Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . 10
Глава I. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ мРНК С РИБОСОМОЙ 10
1. Связывание мРНК в инициаторном комплексе . 11
2. Взаимодействие мРНК с рибосомными белками во время элонгации : 20
Глава II. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ тРНК С 30S СУБЧАСТИЦЕЙ .: 36
Глава III. МЕХАНИЗМ ОТБОРА аа-тРНК 48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ : 60
Глава I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 6 0
1. Использованные реактивы и материалы . 60
2. Выделение суммарного белка субчастиц и рибосомы Е.аоЪг 62
.3. Выделение рибосомного белка S1 . 63
:4. Изолирование тРНК Е.ооїг . 63
5. фосфорилирование тРНК е и тРНкУ . 64
6. Выделение препарата аминоацил-тРНК--синтетазы ,
7. Иммобилизация полинуклеотидов на гидразидагарозе .
8. Аффинная хроматография рибосомных белков на колонках с иммобилизованными поли-нуклеотидами
:9. Аффинная хроматография тРНК на колонках с и преформированными мРНК -белковыми
комплексами
10. Видовой анализ тРНК, связанной с и мРНК -белковыми комплексами 69
11. Равновесное связывание тРНК на преформи- и рованном мРНК -белковом комплексе и определение константы диссоциации образующегося комплекса 70
12. Определение распределения мРНК -белкового
комплекса в пределе колонки с
мРНК-агарозой .: 71
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 73
1. Результаты иммобилизации полинуклеотидов . 73
2. Аффинная хроматография СБ70 на колонках
с иммобилизованными полинуклеотидами 74
3. Связывание тРНК на колонках с и преформированными мРНК -белковыми
комплексами . 84
:3..1. Связывание тРНК на мРНКИ-СБ70 комплексы 84
3.2. Анализ тРНК/ связанной на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами
без рибосомных белков 88
3.3. Селекция деацилированной и амино-ацилированной тРНК на колонках с преформированным мРНК -СБ70 комплексом 90
3.4. Связывание деацилированной тРНК на и преформированные мРНК -СБ30 и
мРНКИ-СБ50 комплексы 91
:4. Равновесное связывание тРНК на преформированном мРНК -белковом комплексе и определение константы диссоциации образующегося комплекса 93
:4.1. Определение константы диссоциации (мРНКИ-СБ30)-тРНК комплекса 93
:4.2. Определение константы диссоциации (мРНКи-Б13)-тРНК комплекса 97
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 101
1. Аффинная хроматография СБ70 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами 101
2. Связывание тРНК на колонках с преформированными мРНК -белковыми комплексами 105
2.1. Связывание тРНК на мРНКи-СБ70 комплексах. 1 05
2.:2. Связывание тРНК на мРНКи-СБ30 и мРНКи-СБ50 комплексах 108
2.3. Связывание тРНК на MPHK-S4, -S9 и -S13 комплексах 111
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 115
ЛИТЕРАТУРА 116
- ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ мРНК С РИБОСОМОЙ
- Использованные реактивы и материалы
- Результаты иммобилизации полинуклеотидов
- Аффинная хроматография СБ70 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами
Введение к работе
Трансляция генетической информации относится к числу наиболее фундаментальных процессов живой природы. Участвующие в ней клеточные компоненты, в первую очередь рибосомы и молекулы мРНК и тРНК, стали объектами интенсивного исследования уже более 20 лет назад. В течение этого времени были достигнуты результаты принципиальной важности: дешифрован алфавит генетического кода, выяснены общие принципы рабочего цикла рибосомы, определены первичные структуры всех структурных компонентов рибосомы Е. aoZ-L, а также сотен молекул тРНК и мРНК. Четче вырисовывается пространственная организация рибосомы и расположение на ней функционально важных участков, .все это говорит о том, что в исследовании белок-синтезирующего аппарата клетки приближается время для формулирования более конкретных вопросов о соотнощении между структурой и функцией рибосомы.
Однако, многое остается еще неизученным - многокомпонентная структура рибосомы слишком сложна для исследования ее обычными физико-химическими методическими подходами. Поэтому не вызывает удивления, что до сих пор очень мало известно о тех структурных компонентах рибосомы, которые обеспечивают взаимодействие с тРНК или мРНК. Если учесть, что эти взаимодейс1] вия являются не простыми актами сорбции и десорбции, а представляют собой сложную последовательность молекулярных событии, где как тРБК, так и мРНК обладают относительно большой степенью свободы в отношении рибосомы, то становится очевидным недостаточность имеющейся информации о функциональной топографии рибосомы.
