Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Определение и классификация РИБ 10
1.2. Токсины из растения омела белая (Viscum album L.) 12
1.3. Строение вискумина 14
1.3.1. Строение А-субъединицы вискумина 15
1.3.2. Строение В-субъединицы вискумина 15
1.3.3. Взаимодействие между субъединицами вискумина 18
1.3.4. Димеризация вискумина 19
1.4. Ферментативная активность РИБ 20
1.5. Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза 22
1.6. Биосинтез РИБ в растительных клетках 25
1.7. Физиологическая роль РИБ в растениях 28
1.8. Транспорт РИБ її в эукариотических клетках 32
1.9. Применение РИБ в медицине 35
1.9.1. Биологическая активность экстрактов омелы и их компонентов 36
1.9.2. Иммунотоксины и вакцины на основе РИБ 42
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Штаммы бактерий, плазмиды, ДНК-модифицирующие ферменты и реактивы .44
2.2. Выделение нативных токсинов и их субъединиц из растения Viscum album L...44
2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Ricinus communis 45
2.4. Выделение геномной ДНК из растения Viscum album L 46
2.5. Клонирование гена предшественника лектина омелы 47
2.6. Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединнцу токсического лектина омелы 49
2.7. Клонирование фрагмента гена, кодирующего В-субъединицу токсического лектина омелы 50
2.8. Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов 50
2.9. Предсказание антигенных детерминант в А- и В-субъединицах МЫ и MLIII ..51
2.10. Экспрессия рекомбинантных белков 52
2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков 52
2.12. Ренатурация рекомбинантных белков 54
2.13.Иммуноблоттинг 54
2.14. Иммуноферментный анализ (ИФА) 55
2.15. Бесклеточная система синтеза белка 56
2.16. Оценка углевод-связывающей способности рекомбинантных белков 56
2.17. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII с помощью сайт-направленного мутагенеза 57
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 61
3.1. Клонирование гена и Анализ последовательности предшественника токсического лектина омелы 61
3.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы 61
3.1.2. Анализ аминокислотной последовательности А-субъединицы токсического лектина омелы 66
3.1.3. Анализ аминокислотной последовательности В-субъединицы токсического лектина омелы 71
3.2. Получение рекомбинантных субъединиц токсического лектина омелы и исследование их активности 80
3.2.1. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических пектинов омелы 80
3.2.2. Предсказание антигенных эпитопов в А-субъедницах МЫ и MLIII 83
3.2.3. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной В-субъединицы токсического лектина омелы 89
3.2.4. Предсказание антигенных эпитопов в В-субъедницах МЫ и MLIII 94
3.2.5. Исследование каталитической активности рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы MLI и MLIII 97
3.2.6. Исследование углевод-связывающей способности рекомбинантной В-субъединицы токсина омелы MLIII 99
3.3. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц МЫ и MLIII 101
Выводы 106
Список литературы 107
- Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза
- Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединнцу токсического лектина омелы
- Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы
- Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических пектинов омелы
Введение к работе
Европейская омела (V. album L.) является паразитом хвойных и лиственных деревьев и кустарников и с древних времен широко используется в медицине как
ч лекарственное растение. Из зеленых частей растения выделяют три изоформы
токсических лектинов — MLI (вискумин), MLII и MLIII, которые по своему строению
* принадлежат к семейству рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ II). РИБ II
являются гетеродимерными гликопротеинами, состоящими из двух субъединиц с молекулярной массой каждой около 30 кДа, связанных между собой дисульфидной связью. А-Субъединица токсина является высокоспецифичным ферментом N-гликозидазой и выщепляет остаток аденина в положении 4324 28S рРНК 60S-субъединицы эукариотической рибосомы, приводя к остановке синтеза белка в клетке. В-Субъединица является пектином, который связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и вызывает агглютинацию клеток in vitro, а также способствует интернализации ферментативной субъединицы токсина путем эндоцитоза.
MLI, MLII и MLIII различаются между собой по молекулярной массе, а также углеводной специфичности. МЫ специфичен по отношению к галактозе, MLIII - к N-ацегилгалактозамину, a MLII имеет одинаковую аффинность к обоим сахарам. Тем не менее, сравнение аминокислотных последовательностей токсических лектинов омелы говорит о высокой степени их гомологии (>90%),
Токсические лектины омелы присутствуют во всех экстрактах омелы и являются основными их составляющими наряду с вискотоксинами и другими веществами небелковой природы. В настоящее время водные экстракты из листьев омелы белой используются в ряде стран Европы, Азии и Америки в качестве иммуномодулирующих и противоопухолевых препаратов в клинической практике. Токсины омелы MLI и MLIII обладают разной биологической активностью в отношении различных клеток млекопитающих. Чувствительность клетки-мишени к цитотоксическому действию лектинов омелы определяется содержанием гликозилированных рецепторов на ее
" поверхности. Для изолированных токсических лектинов и полных экстрактов омелы
показана способность стимулировать выработку цитокинов как in vitro, так и in vivo. Было найдено, что углевод-связывающая В-субъединица MLI стимулирует активность клеток - естественных киллеров (NK-клеток) in vivo, тогда как А-цепь была в тех же условиях полностью неактивна из-за неспособности связывания с углеводсодержащими
клеточными рецепторами. Применение экстрактов омелы в качестве дополнительных препаратов при лечении рака существенно снижает побочное действие химиотерапии.
