронно-микроскопических микрофотографий показана на рис.1 /236, 235/. Более или менее отличающиеся модели 50S субчастицы рибосом E.coli в разное время были опубликованы в работах /2IQ;118, 197/. Исследование 50S субчастицы методом малоуглового диффузного рентгеновского рассеяния показало, что она является компактной субчастицей, форму которой можно аппроксимировать эллипсоидом вращения с соотношением осей 2:1 с одной уплощенной стороной /91, 185/.

В 50S субчастицах E.coli РНК составляет 67,5% сухого веса. Рибосомная РНК большой субчастицы прокариотических организмов всегда представлена двумя молекулами РНК, которые в безмагниевом растворе в присутствии моновалентных катионов имеют коэффициенты седиментации, соответственно 23S и 5S. 23S РНК рибосом E^coli_ имеет молекулярный вес 9,-4-2 х Ю^б, a 5S РНК - 39000. Белковый компонент 50S субчастицы состоит из 32 индивидуальных полипептидов. Бее рибосомные белки, по-видимому, содержатся в количестве одной копии на рибосому, и только белок Ь7(Ы2) имеется в четырех копиях на рибосому /87/.

Итак, построение рибосомы из двух неравных субчастиц, является отличительной чертой структуры рибосомы. Такой принцип организации рибосом,как оказалось, имеет важное функциональное значение* - -..': ' "":. І- В опытах in vivo и in vitro было показано, что после завершения синтеза полипептида на рибосоме происходит диссоциация рибосом на субчастицы / 103,104-/» Наличие свободных субчастиц в растворе оказалось необходимым и для образования инициаторного комплекса /132, 159, 76, 66,

166, 156/, Кроме того, есть веские основания считать, что определенная подвижность субчастиц в ассоциированном состоянии необходима для элонгационного процесса, так как избыточная стабилизация ассоциированного состояния рибосом (ионами магния, спиртом, полиаминами и т.п.) всегда ингибирует синтез белка /202, 201/.

3. Другие характерные особенности структуры рибосом

Каждая рибосомная субчастица имеет сложный набор разнообразных полипептидных цепей. Этот факт был обнаружен Уоллером при изучении белкового состава прокариотических рибосом /247, 248/. Впоследствии множественность рибосомных белков была показана и в эукариотических клетках /249/, В настоящее время все входящие в состав рибосомы полипептиды могут быть охарактеризованы как индивидуальные белки /223/.

Рибосомные субчастицы могут быть рассмотрены, как рибонук-леопротеидные тяжи, свернутые в компактную структуру. Этот принцип структурной организации рибосом был открыт и сформулирован после обнаружения у рибосомных субчастиц способности разворачиваться в рибонуклеопротеидные тяжи в безмагниевом гипотоническом растворе, причем сколь-нибудь заметной потери белков в процессе разворачивания не происходило /21, 198, 22/. При разворачивании происходит резкое уменьшение коэффициентов седиментации субчастиц и увеличение удельной вязкости. Было установлено, что разворачивание рибосомных субчастиц представляет собой многоступенчатый процесс /25, 145, 202, 2, 72, 9, 75, 250, 145/.

Таким образом, оказалось, что белковые молекулы могут удерживаться на рибосомной РНК не зависимо от нативяой четвертичной структуры рибосомных субчастиц. Следовательно, рибосом-ная РНК может рассматриваться как ковалентно-непрерывный каркас, специфическая структура которого определяет уникальное расположение рибосомных белков /25, 21, 198, 22, 2/.

4. Разборка и самосборка рибосомных субчастиц

При обработке интактных рибосомных частиц высокими концентрациями солей одновалентных металлов, происходит диссоциация рибосомных белков /9, 137, 199, 23, 125, IOO/. Белки диссоциирующие под воздействием высоких концентраций солей в присутствии ионов Mg²⁺ получили название "дополнительных ри-босомообразующих" или "отщепляемых" ("split") белков, а белки, которые отщепляются при воздействии высоких концентраций соли только в отсутствие ионов магния получили название "основных структурных" или "сердцевидных" ("core") белков /25, 199, 125, 100/.

Отщепление рибосомных белков под действием высоких концентраций солей протекает довольно дискретными группами /199, 23, 125/. Диссоциация одних белков вызывает более легкое отщепление других белков /25/. Следует отметить, что порядок диссоциации рибосомяых белков изменяется при добавлении мочевины в солевой раствор /205/. Порядок диссоциации белков также изменяется, если диссоциацию проводить с помощью уксусной кислоты /181/. Содержание ионов Mg в среде влияет на величину концентрации соли, необходимую для диссоциации определенных бел-

ков /199, 23, 125, 100/.

Процесс, обратныйрвбэрки.хубшет1!щг - это самосборка ри-босомных субчастиц из РНК и белковых молекул. В процессе самосборки субчастиц особенно отчетливо проявляется каркасная роль рибосомной РНК. В работах /198, 30/ впервые было показано, что белок-дефицитные РНП-частицы, образующиеся в клетках E.coli в присутствии хлорамфеникола, связывают свободные рибосомные белки, образуя частицы, по физическим свойствам не отличимые от рибосомных субчастиц. Затем, сборка аналогичных частиц была проведена из РНП-частиц, которые образуются при отделении части белка от субчастиц рибосом и свободных рибосомных белков /23, 125, 200, 95, 206, 24/» Затем, были найдены условия, в которых биологически активные 30s и 50s субчастицы были реконструированы из свободной рибосомной РНК и свободных рибосомных белков /220, 160, 65, 155/.

Подробное исследование процесса самосборки 30S субчастицы рибосом E.coli показало, что процесс самосборки протекает в два основных этапа /220, 161, 90, 221/. Сначала к I6S РНК присоединяются 12-15 белков, вследствие чего получаются так называемые RI-частицы. Эти частицы присоединяют остальные 6-9 белков только после активирования RI-частиц. При активации RI-частиц, которая осуществляется прогреванием при 35-45С, происходит перестройка РНП-тяжа /90, 221, 17/. При исследовании взаимодействия индивидуальных рибосомных белков 30S субчастицы с I6S РНК оказалось, что ряд белков (S4, S7, S8, S13, S15, S17, S20) способен непосредственно присоединиться к I6S РНК, тогда как остальные белки связываются только с РНК-белковым комплексом.

Путем реконструкции 30S субчастицы в отсутствии одного или нескольких белков были получены различные РНП-частицы, изучен их белковый состав и таким образом определены взаимосвязи между белками во время реконструкции, что позволило составить "карту реконструкции" 30S субчастицы /161, 90, 138/. Близкое расположение белков на "карте реконструкции" часто отражает их физическую близость в 30S субчастице /29/.

її ВЗАИМНОЕ РАСПОЛОЖЕНИЕ БЕЛКОВ И РНК В 30S СУБЧАСТИЦЕ

Выяснение взаимного расположения белков и РНК в интактной субчастице имеет первостепенное значение для изучения ее структуры. Первым этапом в установлении пространственной организации 30S субчастицы рибосом E.coli явилось определение мест связывания белков с 16S РНК /184, 131, 265, 225, 58, 264, 266, 44, 246, 157/. Благодаря знанию первичной структуры I6S РНК /45, 50/, удалось выяснить нуклеотидные последовательности фрагментов, ответственных за связывание определенных белков. Одним из способов выявления таких участков РНК является изучение фрагментов рРНК, защищаемых рРНК-связывающими белками от РНКазной деградации /264, 266, 246, 44/. С помощью такого подхода были выявлеш фрагменты 16S РНК, защищаемые белками S4, S7, S8, S15, S17 и S20 /266/. Оказалось, что длина таких фрагментов сильно варьирует в зависимости от связанного белка (в случае S4, S7 S17 и S20 - это один или несколько длинных фрагментов I6S РНК; в случае S8 и S15 - это по два сравнительно коротких оли-гонуклеотида).

Другим способом исследования топографии белка на РНК является изучение РНП-частиц, получаемых в опытах по реконструкции с использованием фрагментов I6S РНК. Так оказалось, что с 5* -концевым фрагментом I6S РНК (600 нуклеотидов) связываются белки S4, S16, S17, S20} 3' -концевой фрагмент (500 нуклеотидов) связывает белки S7₉ S9, S10, S13,S19;C промежуточным фрагментом, между 5'- и 3'-концевыми фрагментами, (350 нуклеотидов) ассоци-

ируют белки S6, S8, S15,S18 /266, 157/. Такая мягкая обработка РНКазами интактных или частично разрыхленных субчастиц, с получением больших РНП-фрагментов и последующей идентификацией содержащихся в них белков, позволяет выявить не только те белки, которые прямо взаимодействуют с РНК, но и белки, которые прикрепляются к РНК после определенных конформационных изменений, внесенных другими белками /44/ или путем взаимодействия белков друг с другом.

Использование ультрафиолетового облучения и бифункциональных реагентов позволяет ковалентно сшивать РНК и белки, находящиеся в контакте с РНК или в непосредственной близости от нее. Последующее разрушение субчастиц РНКазами, разделительный электрофорез продуктов РНКазной обработки, идентификация белков с помощью антител и определение нуклеотидной последовательности сшиваемых с белками фрагментов РНК позволяет выявить многочисг ленные белок-нуклеиновые контакты /257, 44, 157, 246/. Важно, что данные по сшиванию белков с РНК дали результаты, в целом согласуемые с результатами, полученными другими методами.

Для некоторых белков, например, S4, S20, S7 /266, 157, 246/, были определены участки связывания с РНК, значительно удаленные друг от друга по первичной структуре. Эти данные становятся более понятными, если проследить размещение белков относительно вторичной структуры I6s РНК /157, 40/. В работах /268, 158, 209/. предложены модели вторичной структуры I6S РНК из ряда объектов, в том числе и E.coli . .ЯвШШ'^щдмой. вторичной структуры I6S РНК заключаются в том, что примерно 50% нуклеотидов образуют двухспиралъные участки; довольно часто встречаются взаимодействия с образованием пар из значительно,

удаленных друг от друга по первичной структуре оснований., г ,, В целом, 16s РНК имеет сложную многодоменную структуру, в которой домены соединены между собой двуспиральными перетяжками /157, 40/« По этой модели РНК-связывающие белки располагаются как на внутридоменных участках, так и на междоменных перетяжках, захватывая участки удаленные друг от друга по нуклеотид-ной последовательности, но сближенные во вторичной структуре 16В РНК /157, 40/.