Одним из особо сложных вопросов в этой области является вопрос о структурной и функциональной организации декодирующего участка рибосомы, т.е. участка, где взаимодействует кодон (t мРНК с антикодоном (антикодонами) тРНК. Благодаря успехам в области иммуно-электронной микроскопии известен приблизительно тот регион, где молекула мРНК входит и выходит из 70S рибосомы Е. cotL. Многочисленные эксперименты "зондирования" участка декодирования при помощи разных методических подходов ковалентных сшивок между мРНК (или же ее аналогов) со структурными компонентами рибосомы позволили идентифицировать большое количество ри-босомных белков, которые расположены вблизи матричной РНК. Однако, именно большое количество этих компонентов (все белки 30S субчастицы и многие белки 50S субчастицы), на наш взгляд, существенно снижает информативность полученных данных.
Альтернативные подходы к исследованию участка декодирования могут быть разными. Нас интересовал такой подход, который дает прямую информацию о взаимодействии матричной РНК с рибосом-ными компонентами. Одним из них (и видимо наиболее легким в экспериментальном отношении) является аффинная хроматография ри-босомных белков на иммобилизованном полинуклеотиде.
Надо отметить, что эксперименты, где в качестве иммобилизованной мРНК используются синтетические гомополинуклеотиды, являются в любом случае обязательными в качестве контрольных для ряда других опытов с разными природными матрицами. В связи с этим, первую задачу настоящей работы можно сформулировать как целенаправленное исследование взаимодействия рибосомных белков с разными полинуклеотидами для выяснения при каких условиях эти комплексы образуются и каким является их белковый состав.
Факт, что такие комплексы были действительно обнаружены, открыл нам возможность исследовать их свойства. В первую очередь нас интересовали такие свойства, которые могут говорить об их функциональной релевантности рибосоме, в частности, о процессе декодирования генетической информации в рибосоме.
Решению именно этих двух задач и посвящена настоящяя работа.
Научная новизна и практическая ценность результатов
Методом аффинной хроматографии получен новый фактический материал о взаимодействии матричной РНК с рибосомными белками E&che.si*.chZa cot-i. Описаны условия образования и свойства (связывание разных видов тРНК) мРНКи-СБ70 и -СБ30, -СБ50 комплексов Показана роль белка S13 в кодон-зависимой селекции тРНК. Полученные экспериментальные данные о РНП-комплексах позволяют уточ нить наши знания о функциональной топографии рибосомы.
Применение аффинной хроматографии позволило создать новую модельную систему для изучения кодон-антикодонового взаимодейст вия вне рибосомы. Показано, что метод аффинной хроматографии обеспечивает изучение функциональной топографии рибосомы. Метод позволяет определить целый ряд свойств рибосомных компонентов, входящих в состав активных центров рибосомы.
Приношу глубокую благодарность руководителю настоящей работы доктору биологических наук Р. Виллемсу за постоянную помощь при выполнении экспериментов и написании диссертации.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ мРНК С РИБОСОМОЙ
Изучая взаимодействие матричной РНК с рибосомой надо обратить внимание, во-первых, на те рибосомные компоненты, которые участвуют в связывание мРНК в инициаторном комплексе и, во-вторых, на те, которые взаимодействуют с матрицей в процессе элонгации. При образовании комплекса между мРНК и рибосомой во время инициации ключевым является вопрос об опознании инициаторного кодона в цепи молекулы мРНК из числа многих AUG кодонов, находившихся в транслируемом участке матрицы.
Участок матричного полинуклеотида, взаимодействующий с рибосомой во время инициации, обхватывает 3:0.:..4 0 нуклеотидов. Данный фрагмент матрицы можно выделить путем нуклеазной обработки MPHK.7 0S комплекса (Steitz, 1969; Hindley.S Staples, 1969). Определение первичных структур этих фрагментов из разных матричных молекул не привело к решению вопроса о механизме правильного выбора рибосомой инициаторного кодона. Позднее, Шайн и Далгарно обнаружили комплементарное соответствие между 3 -концевым участком 16S рРНК и 5 -концевой нетранслируемой нуклеотидной последовательностью мРНК, что позволяло им выдвинуть гипотезу о выборе места инициации в молекуле мРНК посредством взаимодействия матрицы с 16S рРНК (Shine & Dalgarno, 1974). Дальнейшие исследования в этом направлений продемонстрировали, что это взаимодействие не может быть единственным между рибосомой и мРНК во время инициации, гарантирующим корректное связывание матрицы (Taniguchi & Weissmann, 1977а). Следовательно, определенная роль в опознании инициаторно-го участка матричного полинуклеотида может лежать и на рибосомных белках.