Ранее нами была получена панель моноклональных антител против трех изоформ нативных ML-токсинов (MLI, MLII и МЫП), что позволило иммунохимически детектировать содержание токсинов и их изолированных субъединиц в фармакологических экстрактах омелы, используемых для терапии онкологических заболеваний. Успех терапии может быть связан с процентным содержанием МЫ, MLII и MLIII в различных экстрактах. В настоящее время в Германии проходят клинические испытания препарата рекомбинантного MLI. Рекомбинантный гетеродимерный токсин омелы MLIII предлагается для разработки нового антиопухолевого и иммуномодулирующего препарата, а также для исследования терапевтического эффекта его изолированных субъединиц.
Получение рекомбинантных токсических лектинов омелы и исследование их свойств поможет оценить влияние гликозилирования белка на его структуру и функции, приведет к пониманию процессов ренатурации белков и субъединичной гетеродимеризации. Создание трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные токсические лектины омелы, поможет оценить роль рибосом-инактивирующих белков II типа в жизни растений.
Каталитические субъединицы растительных токсинов применяют для конъюгирования с адресными молекулами (например, специфическими моноклональными антителами) при создании иммунотоксинов - препаратов направленного действия, способных избирательно элиминировать опухолевые клетки. Рекомбинантные токсины используют для создания генно-инженерных иммунотоксинов, которые имеют преимущества перед химически созданными белковыми конъюгатами из-за меньшей молекулярной массы, отсутствия гликозилирования, а также возможности вводить в них сигнальные последовательности, позволяющие изменить внутриклеточный транспорт и увеличить активность иммунотоксинов.
РИБ II используются в качестве удобной модели для исследования транспорта белков в эукариотических клетках. Во время своего продвижения к рибосоме РИБ II оказываются задействованными в различных механизмах транспорта: рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождении через эндосомальные компартменты, ретроградном переносе в аппарат Гольджи и эндоплазматическом ретикулум и, наконец, транслокации активной ферментативной части токсина из внутриклеточного
компартмента в цитозоль. Обычно создают конъюгаты токсических лектинов с флуоресцентными метками с помощью химических методов, а на основе рекомбинантных белков можно создавать химерные молекулы при слиянии генов токсинов и цветных флуоресцирующих белков. Введение в состав рекомбинантных токсических лектинов последовательностей сигнальных пептидов позволяет менять транспорт белков и изучать влияние различных сигнальных последовательностей на его направленность.
Однако при использовании РИБ II в подобных прикладных целях необходимо учитывать их высокую цитотоксичность по отношению к эукариотическим клеткам. Чтобы снизить отрицательное воздействие токсинов на клетки-мишени, предлагается использовать их ферментативно неактивные формы, созданные на основе рекомбинантных генов РИБ II путем внесения точечных мутаций в активный центр А-субъединиц. Получение таких форм токсических лектинов дает возможность изучать детальные механизмы транспорта РИБ II в эукариотических клетках без инактивации синтеза белка в них, приводящей к гибели клеток.
Способность токсинов к трансмембранному переходу дает возможность использовать их при создании генно-инженерных вакцин нового поколения как вектор для доставки в цитоплазму антиген-презентирующих клеток различных вирусных пептидов или опухолевых антигенов для стимуляции иммунного ответа организма против вирусов и других внутриклеточных патогенов или раковых клеток. Такие конъюгированные с токсинами пептиды доставляются внутрь эукариотической клетки и презентируются в составе комплекса с молекулой МНС I, что приводит к стимуляции цитотоксических лимфоцитов, направленных против данного патогена.
Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза
Строение каталитических субъединиц РИБ I и II типа было изучено с помощью РСА, и при сравнении третичных структур определили сходный для всех РИБ сайт, участвующий в связывании субстратного остатка аденина. Как было найдено при сравнении первичных последовательностей белков, входящие в этот сайт аминокислотные остатки у разных РИБ являются инвариантными [Funatsu et al., 1991]. У вискумина данные а.о. представлены Туг76, Тугі 15, Glul65, Argl68 и Trpl 99 [Soler et al., 1996] (см. рис. 1.3). Аминокислоты Asn74, Argl26, Glnl62 и Glul97, формирующие окружение активного центра, участвуют в поддержании его структуры [Katzin et al., 1991]. Данные РСА рицина [Day et al., 1996], трихосантина [Xiong et al., 1994] и антивирусного белка фитолакки (pokeweed antiviral protein, PAP) [Monzingo et al., 1993] свидетельствуют о том, что субстратный остаток аденина за счет стэкинговых взаимодействий с инвариантными остатками тирозина (Y80 и Y123 в RTA, Y70 и Y111 в трихосантине, Y72 и Y123 в РАР) удерживается в полости активного центра, причем первый тирозин через молекулу воды соединен с атомом N-9 аденина. Остаток аргинина формирует водородную связь с атомом N-3 аденина, а глутаминовая кислота - с атомом 0-3\ Также важную роль среди а.о., поддерживающих структуру активного центра, играет Asnl22, боковая цепь которого взаимодействует со вторым остатком гуанина в специфическом тетрануклеотиде GAGA, как показано на рицине [Marsden et al., 2004]. Замена N122S снижала ферментативную активность белка в 37,5 раз.
Чтобы установить вклад в активность фермента каждого из инвариантных а.о., составляющих активный центр, на А-субъединицах вискумина (MLIA), рицина (RTA), абрина (ABA) и Шига-подобного токсина-1 (SLT-1A), а также на РИБ I типа трихосантине исследовали влияние различных мутаций (делеций и замен) на действие токсина в бесклеточной системе синтеза белка и на выщепление аденина в 28S рРНК эукариотической рибосомы.
Для заряженных аминокислотных остатков активного центра — глутаминовой кислоты и аргинина было показано, что они являются важными в активности белка. Одиночные делеций этих а.о. у RTA - Е177 и R180 делали белок неактивным в отношении выщепления аденина в 28S рРНК [Munishkin and Wool, 1995].
Двойная мутация, приводящая к замене заряженных а.о. на незаряженный полярный а.о. глутамин E165Q R168Q в MLIA снижала активность белка в бесклеточной системе синтеза белка в 237 раз [Langer et aL, 1999]. Одиночные мутации аналогичных Е165 (по номенклатуре ML-токсинов) а.о. в других белках на глутамин приводили к уменьшению активности белков в 200 раз при замене E177Q у RTA [Ready et al., 1991] и в 400 раз при замене E167Q у SLT-І A [Yamasaki et al., 1991].
Однако, замены аналогичной R168 (по номенклатуре ML-токсинов) а.о, у рицина на незаряженный полярный а.о. R180Q или на неполярные гидрофобные а.о. R180A и R180M давали сильно преципитирующие мутантные формы белка [Frankel et al., 1990], так как положительный заряд необходим для правильного сворачивания молекулы, поэтому активность этих белков не оценена. В то же время, замена R170L у SLT-1A снижала активность белка в 200 раз [Yamasaki et al., 1991], а замена R167L у ABA - в 625 раз [Hung at el., 1994]. Двойная мутация в абрине, приводящая к замене заряженных а.о. на неполярные гидрофобные а.о. E164A R167L снижала активность в 1250 раз [Hung at el., 1994]. Одиночные замены аналогичных Е165 а.о. (по номенклатуре ML-токсинов) в других белках на неполярные гидрофобные а.о. аланин или лейцин (Е177А у RTA [Schlossman et al., 1989; Frankel et al., 1990], E164A у ABA [Hung et al., 1994]; E167L у SLT-1A [Yamasaki et al., 1991]) снижали активность А-цепей белков в 20-40 раз. Такое небольшое снижение активности может объясняться тем, что мутантный а.о. Е177-»А в активном центре у RTA может замещаться Е208 (Е196 по номенклатуре ML-токсинов). Одиночная мутация E208D (замена глутаминовой кислоты на аналогичную а.о. с более короткой боковой цепью) почти не влияла на активность А-цепи (уменьшение активности в 1,42 раза), а двойная мутация E177A E208D снижала активность более чем в 200 раз [Frankel et at., 1990]. Видимо, более короткая боковая цепь аспарагиновой кислоты не может занять нужное положение в активном центре молекулы. При этом конформация активного центра фермента не меняется, несмотря на удаление двух отрицательных зарядов, как было показано на трихосантине (РИБ I) с двойной мутацией Е160А Е189А [Shaw et al., 2003].