Однако, для получения полной пространственной картины взаимного расположения белков и РНК в субчастице необходимо еще знание того, как укладывается I6S рнк в третичную структуру и как белки расположены друг относительно друга и относительно поверхности субчастицы. Для изучения топографии белков на ин-тактной субчастице были использованы разнообразные методы, а) Изучение комплексов рибосомных белков из 3QS субчастицы. Некоторые рибосомные белки способны образовывать комплексы между собой. В настоящее время тщательно изучены, к сожалению, лишь комплексы белков из большой субчастицы рибосом (ди-мер белка Ъ7» пентамерный комплекс ц- х Ь7*Ы0 /84,27/. Было показано, что при образовании этого комплекса по крайней мере происходит стабилизация конформации в некоторых белках /84 /. В литературе имеются сообщения об обнаружении нескольких белковых комплексов в малой 30S субчастице рибосом: S6-S18 /171/, S18.S21/52, 130/, S3-S4 /179, 171, 88/, S4-S5 /179, 171, 36/, S5-S10 /171/, S4-S20 /36/, S15-S19, S2.S3, S3-S5, S3'S4-S5, S13«S20 /127/. О пространственной близости этих белков свидетельствуют и данные по

сшиванию белков бифункциональными реагентами (см.ниже). Обнаружение таких комплексов очень полезный материал для изучения топографии рибосомных белков in situ . Однако, свойства, стехиометрия, конформация этих белковых комплексов пока не изучены в достаточной мере.

б) Сшивание белков бифункциональными реагентами.
Соседствование белков было исследовано в опытах с примене
нием бифункциональных реагентов (таких как бис-метилсубери-
мидат или бис-имидоэфиры), способных ковалентно связывать
близко расположенные белковые молекулы, с последующей иден
тификацией полученных белковых пар. Таким способом были по
лучены многочисленные белковые пары, находящиеся на близком
расстоянии /2І6Д94-, 195, 64, 39, 212, 224/» Определение
взаиморасположения белков в субчастицах с применением би
функциональных реагентов имеет определенные недостатки: на
его основании можно судить лишь о близости двух реагирующих
групп, тогда как центры масс белков при этом могут находить
ся достаточно далеко друг от друга; кроме того, реагенты и
условия сшивания могут нарушать исходную структуру субчас
тиц.

в) Флуорометрический метод определения расстояния между белками
/_22Л/ В этом случае индивидуальные белки модифицируются
флуоресцентными метками попарно; один из белков несет т.н.
акцепторную, а другой - донорную метку. Меченые белки путем
реконструкции вводятся в субчастицу и измеряется расстояние
между ними. Таким способом было измерено расстояние между

14 парами белков /97/. Применение флуоресцентного метода

также имеет определенные недостатки: во-первых, только малая доля субчастиц несет модифицированный белок и активность модифицированных субчастиц невозможно контролировать; во-вторых, вводимые метки распределены случайным образом и информация о расстояниях между центрами масс белков не может быть получена достаточно достоверно без знания статистического распределения метки на меченых белках.

г) Рассеяние нейтронов. Метод основан на введении путем рекон
струкции дейтерированных белков в состав протонированной
субчастицы. Измерения проводятся в "точке компенсации" рас
сеяния протонированной субчастиыд растворителем. Это дости
гается при определенном соотношении H₂o*DpO в буфере, когда
рассеяние растворителя равняется рассеянию протонированной
субчастицы. В этих условиях измеряется расстояние между дву
мя дейтерированными белками, рассеивающая способность кото
рых отличается от растворителя. В работах /63, 142, 120,182,
193,175/ были измерены расстояния между многочисленными па
рами белков, на основании которых авторами была предложена
трехмерная картина размещения белков на 30S субчастице ри
босом. Несомненным достоинством этого метода является то,
что расстояние измеряется между центрами масс белков в отли
чие от методов рассмотренных в разделе б) ив). Этот метод
тем более надежен, чем больше расстояние между парами дейте
рированных белков.

д) Иммунно-электронная микроскопия. Этот метод, объединяющий
иммунологические и электронно-микроскопические методы, дает
возможность визуализировать местоположение белка на поверх
ности субчастицы. Метод основан на специфическом взаимодейст-

вий антител с белковыми детерминантами на поверхности субчастиц и наблюдении в электронный микроскоп образующихся пар частиц, что позволяет с точностью до размеров антител локализовать место расположения обнаруженных белковых детерминант. В настоящее время есть две довольно различающиеся модели топографии белков на поверхности субчастицы /210, 217, 217,119/ Возможность артефактов при применении этого метода появляется при недостаточной очистке препаратов антител или в случае иммунологического перекреста между белками /253/ (подробно о методе см. раздел Ш ,'3).

Однако, несмотря на перечисленные выше недостатки отдельных методов, при сопоставлении всей совокупности данных вырисовывается достаточно полная картина взаимного расположения белков в 30S субчастице. ^е) Модели. Изучение соседствования белков методом бифункциональных сшивок, а также работы по определению расстояния между белками (флуоресцентные методы и метод нейтронного рассеяния дейтерированных белков) дали возможность построить несколько более или менее различающихся моделей пространственного расположения белков в 30S субчастице /224, 97, 120, 175, 146, 59, 41, 213/. Кроме того,иммунные.электронномикроскопические исследования по локализации антигенных детерминант отдельных белков на поверхности субчастицы позволили двум группам исследователей дать свои довольно отличающиеся модели по топографии рибосомных белков на поверхности 30S субчастицы /210, 217, 119, 117/.

Наконец, в работе /203/ впервые была предпринята попытка построить детальную структуру 30S субчастицы рибосом JUcoli

с применением всех имеющихся данных относительно конформации и топографии ее компонентов. Для построения модели четвертичной структуры 30S субчастицы были приняты два допущения:

1. форма I6S РНК in situ принципиально не отличается от формы, полученный в компактизирующих условиях методом электронной микроскопии'(см. раздел Ш.І);

2. все, или почти все белки, входящие в состав 30S субчастицы имеют компактную глобулярную конформацию. Для размещения белков на полинуклеотидном остове I6S РНК авторами была проделана большая работа по критическому отбору наиболее достоверных сведений, полученных разными авторами и разными методами: I) по изучению саседствования и определению расстояния между белками; 2) по изучению топографии белков на I6S РНК; 3) по определению мест локализации белков на поверхности 30S субчастицы; 4) по определению белков, расположенных на контактирующей с 50S субчастицей поверхности 30S субчастицы. Критерий отбора предполагал полное совпадение различных данных по топографии белка на 30S субчастице или совпадение данных, полученных по крайней мере тремя методами. В результате такого отбора данных удалось достоверно локализовать на поверхности I6S РНК все белки, за исключением S1, S2, S11 и

S21 позиции которых, по мнению авторов, определены с меньшей степенью достоверности. Модель четвертичной структуры 30S субчастицы рибосомы E^coli приведена на рис.2 Модель, полученная в этой работе была подвергнута проверке и показала хорошее согласование с экспериментальными

го ел

Рис.2. Модель четвертичной структуры 30S рибооомной субчастицы в двух проекциях /203/.

данными по изучению интактной субчастицы с помощью рассеяния рентгеновских и нейтронных лучей /203/.

ИГ. СТРУКТУРА КОМПОНЕНТОВ 30S СУБЧАСТИЦЫ РИБОСОМ

I. Конформация I6S РНК в растворе и в составе 30S субчастицы.

Сформулированный А.С.Спиршшм принцип рибонуклеопротеид-ного тяжа /21, 198, 22/ поставил ряд вопросов перед исследователями: на каком структурном уровне осуществляет свою каркасную роль рибосомная РНК, способна ли свободная рибосомная РНК в растворе образовывать третичную структуру и если способна, то в какой мере эта структура сопоставима со структурой компактной рибосомной частицы?

Для ответа на эти вопросы был проведен цикл работ по сравнительному электронно-микроскопическому изучению РНП-частиц, полученных в ходе последовательной контролируемой диссоциации части белков от 30S субчастицы /230, 231, 232, 233/. Электронно-микроскопическое исследование РНП-производных и собственно I6S РНК было связано с большими экспериментальными трудностями так как по мере "раздевания" субчастиц возрастала их кон-формационная неустойчивость. Авторами был разработан оригинальный метод фиксации максимально компактизованного препарата быстрым замораживанием в жидком азоте с последующим высушиванием в вакууме и оттенением тугоплавкими металлами /234/» Полученные результаты показали что:

I) потеря 30S субчастицей, по крайней мере,половины рибосомных белков (РНП-частица с коэффициентом седиментации ^25s ) не приводит к существенному изменению ее размеров и морфологии /230/.

2. РНП-производные 30s субчастицы, содержащие всего четыре белка S4-, S7, S8, S15 (частицы с коэффициентом седиментации 23,5S ), сохраняют все основные морфологические признаки исходных 30S субчастиц, хотя и в меньшей мере: частицы имеют меньший размер головки, более уплощены, имеют менее четкие очертания /231/;

3. комплекс I6S РНК с белком S4 (коэффициент седиментации частицы ~22,5S ) имеет специфическую V-образную форму, причем одно плечо толще другого и имеет на конце утолщение / 232/;

4. I6S РНК, полученная в компактной форме (буфер 0,03 М СН3СООНН4, 0,006 М (CH₃C00)₂Mg IM этанол, рН 7,5; коэффициент седиментации - 21,5S ) состоит из вытянутых частиц

. о с соотношением осей 2:1 и длиной 240 ^х 20 А /233/»

На рис.3 представлена модель I6S РНК, построенная на основании электронно-микроскопических микрофотографий, полученных В.Д.Васильевым /233/. Частица имеет V- или Y-образную

форму с разными по длине и толщине плечами (толщина большого

о о и мало плеча оценена соответственно 60 А и 40 А). Малое плечо V-образной частицы слегка озогнуто в перпендикулярной плоскости и при вращении частицы вокруг продольной оси дает изображение Y-образной формы.