В инициации белкового синтеза существенный вклад в связывание матрицы вносит, очевидно, 16s рибосомная РНК за счет комплемен-тарности 3 -конца рРНК 5 -концевым нуклеотидам мРНК. В процессе же элонгации, видимо, основным остается связывание матрицы с помощью рибосомных белков. В изучении этих взаимодействий применяют разные методические подходы: химическую модификацию рибосомных белков, аффинную модификацию матричного полинуклеотида, аффинную хроматографию рибосомных белков на иммобилизованном полинуклеотиде (в качестве мРНК), УФ-индуцированные сшивки между мРНК и рибосомными белками, антитела против белков и др. (см. например Устав и Вил-лемс, 1981; Traut et al., 1980; Cantor, 1979; Nomura et al., 1969).
В настоящем обзоре обсуждаются некоторые аспекты в узнавании рибосомой инициаторного участка мРНК, в частности роль 16S рРНК и рибосомных белков в этом процессе. Главное внимание обращено на рибосомные белки 3 0S субчастицы, которые могут взаимодействовать с матрицей в процессе элонгации полипептида.
Использованные реактивы и материалы
1. Неорганические соединения были получены от фирмы "Реахим" и имели качество "х.ч." или "о .с .м.:" .
2. Органические соединения отечественного производства или фирмы "Reanal" - трис, мочевина, акриламид, N,N -метиленбисакрил-амид, фенол, сахароза и др. - подвергались дополнительной очистке.
3. Додецилсульфат натрия с чистотой 99% был получен для электрофореза от фирмы "Sigma" (США).
4. Хроматографические смолы Sephadex G-100, DEAE-Sephadex, Sepharose 2В, 4В, 6В и Poly(U)-Sepharose 4В были получены от фирмы "Pharmacia" (Швеция).
5. Гомополинуклеоиды poly (A), poly (С), poly(U) и ATP, СТР были приобретены у фирмы "Reanal" (ВНР.) .
6. 2-меркаптоэтанол был получен от фирмы "Koch-Light" (Великобритания) .
7. Лизоцимй №. С .:3 ..2..1.1.7 .) и немеченые аминокислоты мы получили от фирмы "Serva" (ФРГ).
8. Панкреатическая ДНаза была производства фирмы "Worthingon" (США) .
9. Полинуклеотидкиназа фага Т4 (Е ,:С.:2..7 .1.7.8 .) .была выделена в нашей лаборатории по методике (Weiss et al., 1967, 1968).
10. Щелочная фосфатаза Е.соїг. (Е ..С .:3 .1 .:3 .1.) и индивидуальные Phe Val тРНК (TPHK И TPHIC, ) были получены от фирмы "Boehringer, Mannheim" (ФРГ).
11. Клеточная масса E.col MRE 600 была приобретена во ВНИИ прикладной биохимии (г. Олайне, Латв.ССР). 1:2. Р-меченая клеточная масса E.ooli MRE 600 была получена по известной методике (Brownlee, 1978) . Р-РНК была экстрагиро 32 вана из клеток по методике (Ikemura & Nomura, 1977). [ Р] тРНК выделяли путем электрофореза в 10% полиакриламидном геле, содержащем 8 М мочевину (Donis-Keller et al., 1977:). Удельная активность для Р-меченой тРНК была около 10 -10 имп/мин на ед вещества.
13. Н- или С-меченые индивидуальные аминокислоты и [у- Р] АТР ( 2000 кюри/ммоль) были приобретены у фирмы "Amersham" (Великобритания) .
14. Рибосомы из клеток Е.ооЪг MRE 600 выделяли по методике, приведенной в (Held et al., 1973) или приобретали во ВНИИ прикладной биохимии. Субчастицы рибосом были получены из ВНИИ прикладной биохимии или выделялись по методике (Eikenberry et al., 1970).
1:5. Фракционирование белков 3 0S субчастицы было проведено сотрудниками нашей лаборатории М. Уставом и Э. Устав. На первом этапе фракционировали СБЗО на препаративной колонке с тРНК-Сефа-розой (20 мл, 3 5 мкг тРНК) в буфере 0,010 М Трис-HCl, рН 7,4, 0,10 М КС1, 0,001 М МдС12, 0,006 М 2-меркаптоэтанол. На колонке связывались белки S3, S4, S6, S7, S9, S12, S13, S18 и S2.0. На втором этапе эти же белки разделяли при помощи хроматографии на колонках с СМ-целлюлозой и сефадексом G100 в буфере, содержащем 6 М мочевину. Хроматографии проводили в условиях, соответствующих разделению белков 50S субчастицы (Wystup et al., 1979). Индивидуальные белки идентифицировали при помощи электрофореза на 15% ДСН-ПААГ по методике (Laemmli, 1970).или на двумерном электрофорезе (Howard & Traut, 1974). Концентрации индивидуальных белков определяли исходя из молярных коэфициентов поглощения белков (Venyaminov et al., 1981). Препараты белков сохраняли в заморо-жанном виде при -20С.
