Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 .Явление рестрикции-модификации 1О
Системы рестрикции-модификации типа I 12
Системы рестрикции-модификации типа II 13
Системы рестрикции-модификации подтипа IIG 14
Системы рестрикции-модификации типа III 15
Распространение систем рестрикции-модификации 16
Молекулярная организация систем рестрикции-модификации 17
Регуляция экспрессии генов в системах Р-М типа I и III 18
Регуляция экспрессии генов в системах Р-М типа II 20 1.9.1 .Регуляция экспрессии генов СРМ за счет действия ДНК- 20
метилтрансфераз
1.9. La. Регуляция экспрессии генов за счет ковалентной модификации 20
промоторньгх элементов
1.9.1.6. ДНК-метилтрансфераза - авторегулятор собственного синтеза 23
Регуляция на пост транскрипционном уровне 27
Регуляция экспрессии генов СРМ С-белками 29 1.9.3.а. Структурная организация генов СРМ типа II, контролируемых С- 29
белками; организация «С-боксов».
1.9.3.6. Механизмы регуляции генов СРМ типа II С-белками. 34
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 38
ИЛ Материалы и реактивы 38
II. 1.1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора 38
II. 1.2. Среды и основные буферы 38
И. 1.3. Материалы и реактивы 39
II.2. Методы исследования 40
Выделение плазмидной ДНК 40
Получение препарата фага k-vir в высоком титре 40 П.2.3. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация 40 II.2.4. ПЦР^мплификация ДНК 41
т.2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК 41
2.6. Метод задержки в геле комплексов ДНК-белок 41
II.2.7. Определение транскрипционной активности промоторов
П.2.8.1. Защита ДНК от расщепления ДНказой I 42
П.2.8.2. Перманганнатная проба. 43
П.2.9. Выделение тотальной РНК и реакция удлинения праймера 43
П.2.10. Определение и анализ первичной последовательности ДНК 44
Электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях 44
Определение активности галактокиназы 45 П.2.13. Определение Р- галактозидазы 45 П.2.14. Проведение реакций модификации ДНК 46 П.2.15. Плазмидные конструкции 46 П.2.16. Экспрессия и очистка белков 47
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48
III. 1. Регуляция СРМ Ahdl 48
III. 1.1. Анализ первичной последовательности структуры генов ahdIM- 48
ahdIS и ahdIC-ahdIR.
III. 1.2. Экспрессия генов СРМ Ahdl in vivo. 50
III. 1.3. Взаимодействие регуляторного белка С.Ahdl с операторным 51
участком «С-бокс».
III. 1.4. С-белок регулирует транскрипцию in vitro с промотора гена ЭР 56
VahdICR.
III. 1.5. Активность промотора гена ahdIM зависит от модификации 59
уникального сайта Ahdl.
Ш.2. Регуляция СРМ типа II Espl396l. 61
Ш.2.1. Анализ первичной последовательности структуры генов 61
espl396IC- espl396IR и espl396IM.
Ш.2.2. Экспрессия генов СРМ типа II Espl396l in vivo. 63
Ш.2.3. Клонирование гена espl396IC и очистка рекомбинантного белка 65
C.Espl396I.
Ш.2.4. Определение участка связывания для регуляторного белка 65
N6His-C.Espl396I.
Ш.2.5. Взаимодействие регуляторного белка C.Espl396I с промоторно - 67
операторными участками.
Ш.2.6. C.Espl396I позитивно регулирует транскрипцию гена - 71
espl396ICR in vitro.
Ш.2.7. Дополнительный механизм регуляции espl396IRl 1Ъ
Ш.2.8. C.Esp 13961 негативно регулирует транскрипцию гена espl936IM 74
in vitro.
Ш.З. Регуляция СРМ типа II EcoRV. 16
Ш.3.1. Анализ первичной последовательности структуры генов СРМ 16
типа II EcoRV.
Ш.З.2. Для полноценной работы генов СРМ EcoRV необходим продукт 77
малой ОРС.
III.3.3. Влияние C.EcoRV на экспрессию генов СРМ EcoRV in vivo. 78
Ш.З.4. Взаимодействие регуляторного белка C.EcoRV с «С-боксом». 79
Ш.З.5. Влияние C.EcoRV на транскрипцию с промоторов генов СРМ 81
EcoRV in vitro.