Подобная замена глутаминовой на аспарагиновую кислоту E177D у RTA снижала активность в 100 раз [Schlossman et al„ 1989], что вероятно объясняется невозможностью участия в ферментативной активности более короткой боковой цепи аспарагиновой кислоты, а для Е208 невозможностью заменить ее в активном центре из-за электростатического отталкивания между одинаково заряженными а.о. Замена E167D у SLT-1A по разным данным приводила к уменьшению активности белка от 220-400 раз [Deresiewicz et al., 1992] до 1000 раз [Hovde et al., 1988], хотя у SLT-1A аналогичным а.о. Е208 у RTA является Т200.
Делались также мутации положительно заряженного аргинина на аналогичные а.о. лизин и гистидин. У рицина замена R180K снижала активность всего в 2,67 раза, а замена R180H - в 200 раз [Frankel et al., 1990], такая разница в эффекте мутаций объясняется тем, что гистидин на протонируется при физиологических значениях рН. При этом было показано, что замена R180H приводит к перегруппировке инвариантных а.о. в структуре активного центра рицина, что приводит к блокированию Y80 и невозможности его взаимодействия с субстратом [Day et al., 1996]. Но у SLT-1A влияние этих же мутаций на активность белка было примерно одинаково: замена R170K снижала активность в 100 раз, а замена R170H - в 70 раз [Yamasaki et al., 1991].
Среди инвариантных аминокислот в активном центре РИБ есть ароматические остатки - полярные незаряженные Y76 и Y115 и неполярный гидрофобный W199 (по номенклатуре ML-токсинов). Мутации ароматических а.о. Y80 и Y123, входящих в активный центр RTA, на фенилаланин (неполярную гидрофобную а.к.) слабо влияли на активность белка [Ready et al.f 1991], а замена W211F снижала активность в 9 раз [Bradley and McGuire, 1990]. Но одиночные замены тирозинов в положениях 80 и 123 на серии (незаряженную полярную неароматическую аминокислоту) сильно снижали активность: Y80S - в 200 раз, Y123S - в 100 раз [Kim and Robertus, 1992]. Делеция Y123 не влияла на активность RTA в отношении выщепления аденина в 28S рРНК, а делеция W211 делала белок неактивным [Munishkin and Wool, 1995].
В случае SLT-1A мутация Y77F снижала активность токсина в 10—20 раз, а замена Y77S - в 100 раз [Deresiewicz et al., 1992]. Замена W203F приводила к уменьшению активности в 60 раз, замена W203L (на неполярную гидрофобную аминокислоту) - в 25 раз, а замена W203H (на положительно заряженную полярную аминокислоту) - в 65 раз [Yamasaki et al., 1991].
Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединнцу токсического лектина омелы
В данной работе для клонирования и экспрессии рекомбинантных генов токсических пектинов омелы использовались клетки Escherichia coli двух разных штаммов. Е. coli штамм LE392 (hsdR574(x - тк+) supE44 supF58 lacYl galK.2 galT22 metBl trpR55) были приобретены в фирме "Promega" (США). Е. coli штамм BL21 [В F" dcm ompT hsdSs 0- тв ) gal\ (DE3) были приобретены в фирме "Novagen" (США). Плазмида pUC19 ("Fermentas", Литва) использовалась для клонирования и секвенирования полного гена предшественника токсического лектина омелы, плазмида рЕТПс joe, любезно предоставленная проф. А. Пателем из Института вирусологии медицинского исследовательского центра Глазго, Великобритания, использовалась для экспрессии гена ферментативной субъединицы токсина.
Олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР были синтезированы компаниями "Синтоп" (Россия) и "QIAGEN GmblF (Германия). ДНК-Модифипирующие ферменты: Та -ДНК полимераза и полимеразная система High Fidelity PCR Enzyme Mix, эндонуклеазы рестрикции, щелочная фосфатаза, Т4-ДНК лигаза и фрагмент Кленова были приобретены в фирме "Fermentas" (Литва). Для выделения плазмидной ДНК и очистки ПЦР-продуктов использовались оборудование и реактивы производства компании "QIAGEN GmbfT (Германия).
Все применявшиеся химические реактивы были качества ч.д.а. и приобретены в компании «Sigma» (Германия). Токсические лектины МЫ, MLII и MLIII выделяли из листьев омелы белой (Viscum album L.). Образцы омелы собирали в Германии с одного дерева-хозяина сосны и высушивали на воздухе при комнатной температуре, К 50 г высушенного и измельченного материала добавляли 200 мл 0,2 М уксусной кислоты и гомогенизировали в течение 5-6 мин до получения однородной массы. Полученную массу фильтровали через бумажный фильтр и рН фильтрата доводили до 4,0. Далее фильтрат наносили на колонку с SP-сефадексом (2,5 х 12 см), уравновешенную 0,2 М ацетатным буфером, рН 4,0, а затем промывали этим же буфером до оптической плотности при 280 нм 0,1 о.е. Элюцию проводили 0,15 М трис-HCl с 0,5 М NaCl, рН 8,0. Для выделения лектинов полученный элюент пропускали через колонку с IgG- сефарозой (2x1 Осм), уравновешенной 0,15 М трис-HCl с 0,5 М Nad, рН 8,0. Колонку промывали этим же буфером до ОПгвонм 0,1 о.е. и элюировали связавшиеся лектины 0,5 М уксусной кислотой, рН 2,6. В полученном растворе доводили рН до 7,4 с помощью 1 М NaOH. Белок осаждали сульфатом аммония при 50% насыщения.