Из сопоставления структур 30S субчастицы рибосом и I6S РНК было установлено, что большое плечо I6S РНК является стержнем субчастицы, причем конец плеча формирует ее головку, а малое плечо формирует боковой выступ субчастицы. Из сопоставления также следует, что рибосомные белки в основном должны быть сгруппированны в головке и верхней части тела субчас-

ISO"

fto.3. Контуры молекулы 168 Hffi в компактной форме
(заштрихованы) и зоз субчастицы в различных
проекциях /233/. ^^

тицы /230, 231, 232, 233/.

Надо отметить, что изучение конформации компактизованной 23S РНК из 50S субчастицы электронно-микроскопическим методом показало, что и 23S РНК также является трехмерным каркасом для размещения белков /235/.

При сравнении электронно-микроскопических изображений 30S субчастицы и ее РНП-производных вплоть до I6S РНК прослеживалась тенденция к увеличению линейных размеров частиц, т.е. некоторое уменьшение компактности РНК. Об этом свидетельствовали кривые рассеяния рентгеновских и нейтронных лучей, полученные для I6S РНК как в составе интактных 30S субчастиц, так и в изолированном состоянии /191, 187, 37/. Проведенное недавно исследование компактности I6S РНК в составе 30S субчастицы, в составе ее РНП-производных и в изолированном виде

/ 191/ показало, что радиус инерции I6S РНК в составе 30S

о о

субчастицы 66 А, а в свободном виде 86 А, что соответствует

увеличению линейных размеров изолированной I6S РНК примерно

на 1/4. Форма изолированной 16S РНК в условиях, оптимальных

для реконструкции весьма близка к форме I6S РНК в составе 30S

субчастицы. I6S РНК в комплексе с белком S4- (радиус инерции

о РНК 85 ^± 3 А) или с белками S4, S7, S8, S15 (радиус инерции

, о РНК 83 * 2 А) имеет компактность, близкую к компактности изолированной I6S РНК. I6S РНК в составе комплекса с белками

о S4, S7, S8, S15, S16 и S17 имеет радиус инерции 70 А, что

говорит о том, что присоединение этих белков к I6S РНК необходимо и достаточно для придания I6S РНК компактности, подобной таковой в составе 30S субчастицы. Этот комплекс I6S РНК

с шестью белками был получен как "раздеванием 30S субчастицы под действием высокой концентрации соли, так и путем реконструкции из изолированной I6S РНК и индивидуальных белков. Авторы этой работы, однако, не исключают, что присоединение остальных белков может вызвать окончательное, правда очень небольшое, сворачивание I6S РНК /191/.

Таким образом, на основании вышеприведенных работ, можно считать, что I6S РНК заключает в себе ряд основных черт ри-босомной субчастицы и может служить готовым трехмерным каркасом для размещения рибосомных белков /230, 231, 232, 233, 191/.

2. Состав и некоторые физико-химические характеристики рибосомных белков 30S субчастицы E.coli

В составе 30S субчастицы рибосом E.coli обнаруживается 21 различная полипептидная цепь /106, 255, 223, 83, 214, 114/. Все белки 30S субчастицы могут быть разделены методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле /106, 105/. Белки малой субчастицы рибосом E.coli обозначают буквой s , в отличие от белков большой субчастицы, обозначаемых буквой ъ , и им присваивается номер в соответствии с положением на двумерной электрофореграше, причем, чем выше электроподвижность белка во втором направлении, тем больше его номер /106, 255/.

Молекулярные веса белков 30S субчастицы варьируют от 8500 до 27000, белок S1 имеет молекулярный вес 6II59 /258/. Полная аминокислотная последовательность ; всех ' белков уже известна /111,262,43, 176, 261, 94, 177, 33, 244, 109,55,69, 126, 147, 239, 242, 241, 243, 260, 227, 87/, Все белки имеют различную первичную структуру, не было обнаружено и заметных гомологичных аминокислотных последовательностей у разных

истчычо і h-i -а- см n-v

3 HI

Я Й

-4-СМЧ>-3--Ч-»-НЧіС>-Ч> I C-CM-d-r-M-d-lAfAC^-i-lfA

2 Ж

CO CD C-

ЮМЧЭ'ЛсдщСМ'ЛОИСМ | U) ІЛ ф ІЛ H \C W I M

Г> t> гл

t-H Щ CO СЛ

d-0MU>^-C^tHC4J-l

U3 СП OJ

.*.*N>""»mf\jr\JVOM 1 СО»НчО-*»-Н.З-С\|ілО»-<^

1-І О Г- <\J

іл n ^ уз іл іл і що- і mt-tf^cMraojij-vo

и ^ CO

О a

в>1Л*ЛСМС0-=*-1Л-*тМЫт CVJjtCOVH^hHMJ-HCQ

ж Й

^w Э

CMVD4DVOPJ^J-t-((-i

СМСМСТ»О0ЫК%ии^ I C\j

CM О НЛ

И УД w

(\j «J

МіЛС0«)4^,^>Н^^іП

1-і 1 ГЛСО-З-НЧК^гОїЛ I C\

1-І CM CO <\J

a *л »л ел -p ь

J-t>CT\\D-*N^C0^D-M^-K\CT\^J-i-HO

со i-н (-и cn а о

гчоос\]сог\)чоч0іл-*(г» і с\смсї>Омс\іглілс\і і .з

3 3"

(Л Ц) Ю N «Я Ш

СО ил CM t-н ~' '

-3-іЛГ-ЧОЧО""\глО I ОК\Г-С7\т-4-і-«ОСО 1 in

en rg ел

VO^^DOCnminn-tf^HOJinC^Orn*"» I CM CO ІГЛ

О- НЛ t>

CO C- t> CM

а к и a

ІЛР*ІЛІЛ-*(Г\ООС\1 I VD^fiAVO^riAf^^-COOJc-

o- i^ in"

CO M I »-4 >4 40

а-з-о-а-см-з-тіл-* і оог-и"\.э-.з-ч>чэ<м

и in из

vrf ол d

in і 7

С⁴- t-t CT\

VOOCTifM^t 4- tM О

^ 03 M if

cocovooc-cT44omcot--«v0

« n

n w w

« tn N-ї f\J

СІ О *-)

белков 30S субчастицы.. Аминокислотный состав, изоэлектричес-кие точки /94, 107, 211/, молекулярные веса, рассчитанные из первичной структуры и другие важные характеристики белков 30S субчастицы приведены в таблице I. Из приведенных в таблице I данных видно, что белки 30S субчастицы рибосом E.coli имеют сильно выраженный основной характер (20-30% составляют основные аминокислоты). В целом, аминокислотный состав рибосомных белков обычный, характерный для глобулярных белков, йзоэлек-трическая точка для большинства белков (кроме S1, S2, S6, S10 ) выше 9.

Все белки 30S субчастицы содержатся в количестве не более одной копии на субчастицу /139, 87/.

3. Конформация рибосомных белков в ооофаве малой. ЪО - суб* Частицы:.рибосом.

Первые попытки исследовать конформацию рибосомного белка в составе рибосом были предприняты с помощью изучения спектров кругового дихроизма в дальней ультрафиолетой области /136,180/. Полученные результаты указывали на наличие -спиральных~;участ-ков в белковом компоненте рибосом. Общее содержание с-спи-ральной структуры в белке рибосом было оценено в 30%, Эти данные позволили предположить, что по крайней мере часть молекул рибосомных белков являются молекулами глобулярного типа. Отметим, что более поздние исследования в основном подтвердили эти данные по оценке содержания об-структуры в рибосомных белках /60, 48/»

Другой точкой зрения было сложившееся к 1978 году представление о сильно вытянутой и даже разветвленной форме большинства рибосомішх белков в составе рибосомы. Эта точка зрения получила широкое распространение, в основном, благодаря данным иммунно-электронной микроскопии /210, 119/, и нам хотелось бы подробнее остановиться на этих результатах, в свое время сильно повлиявших на формирование представлений о структуре рибосом-ных белков.

Метод имунно-электронной микроскопии основан на специфическом взаимодействии антител с белковыми детерминантами на поверхности частиц и наблюдении в электронный микроскоп образующихся пар частиц, что позволяет с точностью до размеров антител локализовать место расположения обнаруженных белковых детерминант. Специфика интерпретации данных, полученных этим методом заключается в том, что в случае белков, имеющих одну точку связывания антител на поверхности частицы, нельзя сказать что-либо определенное об их конформации.Зато для белков, имеющих по два или более удаленных друг от друга места связывания антител (в случае, если это не связано с загрязнением препарата антител) можно говорить о вытянутой структуре.

Методом имунно-электронной микроскопии особенно подробно были изучены белки 30S субчастицы рибосом E.coli . В работах, проведенных группой Штоффлера /210, 217/, сообщается, что для белков si, S8, S13, S14, S19, S20 и S21 обнаружено по одной антигенной детерминанте на поверхности субчастицы, в случае остальных 14-ти белков, антитела связываются в двух, трех, четырех местах. Среди белков, которые имеют два места связыва-

ния антител, в случае S3, S6, S9, S10, S16, S17, эти антигенные детерминанты были расположены довольно близко друг от друга. Однако, расстояния между антигенными детерминантами для белков S2, S4, S5, S7, S11, S12, si5_f S18 были слишком велики, чтобы согласовываться с глобулярной формой белков. Так, например, для белка S15, состоящего всего из 87 аминокислотных остатков, одна антигенная детерминанта была обнаружена в верхней части "головки", другая - в нижней части "тела" 30s субчастицы /217/. На основании этих данных делался вывод о вытянутой, или даже фибрилярной структуре многих белков в составе 30S субчастицы. Были вычислены размеры всех белков 30s субчастицы /70/, причем для четырнадцати из них принималась вытянутая конформация. Наиболее вытянутыми считались белки S4,

о S7, S11, S15, S18 , длина которых оценивалась в 200-240 А,

о а диаметр в 10-17 А /70/. Аналогичные эксперименты по имунно-

электропной микроскопии, проведенные группой Лейка /119, 116, 117, 118/ привели к несколько отличительным от данных группы Шгоффлера результатам. В частности, для многих белков количество выявляемых антигенных детерминантуменьшилось, что в результате резко сократило число белков, для которых предполагалась вытянутая конформация. Так, число вытянутых белков уменьшилось

до семи, а длина наиболее вытянутых белков ( S6, S15, S18 и

о S19) была оценена в 100-130 А. Данные о форме и размерах белков 30S субчастицы, рассчитанные на основании двух имунно-электронномикроскопических моделей приведены в таблице 2. На противоречивый характер этих данных в какой-то мере проливают свет две работы, говорящие о возможности артефактов при приме-

Таблица 2

Форма и размеры белков 30s субчастицы иммунно-электронномикроскопических моделей /71/

Продолжение таблицы 2.