Результаты иммобилизации полинуклеотидов
Результаты иммобилизации poly(U), poly(С), poly(А) и РНК бактериофага MS2 на эпоксиактивированную сефарозу имели не одинаковые выходы реакций. Все иммобилизуемые синтетические полинуклеотиды - poly(U), poly(С), poly(А) - имели приблизительно одинаковую длину молекулы ( 200 нуклеотидов), однако, выход иммобилизации зависел от вторичной структуры полинуклеотидов. Лучше всего иммобилизовались poly(U), у которой вторичная структура (в условиях проводимых реакций) почти что отсутствует. Наиболее низкий выход имела poly(А). Однако известно, что последняя имеется достаточно сильную стэкинг-структуру (см. напр. Michelson et al., 1967). Выход иммобилизации РНК фага MS2 невелик из-за больших размеров молекулы.
Как правило, для иммобилизации использовали сефарозу 2В, т.к. выход реакций оказывался лучше, чем в случае сефарозы 4в или 6В (табл. 4).
2. Аффинная хроматография СБ70 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами
Перед аффинной хроматографией СБ7 0 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами проводили ряд контрольных экспериментов. Сперва приготовляли колонки с сефарозой и гидразидагарозой и наносили на эти колонки разные количества СБ7.0. Анализ элюата с колонок на ДСН-ПААГ позволял убедиться в том, что ни сефароза, ни гидразидагароза не способны связывать рибосомных белков в анализируемых количествах.
Далее проводили аффинную хрматографию СБ7 0 на колонках с иммобилизованными РНК бактериофага MS2, poly(U), poly(А) и poly(С). Изучали зависимость связывания белков от ионной силы в буфере связывания, от концентрации ионов магния и от концентрации нанесенного на колонки препарата СБ7.0. В целях выяснения возможного
- 75 кооперативного связывания белков 3 OS и 5OS субчастицы помимо экспериментов с СБ70 параллельно в экспериментах использовали препарат СБЗО.
Аффинная хроматография СБ70 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами
Контрольные эксперименты позволяли убедиться в том, что сефа-роза и гидразидагароза без иммобилизованного полинуклеотида неспособны связывать рибосомные белки в анализируемых количествах. Следовательно, имеется основание утверждать, что образование белковых комплексов в колонках с разными иммобилизованными полинуклеотидами отражает связывающую способность этих белков в отношении полинук-леотидов, а не адсорбцию белков на матрице геля или же приложенной к ней "ножке".
В ходе экспериментов методом аффинной хроматографии СБ70 на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами был получен ряд РНП комплексов, состав которых зависел от условий образования комплексов и от иммобилизованного полинуклеотида. Связывание некоторых рибосомных белков зависело от нуклеотидной последовательности матричного полинуклеотида, хотя ряд других белков образовывал РНП комплекс независимо от природы матрицы. Например, белки S18, S20, L15 и L16 входили только белковые комплексы, образованные на poly(U), а белки S12 и S14 предпочтительно связывались на иммобилизованные пиримидиновые полинуклеотиды. Со всеми используемыми иммобилизованными матричными полинуклеотидами (с РНК фага MS2, poly(A), poly(C) и poly(U) связывались белки S1, S3, S4, S5, S9, S13, L2 и L17. Следовательно, эти белки не предпочитают некую определенную последовательность матрицы и основой специфичности связывания этих белков видимо является однонитевая РНК.
По данным литературы известно, что белок S1 обладает аналогичной связывающей способностью: этот белок образует комплексы с иммобилизованной poly(A), poly(C) и poly(U) (Carmichael, 1975). Кроме того, белок S1 может образовывать комплекс с одноцепочными участками ДНК (Draper and Van Hippel, 1979).
Установлено, что белки S4, S9, S13, L2 и L17 образуют белковый комплекс на иммобилизованной 5,8S рРНК из печени крыс (Саарма и др., 1977; Toots et al., 1979). Поскольку показано, что в составе 5,8S рРНК располагаются однонитевые участки (Toots et al., 19 81), то можно предположить, что эти белки имеют место связывания именно в этих участках рРНК.
Подобное "неспецифическое" связывание некоторых рибосомных белков можно объяснить тем, что во время процесса элонгации нук-леотидная последовательность транслируемой части матричного поли-нуклеотида несет информацию о последовательности аминокислот в цепи синтезируемого полипептида и поэтому основой специфичности связывания мРНК с рибосомой не могут быть некоторые участки матричной РНК с определенными нуклеотидными последовательностями. Исходя из вышесказанного, в дальнейших исследованиях главное внимание было обращено именно на те белки, которые постоянно входили в состав белковых комплексов, образованных на разных иммобилизованных полинуклеотидах. Как видно из таблицы 5, такими белками являлись S3, S4, S5, S9, S13, L2 и Ы7.