Разделение токсических лектинов MLI, MLII и MLIII проводили по ранее опубликованной методике [Tonevitsky et al., 1996]. Для этого использовали колонку с лактозил-сефарозой 4В (общая лектиновая емкость 15 мг/мл). На колонку, содержащую 5 мл сорбента, наносили 30 мг смеси лектинов и промывали ФСБ. MLI1 и MLIII элюировали 2,5 мМ N-ацетил-галактозамином, а МЫ - 100 мМ лактозой в ФСБ. Разделение ML11 и MLIII токсинов проводили на хроматографе FPLC с колонкой Mono S HR (5 мм х 5 см), уравновешенной 0,015 М цитратным буфером, рН 4,2. 5 мг отдиализованного белка наносили на колонку, связавшийся белок элюировали линейным градиентом 0-500 мМ NaCl (общий объем 30 мл), а затем 1 М NaCl.
А-субъединицу MLI получали с помощью аффинной хроматографии. 25 мг белка в ФСБ наносили на колонку лактозил-сефароза 4В (5 мл), отмывали 25 мл ФСБ, А-субъединицу элюировали 2% 2-меркаптоэтанолом в ФСБ со скоростью 0,15 мл/мин, диализовали и концентрировали. Обогащенную фракцию В-субъединицы элюировали 100 мМ лактозой в ФСБ. Дальнейшую очистку В-субъединицы вискумина проводили на колонке с иммобилизованными моноАТ против MLIA (ТА5) [Tonevitsky et al., 1995].
Степень чистоты препаратов лектинов омелы и субъединиц MLI оценивали с помощью электрофореза по Лэммли [Laemmli, 1970] в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ), а также с помощью иммуноферментного анализа с использованием моноАТ к изолированным субъединицам токсинов.
Рицин выделяли из семян клещевины (Ricinus communis), разделяли на субъединицы и очищали в соответствии с описанной методикой [Tonevitsky et al., 2002]. 300 г семян гомогенизировали в 1,5 л 5мМ Na-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащем 200 мМ NaCl. Экстракцию проводили при 4С в течение суток при непрерывном помешивании. Гомогенат центрифугировали 30 мин при 10000g, к супернатанту добавляли сульфат аммония до 60% насыщения и инкубировали в течение ночи при 4С. Затем взвесь центрифугировали при lOOOOg 30 мин, осадок растворяли в 5мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 200 мМ NaCl, и диализовали против этого же буфера. Очистку лектинов проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с активированной сефарозой-4В, уравновешенной ФСБ, рН 7,4. Лектины элюировали с колонки 100 мМ раствором лактозы в ФСБ. Разделение рицина и агглютинина рицина проводили с помощью гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-200.
А-субъединицу рицина получали с помощью аффинной хроматографии. 25 мг белка в ФСБ наносили на колонку лактозил-сефароза 4В (5 мл), отмывали 25 мл ФСБ, А-субъединицу элюировали 2% 2-меркаптоэтанолом в ФСБ со скоростью 0,15 мл/мин. Препарат А-субъеднницы диализовали против ФСБ и концентрировали. Фракцию, обогащенную В-субъединицей, элюировали 100 мМ лактозой в ФСБ. Далее препарат наносили на колонку с DEAE-целлюлозой в 100 мМ трис-буфере, рН 7,6. В этих условиях А-субъединица не сорбируется и элюируется в свободном объеме колонки, а В-субъединица элюируется линейным градиентом NaCl (0-200мМ) в том же буфере.