* - данные по модели Лейка и Кахана /119, 116, 117, 118/; остальные данные - по модели группы Штоффлера /210, 217/.

нении метода иммунно-электронной микроскопии. Так, в работе /119/ сообщалось, что возможны иммунологические перекрестные реакции между разными белками (S4 и S7, в частности). Более того, в работе /253/ сообщалось, что в случае белка S4 , который по данным группы Штоффлера имел четыре антигенных детерминанты на поверхности субчастицы /210, 217/, при примении тщательно очищенных препаратов антител не удалось выявить ни одной антигенной детерминанты. Доступность белка S4 появлялась лишь после частичной делротеинизации субчастицы (после удаления белков S5 и S12 ) /253/. Эти данные поставили под сомнение вывод о вытянутой кон-формации рибосомных белков в составе интактной 30s субчастицы.

4. Конформация изолированных рибосомных белков в растворе.

После разработки процедуры выделения индивидуальных рибосомных белков в изолированном виде ( см.главу іу) в ряде лабораторий начались широкие исследования структуры белков в растворе физическими методами. Вся совокупность имеющихся литературных данных может быть разбита на две группы. К первой группе относятся экспериментальные данные, которые казалось бы неопровержимо свидетельствовали в пользу того, что в растворе индивидуальные рибосомные белки являются сильно асимметрчными или развернутыми структурами.

Исследование третичной структуры рибосомных белков было проведено методом ПМР-спеятроек опии для ряда рибосомных белков /150, Ш, Г4'9, 129 , 143, 228/. Так для одиннадцати из пятнадцати исследованных в работах /150, І48/ белков (S3, S4, S5,

S6, S7, S8, S9, S11, S12, S13, S16, S18, S20, S21) спект-

ры ПМР не отличались или почти не отличались от спектров белков,' снятых в присутствии мочевины. Это свидетельствовало о полном или почти полном отсутствии уникальной третичной структуры в исследованных препаратах белков /Й8/. Только в белках S4» S15 и S16 были обнаружены определенные элементы третичной структуры /150, ]#8/.

В спектрах этих трех белков авторы наблюдали незначительное уширение и смещение некоторых сигналов относительно их положения в денатурирующих условиях. По мнению авторов этих работ в исследованных ими белках S4, S15 и S16 имеется очень слаборазвитая, экспонированная подвижная область с элементами третичной структуры.

Действительно, как показывает например анализ, в спектре белка S4 имеется лишь один слабый сигнал в высокопольной области (сигналы в области очень высокого поля характерны для белков хорошо выраженной третичной структурой* Анализ спектра ПМР в области низкого поля (где вклад вносят протоны", ароматических и гистидиновых остатков) показывает, что лишь один тирозин (из восьми тирозиновых остатков) и один гистидин (из трех остатков гистидинов) принимает участие в образовании третичной структуры /150,176/.

В работе /14-9/_гтой же группой, что и в работах /150, 148/ было проведено исследование третичной структуры рибосомных белков S8, S16 и S20, выделенных без применения жестких денатурирующих агентов. Было показано, что в спектрах ПМР белков S8 и S16, полученных методом солевой экстракции имелись несколько больше признаков развитой третичной структуры /149/ нежели

в препаратах, исследованных в работе /148»/.

Компактность и форма индивидуальных рибосомных белков исследовалась с помощью рассеяния рентгеновских лучей /121, 164!, 115, 1'Ш>» К8» 162, 163/ седиментации, диффузии и вязкости /121, ,78, Щі 170, 8, 168, '.73, 171, .'77, '72/. Результаты этих исследований приведены в таблице 3. В таблице 3 приведены краткие сведения и о способе выделения препарата индивидуального белка и способе ренатурации из денатурирующих увловиях.

Проведенные измерения радиусов инерции некоторых рибосомных белков методом малоуглового рентгеновского рассеяния показали, что полученные значения радиусов инерции относительно велики /121, Г64, 115, лв5, 1-68, 162, 163,187/. Они в 1,5-2 раза превышали значения.-, радиусов инерции глобуиярных белков того же молекулярного веса. Так, например, для радиуса инерции белка S3

было получено значение ЗІ А l'SS-J% Д^ля белка S4 - несколько

ооо значений: 34 А /Ъ8/_% 42 А /162/, 26 А /;85 /; для белка S7 -

ооо 27 А /85У, для белка S8 - 23 А /164/, для белка S15 - 26 А

/К'4/ и т.д. (см.таблицу 3). Еще большие значения радиусов инерции были получены для белков S1 . Они оказались сравнимы с раз-

ооо мерами целой рибосомной субчастицы: 58 А /121/, 72 A /164/,80 А

/Поданные по седиментации, диффузии и вязкости свидетельствовали о больших значениях стоксовских гидродинамических радиусов по сравнению с таковыми для глобулярных белков того же молекулярного веса (за исключением белков S8 и S17 , см.табл.3). Таким образом, все экспериментальные данные, полученные на препаратах индивидуальных белков, выделенных разными мето-

Таблица З Изучение формы рибосэмных белков 30S субчастицы физическими методами /258/

Гидродинамические методы

| Метод малоуглового диффузного рентгеновского

Белов !

рассеяния

І метод | радиус { _пая1|вш + ! полу- ! инерции I Р^а|иеры ! чения*! ₍jg J (Я)

I источ- Іметод !отношение ! фрикционный ІИСТОЧНИ

! ния Ідолу-.,! осей ! коэффициент данных

! дан- 1чения ! !

/121/ /16*/

! ных ! ! ! і

а,б* а

/121/ /78/

10:1 7,5-11:1

L⁷ * 1,7; 1,55^в

58(*3,5) вытянутый эллипсов А =220) 190-260), В=2

72 У-обрааная форма

а" а

/179/ /168/

1,6 1,69^s

2 эллиптических цилиндра: Н=220, А=20, В=8

/168/

/162/ /163/

S* а 33,6 палочка, А=140,

б 42 эллипсоид, А=180

В=50, С=8

или палочка А=180х21х21

/85/

а 26 вытянутый, наибольшая длина 100

^ж Метод получения: a - методы с использованием уксусной кислоты или мочевины; а^я - как метод а,
но с ренатурацией в присутствии гуанидинлорида и последующим диализом против буфера для реконстрз
б - метод солевой экстракции; б* - метод экстракции низкой солью /86/.
+ А, В, С - размеры белков по осям,
в - фрикционный коэффициент с поправкой на гидратацию. ГССШРСТ5Е1!!!31

дами казалось бы неопровержимо свидетельствовали в пользу того, что изолированные рибосомные белки имеюте.сильно асимметричную или разупорядоченную структуру.

Исследование вторичной структуры методом кругового дихроизма (КД) было проведено для ряда рибосомных белков /150, 124, .Чз'Фі 245, 121, І69/. В работе /124/ методом КД была определена вторичная структура белков S3, S4, S6, S7 и S8 . В исследованных препаратах индивидуальных белков результаты расчета содержания вторичной структуры показали, что: белок S3 содержит 23$ о^ -спиралей и 24% Ь -формы; белок S4 - 31% о^-спи-ралей и 19% 3-формы; белок S6 - 18% о-спиралей и 24% - _чу6-формы; белок S7 - 50% оС-спиралей и 18% ^/3-формы; белок S8 - 31% od-апиралей и 21% у -формы.

По белку S1 было опубликовано две работы /245, 121/, в которых методом кругового дихроизма была определена вторичная структура, однако, полученные в этих работах спектры кругового дихроизма и рассчитанные из них доли об-спиралей (13% /245Y и 32% /121/) и ^-структуры (31% /2457 и 27% /Ш/) существенно отличаются друг от друга.

По белку S4 было опубликовано еще две работы /150, 34/, в которых методом кругового дихроизма была определена вторичная структура (32% оі-спиралей и около 15% 4-формы). Однако, полученные в этих работах спектры кругового дихроизма отличаются друг от друга как по форме, так и по абсолютной величине эллиптичности.

В свете изложенных выше литературных данных по изучению компактности и формы рибосомных белков обращает на себя внимание расхождения в значениях рентгеновских и гидродинамических

радиусов почти во всех случаях, когда измерения проводились разными авторами (см.табл.3). Аналогичные сложности возникали и при исследовании рибосомных белков другими физическими методами (при исследовании вторичной и третичной структуры). Особенно яро это проявилось при изучении компактности рибосомных белков S4, S7, S8 и S16 методом нейтронного рассеяния /186/. Было показано, что индивидуальные рибосомные белки S4_f S7, S8 и S16 при проведении тщательной ренатурации и подготовки к исследованию имеют компактную к информацию в растворе /186 (рис.4)/. Предпринятое, в Институте белка, дальнейшее подробное изучение конформации индивидуальных рибосомных белков из 30S и 50S субчастиц в растворе, частью которого являются, изложенные в данной диссертации результаты, позволили авторам этих работ высказать принципиально другую точку зрения относительно конформации рибосомных белков. Согласно этой точке зрения, рибосомные белки (по крайней мере большая их часть) представляют собой обычные компактные глобулярные белки. По мнению этих же авторов, истинная причина расхождения в экспериментальных данных, вызвана качеством препаратов рибосомных белков,в том внимании, которое было уделено процессу ренатурации рибосомных белков. Такая точна зрения подкрепляется и теми:- работами, где изучались вопросы ренатурации и подготовки препаратов рибосомных белков к измерению /143, 28-, 269, 270, 271/. Было наглядно показано, что по крайней мере, в отдельных случаях способ ренатурации существенно влияет на конечную конформацию рибосомного белка /269/.

Изложенные выше результаты выдвинули на первый план задачу

(Г

tit L.

Молекулярный вес x 10

стр.ЧЧ

Рис.4. Зависимость радиуса инерции (Rg) от молекулярного веса белков в логарифмических координатах. Открытые кружки соответствуют измерениям в Д^О буфере, проведенных методом нейтронного рассеяния; заштрихованные кружки соответствуют измерениям Н2О буфере, проведенных методом нейтронного рассеяния. Квадраты соответствуют измерениям радиуса инерции лизоцима (Lys) миоглобина (Мв) и гемоглобина (Нв), проведенные методом малоутлового рентгеновского рассеяния. Прямая линия соответствует теоретическому наклону зависимости радиуса инерции компактных глобулярных белков от молекулярного веса в логарифмических координатах /186/.

тщательного исследования всех индивидуальных рибосомных белков разными физическими методами с целью создания целостного представления об их структуре в растворе.

.ЇУ. ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЖОВ ИЗ 30S СУБЧАСТИЦ РИБОСОМ

1. Введение.

Около полутора десятка лет прошло с тех пор, как исследователи стали получать индивидуальные белки из рибосом в препаративных количествах. Сложность получения индивидуальных белковых препаратов объясняется исключительной гетерогенностью молекул белков в рибосоме. Авторы работ /222, 139, 165, 88, 92, 127/ первыми предложили препаративные методы получения рибосомных белков из 30S субчастиц. Некоторые из этих методов используются исследователями и по сей день без существенных изменений.

Процесс получения индивидуальных белков из рибосом обычно включает в себя две стадии: I) экстракция рибосомных белков из субчастиц, 2) хроматографическое разделение полученных смесей белков и очистка индивидуальных рибосомных белков..

2. Экстракция рибосомных белков из дубчастиц.
Экстракция рибосомных белков из 30S субчастиц преследует

двоякую цель. Кроме задачи получения смеси рибосомных белков в растворе, на стадии экстракции возможно проведение предварительного, грубого фракционирования суммарного рибосомного белка. Описанные ниже методы позволяют отделить от субчастиц группы белков, различающиеся по белковому составу в зависимости от применяемого метода экстракции, предоставляя широкий выбор возможных вариантов проведения экстракции рибосомных

белков.

а) Методы солевой экстракции рибосомных белков.

Ступенчатое отделение рибосомных белков от субчастиц при увеличении концентрации солей одновалентных металлов (GsCl, LiCl, КС1, NaCl, HH4CI ) было обнаружено уже давно и подробно изучалось /137, 199, 125, 206, 220, 221, 95, 133, 35, 219, 12,207/, Оказалось, что в случае 30S субчастицы отделение рибосомных белков дискретными группами последовательно приводит к образованию РНП-частиц с коэффициентами седиментации 30s—*- 28s—«-25S—-22s —-20s —* I6s вплоть до получения свободной I6S РНК /26/. После введения единого обозначения рибосомных белков /255, 151/ и разработки метода двумерного электрофореза белков в полиакрил-амидных гелях /105/ стал возможным детальный анализ белкового состава отделяемых при экстракции смесей белков я образующихся при этом РНП-частиц. Отметим, здесь работы, где был установлен белковый состав РНП-частиц, полученных после экстракции части рибосомных белков в различных солевых условиях /90, 138, 230, 231, 96, 152, 14/. Однако, при использовании этих данных с целью выбора способа фракционирования белков во время экстракции, следует учитывать следующее: в тех работах, где авторы, изучающие продукты солевой экстракции, анализировали содержание донной и супернатантной фракций после полного осаждения РНП-частиц, возможно загрязнение донной фракции агрегатами экстрагированных белков, в том случае, если не были предприняты специальные меры предосторожности. Поскольку агрегация рибосомных белков сильно зависит от концентрации этих белков, рН, концентрации соли,

только абсолютно точное воспроизведение таких работ может гарантировать воспроизводимые результаты по фракционированию белков. Примерами работ, где применялось предварительное фракционирование рибосомных белков во время их солевой экстракции из субчастиц могут служить работы /127,93,27/. б) Экстракция рибосомных белков растворами, содержащими высокие концентрации денатурирующих агентов. Как правило, раствору с жесткими денатурирующими агентами применяются в целях полной экстракции рибосомных белков. Одним из наиболее распространенных методов экстракции является обработка рибосом 67% уксусной кислотой в присутствии хлористого магния, что позволяет экстрагировать 95% белка /247, 88/. При обработке рибосомных субчастиц увеличивающимися концентрациями уксусной кислоты хорошего деления белков на фракции не получается /181/. Другим методом полной экстракции белков является обработка рибосом 4М мочевиной с 2М LiCl в присутствие 0,006М MgCl₂ /ИЗ, 133, 67, 122, 204/» Однако, было замечено, что хотя любым из этих методов -экстрагируется практически весь белок, содержание отдельных белков в экстрактах понижено, причем то, какие белки находились в пониженном количестве, зависело от метода экстракции /108/. В одной из работ было рекомендовано после проведения экстракции одним из методов, обеспечивающих практически полную экстракцию рибосомных белков, вводить вторую стадию, применяя уже другой метод экстракции, добиваясь таким образом равномерного присутствия всех рибосомных белков в растворе /108/.

Метод фракционирования рибосомных белков при их экстракции из 30S субчастицы в присутствии 6М мочевины был предложен в работе /205/. Достоинством этого метода, по сравнению с методом солевой экстракции, является то, что буфер, содержащий бМ мочевины является отличным растворителем для рибосомных белков, полностью исключая агрегацию белков, являющуюся помехой для фракционирования белков при экстракции солью. Кроме того, было замечено, что добавление мочевины в солевой раствор изменяет порядок диссоциации белков от субчастиц по сравнению с методом солевой экстракции /205/. Хотелось бы добавить, что порядок диссоциации белков от субчастиц в присутствие мочевины удивительно похож на порядок элюции рибосомных белков в катион-нообменной хроматографии.

Кроме вышеуказанных методов экстракции нужно отметить методы фенольной экстракции /92, 183/ и РНК-азной обработки /100, 139, 183/, не нашедшие, однако, широкого применения в препаративном выделении рибосомных белков,

3. Ионообменная хроматография белков из 3QS субчастицы рибосом.

Эта стадия выделения рибосомных белков, пожалуй, самая трудоемкая и важная на пути получения индивидуальных рибосомных белков. От успешного проведения этой стадии зависят такие конечные показатели препарта индивидуального рибосомного белка, как гомогенность, количество примесей, выход. Поэтому исследователи не скупятся на тщательную организацию ионообменной хроматографии, сознательно увеличвая объемы градиентов, что чревато

удлинением процедуры и разбавлением белковых фракций /18/.

Первая попытка фракционировать рибосомные белки хроматографией на ионообменной колонке была сделана в работе /249/. Существующие методы ионообменной хроматографии тотального препарата рибосомных белков в течение одного колоночного разделения обеспечивают полную очистку лишь части рибосомных белков /256/. Остальные белки доочищаются иными способами (в том числе и ионнообменной хроматографией в других условиях).

В большинстве случаев ионообменная хроматография тотального препарата рибосомных белков проводиться: I) на целлюлозных ионообменниках; 2) в присутствии 6М мочевины. В основе большинства приведенных в литературе методик ионообменной хроматографии рибосомных белков лежат три работы: это методики Траута-Мура /222, 139/, группы Виттмана /92/ и Харди-Курланда /88/.

В методике Траута-Мура в качестве ионообменника используется КМ-целлюлоза, а хроматография ведется в ацетатном буфере (рН 5,6). Хроматография в ацетатном буфере (рН 5,6) нашла применение при аналитическом фракционировании белков 30 S субчастицы /165, 216, 263/. Позднее авторы этого метода усовершенствовали его, уменьшив нагрузку на единицу объема ионообменника и увеличив отношение высоты колонки к ее диаметру /223/, а также применив в качестве начального буфера метиламинацетатный буфер (рН 5,6) как и в работе /95/.

В методике группы Виттмана /92/ разделение ведется на КМ-целлюлозе, в пиридин-формиатном буфере (рН 3,3-4,3) при

комнатной температуре. Как утверждают авторы, это удобно, так как при рН 3-4 уменьшена активность протеаз и модификация цистеина цианатами, содержащимися в мочевине.

В методике Харди-Курланда /88/ в качестве ионообменника используется фосфоцеллюлоза. Авторам методики удалось хорошо разделить и получить в чистом виде около восемнадцати индивидуальных белков из малой 30S субчастицы.

В отличие от вышеупомянутых методов, в работе /127/ экстракция белков и все этапы хроматографии проводились без применения жестких денатурирующих агентов, каковым является уксусная кислота и мочевина (так называемый ^пнативный^иметод). Белки, полученные таким "мягким" способом в настоящее время интенсивно исследуются различными физико-химическими методами.

Построение рибосом из двух неравных субчастиц.