Чистоту полученных препаратов рицина и его субъединиц оценивали с помощью электрофореза в 12,5%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 200 мг высушенного и измельченного материала суспендировали в 10 мл 100 мМ трис-буфера, рН 8,0, содержавшем 100 мМ ЭДТА, 250 мМ NaCl и 100 мкг/мл протеиназы К, добавляли 1% (об.) N-лаурилсаркозина и инкубировали полученную суспензию при 55С в течение 1 часа при перемешивании. Затем взвесь центрифугировали при 5000g 20 мин, супернатант переносили в микроцентрифужные пробирки и добавляли к раствору половину объема фенола для экстракции белков, тщательно перемешивали взбалтыванием и оставляли на 1 час при комнатной температуре. После центрифугирования при 7000g 10 мин повторно проводили фенольную экстракцию и центрифугирование. К супернатанту добавляли равный объем хлороформа для удаления остатков фенола, взбалтывали раствор и через 10 мин центрифугировали при 7000g 10 мин. Для осаждения ДНК к супернатанту добавляли равный объем изопропанола, перемешивали раствор и оставляли на 30 мин при -20С, после чего центрифугировали при 12000g 15 мин. После удаления супернатанта осадок обмывали 70%-ным этанолом, снова центрифугировали и высушивали осадок на воздухе. Полученный осадок растворяли в воде и анализировали ДНК с помощью электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле. Концентрация ДНК определялась спектрофотометрически по оптической плотности раствора при длине волны 260 нм (спектрофотометр "Beckman DU-7500", США). Выделенная геномная ДНК омелы использовалась в ГЩР для амплификации генов токсических лектинов.
Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы
В аминокислотной последовательности rMLgB было найдено десять остатков цистеина, как и у В-субъединиц лектинов из Европейской омелы MLIII, ML2p и ML3p и Корейской омелы KML-1, KML-2 и KML-3, тогда как в МЫВ и МЫВр их девять, а в VCA-B - восемь. Дополнительный цистеин является результатом мутации Ser40— Cys, поэтому MLIIIB, KML-B1, KML-B2 и KML-B3 могут формировать еще одну дисульфидную связь с Cys21 в N-терминальном домене белка, что характерно для В-субъединиц других РИБ II.
Несмотря на высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности (рис. 3.4 и 3.6), токсические лектины омелы МЫ и MLIII проявляют различную аффинность к углеводам. Главное отличие между МЫВ и MLIIIB в связывании Сахаров состоит в большей аффинности MLIB к галактозе, а MLIIIB - к N-ацетилгалактозамину [Franz et al., 1981, Ziska et ai., 1993, Wu et al., 1992]. Кроме MLIIIB аффинность к N-ацетилгалактозамину отмечена для RTB и SNAVB. Сравнение аминокислот, входящих в состав углевод-связывающих сайтов этих белков (см. рис. 1.4), может дать объяснение, как различия в первичной структуре могут влиять на углеводную специфичность.
Изменения аминокислот в положениях 27 и 38 могут влиять на структуру и свойства N-терминального углевод-связывающего сайта rMLgB. В N-терминальном углевод-связывающем сайте MLIB пространство, необходимое для размещения ацетамидной группы N-ацетилгалактозамина, блокировано боковыми цепями аминокислотных остатков, образующих этот сайт [Niwa et al., 2003], поэтому МЫВ не проявляет специфичности к GalNAc. В частности, Asp27 у MLIB может вызывать стерическое препятствие для N-ацетильной группы. В случае rMLgB Asp27 заменен на Gly и структуре В-цепи рицина в этом положении также находится остаток глицина. Замена Asp27-»Gly по сравнению с MLIB наблюдается в структуре В-субъединиц всех анализированных лектинов омелы, кроме MLlBp, который на 99% совпадает с MLIB, и ML3Bp. Но в составе В-субъединиц всех рассмотренных лектинов омелы присутствует а.о. Asp45, соответствующий Asp44 в RTB, который также препятствует связыванию GalNAc. Из-за наличия остатка аспартата N-терминальный углевод-связывающий центр RTB не проявляет аффинности к N-ацетилгалактозамину [Rutenber and Robertus, 1991], также как N-концевой сайт MLIB и, возможно, MLIIIB.
Одной из важных замен, отмеченных у рекомбинантной В-цепи, а также у MLIIIB и ML2Bp, является замена Тгр38 у MLIB на Ser в области N-концевого сахар-связывающего сайта. Триптофан здесь участвует в стэкинговом взаимодействии с гидрофобной плоскостью связываемого остатка галактозы, и аминокислотные остатки с боковой ароматической цепью консервативно сохраняются в этом положении в углевод-связывающих субъединицах РИБ II (рис. 3.6, 3.7). Предполагается, что в результате замены Тгр38 на Ser у токсического лектина омелы MLIII значительно снижается аффинность к сахарам. Так как MLIII является мономерным лектином, потеря способности связывания углеводов в одном из двух сайтов приведет к утрате агглютинирующей активности. Франц и др. [Franz et al., 1981] сообщают, что концентрация токсических лектинов омелы MLII и MLIII, необходимая для гемагглютинации, значительно выше, чем в случае MLI, и они агглютинируют более медленно.