В электронном микроскопе рибосомы выглядят как компактные о округлые частицы размером около 250 А. Молекулярный вес рибосом примерно 2,3 х Юб /258, 45, 50, 47, 46/ и коэффициент седиментации примерно 70S . Химически рибосома представляет собой рибонуклеопрогеид. В рибосомах E coli 63% от сухого веса приходится на РНК, а 37% на белок. Необходимыми низкомолекулярными компонентами интактных рибосом являются ионы Mg2+ (от части и Са +), а также ионы К+ и/или нн . Рибосомы могут содержать определенное количество диаминов и полиаминов (путренцина, кадаверина, спермидина и др.) /25/. 2. Построение рибосом из двух неравных субчастиц Рибосомы всех организмов представляют собой комплекс двух лабильно ассоцированных субчастиц. Это отчетливо проявляется при понижении концентрации щелочноземельных катионов в растворе: рибосомы обратимо диссоцируют на две неравные субчастицы. Диссоциация на две неравные субчастицы - универсальное явление, свойственное рибосомам всех организмов. В частности, прокариотические 70S рибосомы диссоцируют на 30S и 50S субчастицы /218/. Построение рибосом из двух неравных субчастиц, было обнаружено и при электронно-микроскопических наблюдениях /98/. На рис.1 показана модель рибосомы E coli , построенная на основании электронно-микроскопических исследований Д.В.Васильева /273/ Малая 30S субчастица рибосом Е.соіі имеет молекулярный вес около 0,847 х 10 . В электронном микроскопе 30S субчастица выглядит как вытянутая ассиметричная структура с соотношением осей 2:1 и длиной 230 А. Морфологически малую 30S субчастицу подразделяют на головку, тело и боковой выступ, отделяемый от тела глубокой бороздкой /б, 229/. Измерения размеров и формы 30S субчастицы методом малоуглового рентгеновского диффузного рассеяния дают радиус инерции около 70 А, что соответствует компактной частице такого молекулярного веса. Из анализа кривой малоуглового диффузного рентгеновского рассеяния следует та же, что эту частицу можно приблизительно аппроксимировать еішюонуїому.: эллйпе о"йдувращения с соотношентем осей 1:2 /167/.

Рибосомная РНК 30S субчастицы E.coli , составляющая 61% сухого веса, представлена одной ковалентно-непрерывной молекулой с молекулярным весом 0,5 х 10 /45,50,113/. Коэффициент седиментации изолированной РНК в безмагниевом буфере в присутствии одновалентных катионов равен 16S. Белковый компонент 30S субчастицы рибосом E.coli состоит из двадцати одного полипептида /ИЗ, 106, 255/. Исследование распределения бежового и РНК-вого компонентов в субчастице методом вариации контраста в нейтронном рассеянии показало, что основная часть РНК расположена ближе к центру масс субчастицы, а белковый компонент ближе к периферии /187, 141/. Большая 50S субчастица рибосом 5 Soli имеет молекулярный вес 1,45 х 10 . Электронно-микроскопическими исследованиями было показано, что ее форма напоминает скошенную полусферу со сложным рельєфом поверхностей. Модель 50S субчастицы, построенная В.Д.Васильевым на основании анализа электронно-микроскопических микрофотографий показана на рис.1 /236, 235/. Более или менее отличающиеся модели 50S субчастицы рибосом E.coli в разное время были опубликованы в работах /2IQ;118, 197/. Исследование 50S субчастицы методом малоуглового диффузного рентгеновского рассеяния показало, что она является компактной субчастицей, форму которой можно аппроксимировать эллипсоидом вращения с соотношением осей 2:1 с одной уплощенной стороной /91, 185/. В 50S субчастицах E.coli РНК составляет 67,5% сухого веса. Рибосомная РНК большой субчастицы прокариотических организмов всегда представлена двумя молекулами РНК, которые в безмагниевом растворе в присутствии моновалентных катионов имеют коэффициенты седиментации, соответственно 23S и 5S. 23S РНК рибосом E coli_ имеет молекулярный вес 9,-4-2 х Юб, a 5S РНК - 39000. Белковый компонент 50S субчастицы состоит из 32 индивидуальных полипептидов. Бее рибосомные белки, по-видимому, содержатся в количестве одной копии на рибосому, и только белок Ь7(Ы2) имеется в четырех копиях на рибосому /87/. Итак, построение рибосомы из двух неравных субчастиц, является отличительной чертой структуры рибосомы. Такой принцип организации рибосом,как оказалось, имеет важное функциональное значение І- В опытах in vivo и in vitro было показано, что после завершения синтеза полипептида на рибосоме происходит диссоциация рибосом на субчастицы / 103,104-/» Наличие свободных субчастиц в растворе оказалось необходимым и для образования инициаторного комплекса /132, 159, 76, 66, 14 166, 156/, Кроме того, есть веские основания считать, что определенная подвижность субчастиц в ассоциированном состоянии необходима для элонгационного процесса, так как избыточная стабилизация ассоциированного состояния рибосом (ионами магния, спиртом, полиаминами и т.п.) всегда ингибирует синтез белка /202, 201/. 3. Другие характерные особенности структуры рибосом Каждая рибосомная субчастица имеет сложный набор разнообразных полипептидных цепей. Этот факт был обнаружен Уоллером при изучении белкового состава прокариотических рибосом /247, 248/. Впоследствии множественность рибосомных белков была показана и в эукариотических клетках /249/,

В настоящее время все входящие в состав рибосомы полипептиды могут быть охарактеризованы как индивидуальные белки /223/. Рибосомные субчастицы могут быть рассмотрены, как рибонук-леопротеидные тяжи, свернутые в компактную структуру. Этот принцип структурной организации рибосом был открыт и сформулирован после обнаружения у рибосомных субчастиц способности разворачиваться в рибонуклеопротеидные тяжи в безмагниевом гипотоническом растворе, причем сколь-нибудь заметной потери белков в процессе разворачивания не происходило /21, 198, 22/. При разворачивании происходит резкое уменьшение коэффициентов седиментации субчастиц и увеличение удельной вязкости. Было установлено, что разворачивание рибосомных субчастиц представляет собой многоступенчатый процесс /25, 145, 202, 2, 72, 9, 75, 250, 145/. Таким образом, оказалось, что белковые молекулы могут удерживаться на рибосомной РНК не зависимо от нативяой четвертичной структуры рибосомных субчастиц. Следовательно, рибосом-ная РНК может рассматриваться как ковалентно-непрерывный каркас, специфическая структура которого определяет уникальное расположение рибосомных белков /25, 21, 198, 22, 2/. 4. Разборка и самосборка рибосомных субчастиц При обработке интактных рибосомных частиц высокими концентрациями солей одновалентных металлов, происходит диссоциация рибосомных белков /9, 137, 199, 23, 125, IOO/. Белки диссоциирующие под воздействием высоких концентраций солей в присутствии ионов Mg2+ получили название "дополнительных ри-босомообразующих" или "отщепляемых" ("split") белков, а белки, которые отщепляются при воздействии высоких концентраций соли только в отсутствие ионов магния получили название "основных структурных" или "сердцевидных" ("core") белков /25, 199, 125, 100/. Отщепление рибосомных белков под действием высоких концентраций солей протекает довольно дискретными группами /199, 23, 125/. Диссоциация одних белков вызывает более легкое отщепление других белков /25/. Следует отметить, что порядок диссоциации рибосомяых белков изменяется при добавлении мочевины в солевой раствор /205/. Порядок диссоциации белков также изменяется, если диссоциацию проводить с помощью уксусной кислоты /181/. Содержание ионов Mg в среде влияет на величину концентрации соли, необходимую для диссоциации определенных белков /199, 23, 125, 100/. Процесс, обратныйрвбэрки.хубшет1!щг - это самосборка ри-босомных субчастиц из РНК и белковых молекул. В процессе самосборки субчастиц особенно отчетливо проявляется каркасная роль рибосомной РНК. В работах /198, 30/ впервые было показано, что белок-дефицитные РНП-частицы, образующиеся в клетках E.coli в присутствии хлорамфеникола, связывают свободные рибосомные белки, образуя частицы, по физическим свойствам не отличимые от рибосомных субчастиц.

Состав и некоторые физико-химические характеристики рибосомных белков 30S субчастицы Е.соїі

В составе 30S субчастицы рибосом E.coli обнаруживается 21 различная полипептидная цепь /106, 255, 223, 83, 214, 114/. Все белки 30S субчастицы могут быть разделены методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле /106, 105/. Белки малой субчастицы рибосом E.coli обозначают буквой s , в отличие от белков большой субчастицы, обозначаемых буквой ъ , и им присваивается номер в соответствии с положением на двумерной электрофореграше, причем, чем выше электроподвижность белка во втором направлении, тем больше его номер /106, 255/. Молекулярные веса белков 30S субчастицы варьируют от 8500 до 27000, белок S1 имеет молекулярный вес 6II59 /258/. Полная аминокислотная последовательность ; всех белков уже известна /111,262,43, 176, 261, 94, 177, 33, 244, 109,55,69, 126, 147, 239, 242, 241, 243, 260, 227, 87/, Все белки имеют различную первичную структуру, не было обнаружено и заметных гомологичных аминокислотных последовательностей у разных белков 30S субчастицы.. Аминокислотный состав, изоэлектричес-кие точки /94, 107, 211/, молекулярные веса, рассчитанные из первичной структуры и другие важные характеристики белков 30S субчастицы приведены в таблице I. Из приведенных в таблице I данных видно, что белки 30S субчастицы рибосом E.coli имеют сильно выраженный основной характер (20-30% составляют основные аминокислоты). В целом, аминокислотный состав рибосомных белков обычный, характерный для глобулярных белков, йзоэлек-трическая точка для большинства белков (кроме S1, S2, S6, S10 ) выше 9. Все белки 30S субчастицы содержатся в количестве не более одной копии на субчастицу /139, 87/. 3. Конформация рибосомных белков в ооофаве малой. ЪО - суб Частицы:.рибосом. Первые попытки исследовать конформацию рибосомного белка в составе рибосом были предприняты с помощью изучения спектров кругового дихроизма в дальней ультрафиолетой области /136,180/. Полученные результаты указывали на наличие -спиральных ;участ-ков в белковом компоненте рибосом. Общее содержание с-спи-ральной структуры в белке рибосом было оценено в 30%, Эти данные позволили предположить, что по крайней мере часть молекул рибосомных белков являются молекулами глобулярного типа. Отметим, что более поздние исследования в основном подтвердили эти данные по оценке содержания об-структуры в рибосомных белках /60, 48/» Другой точкой зрения было сложившееся к 1978 году представление о сильно вытянутой и даже разветвленной форме большинства рибосомішх белков в составе рибосомы.