Изменения аминокислотных остатков в положениях 239, 242 и 254 являются важными для С-терминального углевод-связывающего сайта В-субъединицы РИБ II. GalNAc связывается в С-терминальном углевод-связывающем центре В-цепи рицина [Hatakeyama et aL, 1986], то есть в структуре RTB имеется достаточное пространство для данного сахарида. В С-терминальном углевод-связывающем сайте MLIB боковая цепь аминокислоты Lys254 стерически препятствует размещению N-ацетильной группы GalNAc [Lee et al.s 1994]. У rMLgB и В-субъединиц лектинов омелы MLIIIB и ML2Bp из Европейской омелы в положении 254 находится аминокислотный остаток Asn. Остаток Asn находится в соответствующем этому положении у В-субъединицы нигрина b (SNAVB), специфичного к GalNAc [Van Damme et al., 1996]. Если рассматривать аминокислотный остаток в этом положении у лектинов в отношении длины боковой цепи, то наличие остатка Asn254 у В-субъединицы MLIII и других токсинов омелы соответствует остатку аспартата у RTB. Можно предположить, что более короткая боковая цепь аминокислот (Asn, Asp) не вызывает пространственных препятствий для ацетамидной группы при связывании N-ацетилгалактозамина.
Другой важный аминокислотный остаток в С-терминальном углевод-связывающем центре RTB - Ser238, чья боковая цепь образует водородную связь с N-ацетильной группой GalNAc [Rutenber and Robertus, 1991]. В этом положении у MLIB находится А1а239, который не может формировать аналогичную водородную связь. У остальных лектинов омелы здесь располагается Ser239. Можно предположить, что этот остаток серина критичен для связывания N-ацетилгалактозамина. Это подтверждается фактом, что в структуре SNAVB в этом месте также находится серии. В В-субъединице абрина-а аминокислотные остатки, аналогичные Lys254 и А1а239 у MLIB, представлены лизином и серином, соответственно, но абрин-а проявляет большую аффинность к галактозе, чем к GalNAc [Franz et al., 1981; Wu et al., 2001].
Различная аффинность к углеводным остаткам галактозы и N-ацетилгалактозамина между В-цепями токсических лектинов омелы свидетельствует о несхожести в строении углевод-связывающих сайтов В-субъединиц и в их аминокислотном составе. Проведенный нами анализ подтверждает влияние отдельных аминокислотных остатков, составляющих углевод-связывающие сайты в В-субъединицах лектинов, на углеводную специфичность белка. Также ранее было найдено, что моноАТ ТВЗЗ, полученные против В-цепи МЫ, не узнают В-субъединицы ML1I и MLIII токсинов (Tonevitsky et al., 1995], что также говорит о разнице в аминокислотах, представляющих антигенные эпитопы в молекуле.
Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических пектинов омелы
Как уже было сказано, лектнновые субъединицы ML-токсинов различаются по специфичности к сахарам, определяемой аминокислотным составом углевод-связываюших сайтов (см. раздел 3.1.4). Кроме а.о., входящих в эти сайты, в последовательности MLIIIB отмечены замены других остатков по сравнению с MLIB. Ранее было показано, что моноклональные антитела МТС 12 аффинны к ML1II [Темяков и др., 1997], и в данной работе была определена специфичность моноАТ МТС 12 к В-субъединице токсина (рис. 3.12). В то же время моноАТ ТВ 12 взаимодействуют только с В-субъединицей токсина омелы МЫ [Tonevitsky et al., 1995]. МоноАТ ТВ 12 узнают токсины в нативном состоянии и в иммуноблоте, поэтому мы сделали предположение, что антигенный эпитоп для них расположен на поверхности белка и является линейным. При этом было показано, что взаимодействие МЫВ с моноАТ ТВ 12 отменяется при связывании лектина с остатками галактозы на гликозилированном белке асиалофетуине, из чего сделан вывод, что антигенный эпитоп находится рядом с одним из углевод-связывающих сайтов В-субъединицы [Tonevitsky et al., 1995]. МоноАТ МТС12 реагируют только с нативной конформацией токсинов омелы, и не узнают денатурированные белки в иммуноблоте, поэтому можно предположить, что антигенные эпитопы для них расположены на поверхности молекулы.
Сравнение аминокислотных последовательностей В-субъединицы МЫ и rMLgB (В-субъединицы MLIII) позволяет сделать предсказание о возможном расположении в белках МЫ и MLIII антигенных эпитопов для полученных ранее моноклональных антител. Для этого мы рассматривали третичную структуру вискумина flOOL (PDB NCBI); Niwa et al., 2003] с целью обнаружения наиболее иммуногенных участков белка. Также оценивались значения параметров, влияющих на антигенность белка: гидрофильности аминокислотных остатков в линейной последовательности [Норр and Woods, 1981], подвижности отдельных участков молекулы, доступности их растворителю и образуемых ими элементов вторичной структуры [Jameson and Wolf, 1988].