Эта точка зрения получила широкое распространение, в основном, благодаря данным иммунно-электронной микроскопии /210, 119/, и нам хотелось бы подробнее остановиться на этих результатах, в свое время сильно повлиявших на формирование представлений о структуре рибосом-ных белков. Метод имунно-электронной микроскопии основан на специфическом взаимодействии антител с белковыми детерминантами на поверхности частиц и наблюдении в электронный микроскоп образующихся пар частиц, что позволяет с точностью до размеров антител локализовать место расположения обнаруженных белковых детерминант. Специфика интерпретации данных, полученных этим методом заключается в том, что в случае белков, имеющих одну точку связывания антител на поверхности частицы, нельзя сказать что-либо определенное об их конформации.Зато для белков, имеющих по два или более удаленных друг от друга места связывания антител (в случае, если это не связано с загрязнением препарата антител) можно говорить о вытянутой структуре. Методом имунно-электронной микроскопии особенно подробно были изучены белки 30S субчастицы рибосом E.coli . В работах, проведенных группой Штоффлера /210, 217/, сообщается, что для белков si, S8, S13, S14, S19, S20 и S21 обнаружено по одной антигенной детерминанте на поверхности субчастицы, в случае остальных 14-ти белков, антитела связываются в двух, трех, четырех местах. Среди белков, которые имеют два места связыва- ния антител, в случае S3, S6, S9, S10, S16, S17, эти антигенные детерминанты были расположены довольно близко друг от друга. Однако, расстояния между антигенными детерминантами для белков S2, S4, S5, S7, S11, S12, si5f S18 были слишком велики, чтобы согласовываться с глобулярной формой белков. Так, например, для белка S15, состоящего всего из 87 аминокислотных остатков, одна антигенная детерминанта была обнаружена в верхней части "головки", другая - в нижней части "тела" 30s субчастицы /217/. На основании этих данных делался вывод о вытянутой, или даже фибрилярной структуре многих белков в составе 30S субчастицы. Были вычислены размеры всех белков 30s субчастицы /70/, причем для четырнадцати из них принималась вытянутая конформация. Наиболее вытянутыми считались белки S4, о S7, S11, S15, S18 , длина которых оценивалась в 200-240 А, о а диаметр в 10-17 А /70/. Аналогичные эксперименты по имунно- электропной микроскопии, проведенные группой Лейка /119, 116, 117, 118/ привели к несколько отличительным от данных группы Шгоффлера результатам. В частности, для многих белков количество выявляемых антигенных детерминантуменьшилось, что в результате резко сократило число белков, для которых предполагалась вытянутая конформация. Так, число вытянутых белков уменьшилось до семи, а длина наиболее вытянутых белков ( S6, S15, S18 и о S19) была оценена в 100-130 А. Данные о форме и размерах белков 30S субчастицы, рассчитанные на основании двух имунно-электронномикроскопических моделей приведены в таблице 2. На противоречивый характер этих данных в какой-то мере проливают свет две работы, говорящие о возможности артефактов при приме- нении метода иммунно-электронной микроскопии. Так, в работе /119/ сообщалось, что возможны иммунологические перекрестные реакции между разными белками (S4 и S7, в частности).

Более того, в работе /253/ сообщалось, что в случае белка S4 , который по данным группы Штоффлера имел четыре антигенных детерминанты на поверхности субчастицы /210, 217/, при примении тщательно очищенных препаратов антител не удалось выявить ни одной антигенной детерминанты. Доступность белка S4 появлялась лишь после частичной делротеинизации субчастицы (после удаления белков S5 и S12 ) /253/. Эти данные поставили под сомнение вывод о вытянутой кон-формации рибосомных белков в составе интактной 30s субчастицы. 4. Конформация изолированных рибосомных белков в растворе. После разработки процедуры выделения индивидуальных рибосомных белков в изолированном виде ( см.главу іу) в ряде лабораторий начались широкие исследования структуры белков в растворе физическими методами. Вся совокупность имеющихся литературных данных может быть разбита на две группы. К первой группе относятся экспериментальные данные, которые казалось бы неопровержимо свидетельствовали в пользу того, что в растворе индивидуальные рибосомные белки являются сильно асимметрчными или развернутыми структурами. Исследование третичной структуры рибосомных белков было проведено методом ПМР-спеятроек опии для ряда рибосомных белков /150, Ш, Г4 9, 129 , 143, 228/. Так для одиннадцати из пятнадцати исследованных в работах /150, І48/ белков (S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S11, S12, S13, S16, S18, S20, S21) спект- ры ПМР не отличались или почти не отличались от спектров белков, снятых в присутствии мочевины. Это свидетельствовало о полном или почти полном отсутствии уникальной третичной структуры в исследованных препаратах белков /Й8/. Только в белках S4» S15 и S16 были обнаружены определенные элементы третичной структуры /150, ]#8/. В спектрах этих трех белков авторы наблюдали незначительное уширение и смещение некоторых сигналов относительно их положения в денатурирующих условиях. По мнению авторов этих работ в исследованных ими белках S4, S15 и S16 имеется очень слаборазвитая, экспонированная подвижная область с элементами третичной структуры. Действительно, как показывает например анализ, в спектре белка S4 имеется лишь один слабый сигнал в высокопольной области (сигналы в области очень высокого поля характерны для белков хорошо выраженной третичной структурой Анализ спектра ПМР в области низкого поля (где вклад вносят протоны", ароматических и гистидиновых остатков) показывает, что лишь один тирозин (из восьми тирозиновых остатков) и один гистидин (из трех остатков гистидинов) принимает участие в образовании третичной структуры /150,176/. В работе /14-9/гтой же группой, что и в работах /150, 148/ было проведено исследование третичной структуры рибосомных белков S8, S16 и S20, выделенных без применения жестких денатурирующих агентов.

Полиакриламидный гель-электрофорез рибосомных белков в присутствии додецилсулъфата натрия в пластинах

Для анализа фракций рибосомных белков применяли модифицированный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии с додецилсульфата натрия /112/. Разделяющий гель состоял из 15% акриламида, 0,2% бисакриламида, б,5М мочевины, 0,35% додецилсульфата натрия, 0,005% ТЕМЕД, 0,005% персульфата аммония, 0,375М трис-HOl , рНрп 8,9. Концентрирующий гель состоял из 4% акриламида, 0,25% бисакриламида, 0,35% додецилсульфата натрия, 6,5М мочевины, 15% сахарозы, 0,05% ТЕМЕД, 0,01% персульфат аммония, 0,І25М трис-ноі,рН2оО 6,8. Электродный буфер содержал -6г трис-ної, 28 В г глицина, 3,5 г додецилсульфата натрия на I л раствора (рН?пО 8,3). Буфер для образцов состоял из б,5М мочевины, 20% сахарозы, 2,5% додецилсульфата натрия, 2% JB-мер-каптоэтанола, 0,02% бромфенолового голубого, 0,01М трис-исе рНрп0 7»0« Электрофорез при режиме 12L в/см продолжали до полного удаления бромфенолового голубого из геля. Гели фиксировали 2 часа в растворе, содержащем 50% этанола, 10% уксусной колонку промывали тремя объемами буфера V со скоростью 7 мл/час см2. Белки фракционировали с помощью градиента NaOl в буфере V. .Использовали градиент от О до 0,ЗОМ NaOl. Объем градиента составлял 30-35 объемов колонки, скорость элюции 7-8 мл/час см2. б) Хроматография на колонках с карбоксиметилцеллюлозои Хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе вели как описано ра нее /139/. Карбоксиметилцеллюлозу КМ-52 фирмы Whatman сус пендировали в буфере УІ, содержащем 6М мочевины, 0,0Ш соля нокислого метиламина, 0,01М в-меркаптоэтанола, 0,002М ЭДТА- Na2, 0,01М ацетата Na, рН2о 5,6 и уравновешивали в течение 1,5 2 суток 7 10 кратной сменой буфера, УІ. Набивку колонки карбоксиметилцеллюлозои проводили под избыточным давлением 0,25 атм. Готовую колонку размером 1,6 х 100 см промывали I л буфера УІсо скоростью 30 мл/час. Образец с концентрацией около 20 мг/мл в буфере УІ наносили на колонку со скоростью 2 мл/час, после чего колонку промывали 0,6 л буфера УІ со скоростью 25-30 мл/час. Белки фракционировали с помощью градиента от 0 до 0,30М їїаСІ, 0,05М Na-ацетат в буфере УІ (рН 5,6). Объем градиента составлял 40-50 объемов колонки, скорость элюции была 25-30мл/ч. в) Гельфильтрация. Сефадексы Г-75, Г-ІОО, Г-І50 марки super fine фирмы PharmaciE при комнатной температуре заливали дистиллированной водой и после набухания в течение 3-х суток несколько раз декантировали для получения по возможности крупных однородных частиц. После этого сефадексы переводили в буфер УП, состоящий из 0,2М NaGl, 6М мочевины, 0,01М солянокислого метил- (60С), затем окрашивали в течение 2-4 часов в растворе, содержащем 7% уксусной кислоты, 30% этанола, 0,5% кумаси бриллиантовой голубой (20С). Гели раскрашивали в растворе, содержащем 5% уксусной кислоты. 8. Хроматографические процедуры при фракционировании белков рибосомной 30S о.убчастицы а) Хроматография на колонках с фосфоцеллюлозой Перед обработкой щелочью и кислотой смолу несколько раз промывали на стеклянном фильтре этанолом.

Затем фосфоцеллюлозу обрабатывали 0,IM NaOH Б течение 20 минут, отмывали от щелочи водой, обработывали 0,1М соляной кислотой в течение 3-х минут и отмывали от кислоты водой. Процедуру обработки смолы щелочью и кислотой повторяли 4-8 раз. Качество отмывки контролировали индикаторной бумагой. Перед суспендированием смолы в нужном буфере, ее обрабатывали большим количеством раствора 2М NaOl. Потом фосфоцеллюлозу несколько раз суспендировали и декантировали в буфере V , состоящем из 6М мочевины, 0,01М солянокислого метиламина, 0,01М В -меркаптоэтанола, 0,002М ЭДТА-Яа2 , 0,05М фосфата Na, pH2Qo 5,8. Процедуру смены буфера продолжали в течение суток 4t5 раз до установления полного равновесия. Набивку колонки фосфоцеллюлозой проводили под избыточным давлением 0,25 атм. Готовую колонку размером 2,6 х 70 см промывали 2 л буфера V со скоростью 50 мл/час; колонку размером 1,6 х 100 см промывали 1,0 л буфера V со скоростью 30 мл/час. Образец с концентрацией около 20 мг/мл в буфере v наносили на колонку со скоростью I мл/час см2, после чего амина, 0,OIM jS-меркаптоэтанола, 0,002М ЭДТА-Иа2, 0,05М ацетата На, рНопО 5,6, тщательно уравновешивали и заливали в колонки размером 2,6 х 100 см. Кроме того была приготовлена колонка с сефадексом Г-75 или Г-100 размером 5 х 100 см. Набивку и промывку колонок проводили для сефадексов Г-75 super fine и Г-100 super fine при перепаде давления 0,04 атм. а для сефадекса Г-І50 super fine-0,02 атм. Колонки 2,6 х 100 см промывали 1,5 л буфера, а колонку 5 х 100 см промывали б л буфера УП. Ооъем наносимого образца не превышал 1-1,5% объема колонки. Гельфильтрацию проводили при давлении на 50% превышающем давление уравновешивания. Фракции собирались по 7-10 мл. 9. Концентрирование белковых препаратов Концентрирование белковых препаратов проводили исключительно на мембране для ультрафильтрации UM-2 фирмы Amicon. Избыточное давление 2+3 атм. создавалось газообразным азотом высокой чистоты. Обычно препараты белков концентрировали до 1-5 мг/мл. 10» Получение чистых препаратов индивидуальных рибосом-ных белков из малой 30S субчастицы рибосом Общая схема получения рибосомных белков из малой 30S субчастицы рибосом Едсоїі МЕЕ-боопредставлена на таблице 4. За основу ванта методика получения рибосомных белков из 30 s субчастицы, предложенная ранее /139, 88/.

Характеристика спектров кругового дихроизма белков 30S субчастицы рибосом

На рис.16-22 приведены спектры КД в области 184-310 нм всех белков малой субчастицы рибосом E.coli. Из этих рисунков видно, что как в далекой ультрафиолетовой области (184-240 нм), где в основном проявляется содержание разных типов вторичной структуры, так и в ближней ультрафиолетовой области (240-310 нм), где основной вклад дают хромофоры, связанные с боковыми группами ароматических аминокислот, наблюдается большое разнообразие кривых КД для разных белков. Большинство полученных спектров белков в области 184-240нм имеет следующие экстремумы: максимум около 190 нм, минимум около 208 нм и минимум или плечо около 220 нм (исключение составляют белки S12, S17, S18, S19). Присутствие в спектрах КД этих трех экстремумов свидетельствует о наличии относительно большого содержания d-спиралей во вторичной структуре исследованных белков. Причем, в большинстве случаев, когда спектр КД указывал на высокое содержание о-слиралей, минимум в районе 208 нм был существенно ниже, чем минимум (или плечо) около 220 нм (исключением являются S6, S8, S15, S16 ). Этот факт может говорить о значительных искажениях в геометрии 6-спи-ралей в этих белках, та как п- Х переход около 220 нм больше зависит от окружающей среды /226/, чем n-JC переход около 208 нм и является более чувствительным к геометрии об -спиралей /240/. Среди 21 спектра КД нет ни одного с максимумом около 195нм и единичным минимумом в области 210-220 нм, такая кривая КД соответствует белкам с высоким содержанием JB-формы во вторичной структуре. Белки S12, S17, S18, S19 имеют кривые КД с одним минимумом около 200 нм, что говорит о малом содержании упорядоченной вторичной структуры в этих белках. Обычно, когда спектр КД в области 184-240 нм для трипто-фан-содержащих белков указывает на достаточно развитую вторичную структуру, наблюдается большая амплитуда КД-спектра в области 280-290 нм, что говорит о том, что боковые остатки триптофана жестко зафиксированы внутри белка. Иллюстрацией может служить сравнение спектров белков S16 и S17 (рис.21).Эти два белка имеют по одному тирозину и триптофану на общее число 82 и 83 аминокислотных остатков соответственно /239, 242/. Содержание вторичной структуры в белке S10 существенно больше, чем в белке S17 и амплитуда КД-спектра белка S16 в области 280-290 нм более чем в десять раз превышает таковую для белка S17» 4. Расчет содержания различных типов вторичной структуры для белков 30S субчастицы рибосом В табл.б приведены результаты, полученные при расчете содержания о( -спиралей ( ), ft -формы Сд)и неупортдочеиной структуры (fr) во вторичной структуре всех исследованных белков. Совпадение значений f f д» fr, получаемых из эллиптич-ностей при двух или трех длинах волн, указывает на адекватность применения выбранного метода анализа спектров КД данного белка.

Получение лишенных физического смеслы отрицательных значений, или существенно отличающийся от единицы суммы долей вторичной структуры, или значительное различие значений долей вторичной структуры при расчете по двум или трем длинам волн, говорит о том, что спектр КД данного белка не является простой суперпозицией использованных для расчета реперных спектров. Причиной этого может быть различие в качестве (протяженности, деформированности) упорядоченной вторичной структуры, недоучет других типов вторичной структуры, аномальный вклад боковых групп в спектр КД данного белка по сравнению с теми глобулярными белками, по которым были рассчитаны реперные спектры. Из табл.6 видно, что при расчете величины содержания о(-спиралей для каждого белка, значения, полученные с помощью двух методов расчета полностью совпадают. Однако, при расчете содердания JJ -формы, значения, полученные разными методами расчета, иногда существенно различаются. Кроме того, для белков S7, S10, S13, S14, S15, S17 и S21 сумма долей трех типов вторичной структуры сильно отличается от единицы. В главе IV литературного обзора довольно полно представлены все исследования разных авторов, в которых предпринимались целенаправленные усилия изучить вторичную, третичную структуру и компактность рибосомных белков. Однако, как уже отмечалось, полученные результаты были во многом противоречивы даже у одних и тех же авторов. Кроме того, имелись большие расхождения между данными разных авторов, пользующихся одинаковыми физическими методами. Целью нашей работы было получить достоверные данные о конформации определенных рибосомных белков из 30s субчастицы в растворе. Для исключения случайных артефактов главным условием этого исследования было изучение конформации белков разнообразными методами, чтобы все эти исследования в совокупности давали однозначный результат. 2. Конформация белка S4 в растворе а) Третичная структура. Третичная структура белка S4 изучалась методом протонного магнитного резонанса (ПМР). На рис.23 представлен спектр ІШР белка S4 в D20 буфере в неденатурирующих условиях (рис.23а) и в присуствии Ж (рис.23в) и 4,5М мочевины (рис.23с). Сравнение этих спектров указывает на существо- вание хорошо развитой третичной структуры белка S4 в не-денатурирующих условиях. Так, в области высокого поля (от 0,8 до 3,5 м.д.) и в области низкого поля (от 6,5 до 8,5 м.д.) спектр белка содержит плохо разрешенные, широкие сигналы. В области очень высокого поля (от 0,112 до 0,515 м.д.) спектр неденатурированного белка имеет три высокопольных сигнала, характерные для спектра глобулярных белков. Эти сигналы обусловлены протонами метильных групп аполярных алифатических остатков, боковые цепи которых находятся в непосредственной близости от плоскости колец ароматических остатков молекулы белка S4 . Присутствие резонансных сигналов в области очень высокого поля свидетельствует о том, что в белке S4 имеется компактно свернутая структура. В области низкого поля (от 6,5 до 8,5 м.д.) сигнальные линии протонов большинства ароматических аминокислот и гистидинов смещены относительно их положения в спектре белка в присутствии 2М и 4,5М мочевины (рис.23в и 23с). Анализ ПМР-спектра белка S4 показывает, что по крайней мере шесть-семь тирозинов, триптофановый остаток и все три гисти-дина входят в состав третичной структуры. Так, только один из восьми тирозиновых остатков имеет химический сдвиг (7,5 и 6,81 м.д.) характерный для белков в развернутой конформа-ции /254, 134, 208/. Все остальные сигналы тирозинов сдвинуты в области более высокого поля. Резонансы при С-4- и G-7 триптофанового остатка имеют широкие неразрешенные сигналы. Это указывает на то, что триптофановый остаток находится в интерьере молекулы белка и его подвижность сильно заторможена. Два резонансных сигнала при 8,18 м.д. интен-

Похожие диссертации на Изучение вторичной и третичной структуры рибосомных белков из малой 30S субчастицы Escherichia coli

Количественное изучение взаимодействия полиуридиловой кислоты с рибосомами Escherichia coli и роль Y-основания в кодон-антикодоновом взаимодействии Катунин Владимир Иванович

Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислотСычева Елена Викторовна

Изучение взаимодействия регуляторных факторов с РНК-полимеразой Escherichia coliНечаев Сергей Юрьевич

Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli Кукарин Александр Вячеславович

Изучение структуры и стабильности белка оболочки Х-вируса картофеля в свободном состоянии и в составе вирионовНемых Мария Александровна

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенезаКотлярова Вероника Александровна

Влияние мутаций PTS, повреждающих цитоплазматические компоненты системы транспорта D -углеводов, на регуляцию транскрипции катаболитных оперонов у Escherichia coli K-12 Глезина Марина Львовна

Комплексы полинуклеотидов с белками рибосомы Escherichia coli и их свойства Сарапуу Таго Викторович

Экспрессия клонированного гена поверхностного антигена вируса гепатита в человеке в Escherichia coli Козловская Татьяна Минаевна

Взаимодействие транспортной РНК с рибосомами Escherichia coli Кириллов Станислав Викторович