Для определения расположения отдельных аминокислот в молекуле вискумина трехмерная модель вискумина просматривалась с помощью программы "Cn3D" (v. 4.1) в режиме "заполненное пространство". В структуре молекулы вискумина мы выделяли аминокислоты, различающиеся в сиквенсах В-субъединиц МЫ и MLII1. Остатки, находящиеся внутри глобулы и в зоне контакта А- и В-субъединиц (см. таблицу 3.4), в дальнейшем не рассматривались. Оставшиеся поверхностные а.о. составили три возможных эпитопных участка (D27-Q34, V166-K170, К254-Р255), для которых оценивали другие параметры, характеризующие иммуногенность. Важно отметить, что два из этих участков (D27-Q34 и К254-Р255) располагаются в непосредственной близости от углевод-связывающих сайтов В-субъединицы вис кумина, и входящие в них а.о. взаимодействуют с остатком связываемой галактозы (рис. 1.4).
Аминокислотные последовательности В-субъединиц MLI и MLIII анализировали по алгоритму Джеймсона и Вульфа (рис. 3.14) для предсказания гибкости полипептидной цепи. Было найдено, что во всех трех возможных антигенных эпитопах подвижность а.о. в молекуле МЫВ достаточно высока, как и у МЫИВ, а в области одного участка (а.о. 166-170) у В-субъединицы MLIII подвижность заметно выше.
Также рассматривали распределение заряженных аминокислотных остатков на поверхности В-субъединиц МЫ и MLIII в области выявленных участков. Гидрофильность белков оценивалась как на трехмерной модели вискумина с помощью программы "Cn3D", так и для сиквенсов МЫВ и МЫПВ по алгоритму Хоппа и Вудса (рис. 3.14). Оказалось, что у МЫВ наиболее гидрофильным является участок D27-Q34, а МЫПВ отличается от В-субъединицы МЫ повышением заряда в области 166-170 за счет появления остатков Lysl69 вместо Gin в МЫВ и Glul70 вместо Lys.
Исследование с помощью программы "Cn3D" вторичной структуры, образованной аминокислотами из определенных выше участков показало, что все три области в молекуле вискумина представлены неупорядоченными цепями, соединяющими Р-слои, Как правило, такие структуры оказываются наиболее иммуногенными [Gamier et al., 1978].
Таким образом, на основании рассмотренных параметров антигенности двух белков и их сравнения можно сделать вывод о расположении возможных антигенных эпитопов для взаимодействия со специфическими моноАТ. Вероятнее всего, что в В-цепи MLI ключевым для взаимодействия с моноАТ ТВ 12 является максимально иммуногенный участок, включающий а.о. 27-34 и располагающийся вблизи N-терминального углевод-связывающего сайта. Однако нельзя также исключать возможность взаимодействия моноАТ ТВ 12 с участком 254—256, находящимся рядом с С-терминалъным углевод-связывающим сайтом В-субъединицы. Для взаимодействия с анти-MLIIIB моноАТ МТС 12 важной оказывается область 166-170, где антигенность в молекуле MLIIIB повышается по всем характеристикам по сравнению с МЫВ. В таблице 3.6 суммированы результаты предсказания антигенных эпитопов для специфичных моноАТ, различающих В-субъединицы MLI и MLIIL
В работе были исследованы ферментативные свойства рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы MLIII (rMLgA) и МЫ (rMLIA) и нативной А-субъединицы МЫ (МЫА) как специфических N-гдикозидаз, действующих на эукариотические рибосомы и приводящих к ингибированию синтеза эндогенного белка глобина в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика.
Показано, что рекомбинантный белок rMLgA проявляет активность в бесклеточной системе синтеза белка, вызывая снижение включения [ Н]-лейцина в состав синтезируемого глобина на 60%. Однако нативная (MLIA) и рекомбинантная (гМЫА) А-субъединицы вискумина в той же концентрации (800 нг/мл) были более активны (снижение включения метки на 89 и 81%, соответственно) (рис. 3.15, б). Подобные различия в активности между А-субъединицами токсинов могут объясняться тем, что препарат рекомбинантного белка rMLgA содержит некоторое количество неправильно свернутых в области активного центра молекул, определяемых в ИФА, но не проявляющих активность в бесклеточной системе синтеза белка. Также отмеченные выше отличия в числе заряженных аминокислот и общем заряде белка при рН 7,4 в буфере ренатурации у А-субъединиц токсических лектинов MLI и MLII1 могут влиять на процесс сворачивания рекомбинантных белков из денатурированного состояния.