Заключение 82
ВЫВОДЫ 83
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 84
БЛАГОДАРНОСТЬ 97
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Абоо/ОДбоо - оптическая плотность при 600 нм
АТР - аденозин-5'-трифосфат
СТР - цитидин-5' -трифосфат
GTP - гуанозин 5' -трифосфат
UTP - уридин 5' -трифосфат
dATP - дезоксиаденозин-5'-трифосфат
dCTP - дезоксицитидин-5'-трифосфат
dGTP - дезоксигуанозин-5'-трифосфат
dTTP - дезокситимидин-5'-трифосфат
SAM - S-Аденозилметионин (8-(5'-дезоксиаденозин-5') метионин)
S-D - Shine - Dalgarno
SDS - (ДДС-Na) - додецил сульфат натрия
RBS - сайт связывания рибосомы
TEMED - N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамин
X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-уалактозид
а.о. - аминокислотные остатки
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДНК-аза I - дезоксирибонуклеаза I
ДТТ - дитиотреитол
ИПТГ - изопропилтио-Р-О-галактозид (изопропил-І-тио-р-О-галактопиранозид)
кДа - килодальтон
мМ - миллимоль
МТ - ДНК метилтрансфераза
НТФ/NTP - нуклеозидтрифосфат
нм - нанометр (оптическая длина волны)
н.п. - пар нуклеотидов
об./мин - скорость вращения ротора
ОРС - открытая рамка считывания
ПААГ - полиакриламидный гель
пМ - пикомоль (молекулярная масса)
ПСА - персульфат аммония
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
СПС - Спираль-Поворот-Спираль мотив (НТН)
СРМ - система рестрикции-модификации
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
ЭДТА/Ма2-ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭР - эндонуклеаза рестрикции
Введение к работе
Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано свыше 3800 СРМ у различных видов бактерий и археобактерий (Roberts et al., 2005). Системы рестрикции-модификации II типа состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК: эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в немодифицированном- сайте узнавания,-Метилирование цитозиновых или адениновых оснований в сайте узнавания ДНК-метилтрансферазой с образованием полуметилированного или полностью метилированного сайта защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. Для некоторых СРМ типа II, например, ВатШ, Pvull, соО1091 и EcoRV было показано наличие дополнительного гена, кодирующего короткий регуляторный белок С (controller) (Ives et al., 1992; Tao et al., 1991; Kita et al., 2002; Zheleznaya et al., 2003).
Большинство изученных СРМ ведут себя, как эгоистические мобильные генетические элементы, приводящие к постсегрегационной гибели клетки (Dawkins,1989; Lubys et al., 1995; Kulakauskas et al., 1995; Kobayashi, 2004): те хозяйские клетки, которые теряют гены рестрикции-модификации, погибают за счет действия» ЭР' после потери защиты, обусловленной действием МТ (Engelberg-Kulka et al., 1999). Таким образом, СРМ действуют как системы токсин-антитоксин, также называемые «аддиктивными модулями». При этом роль долгоживущего токсина выполняет ЭР, а антитоксином, защитное действие которого ограничено во времени, является МТ. По мнению Arber (Arber, 2003) и Price и др. (Price et al., 1986), СРМ также принимают участие в инициации рекомбинации ДНК клетки-хозяина.
Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющие плазмиды СРМ, так и в бактерии других видов (Bickle and Kruger, 1993; Price et al., 1986). Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в «наивную» клетку, не имеющую такой- системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В< противном случае, возможна гибель хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР (или недостаточной продукции МТ). Вместе с хозяином погибнет и плазмида с генами рестрикции-модификации - исход явно нежелательный с точки зрения эгоистического генетического элемента. Способность плазмид, содержащих гены рестрикции-модификации, к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование, а именно, что регуляция экспрессии генов СРМ должна быть относительно
независима от хозяйских регуляторных факторов, которые могут быть разными у разных бактерий. Однако, несмотря на очевидное существование регуляции генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Это определяет актуальность всестороннего изучения процессов регуляции экспрессии генов систем рестрикции-модификации.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов у трех различных систем рестрикции-модификации типа II: Ahdl, Esp 13961 и EcoRV. Для достижения данной цели ставились следующие задачи:
Локализовать промоторные элементы генов СРМ Ahdl, Esp\396l и EcoRV;
Определить характер связывания С-белков с операторной последовательностью «С-бокс» во всех трех системах;
Изучить влияние С-белков на экспрессию генов СРМ Ahdl, EcoRV и Espl396I in vivo и in vitro.
Данная работа выполнена на базе лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН и на базе лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института Ваксмана США.
Научная новизна. Впервые получены данные о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов систем рестрикции - модификации на уровне инициации транскрипции с помощью С-белка (controller) у трех различных систем Ahdl, Espl396l и EcoRV. Показано, что С-белки из различных систем связываются с инвертированными повторами, называемыми «С-боксами» и расположенными перед генами ahdIC, espl396IC и ecoRVC, а также перед геном espl396IM.
Продемонстрировано, что белки C.Espl396I, C.EcoRV позитивно регулируют транскрипцию генов espl396ICR и ecoRVCR. Выявлено, что белок С.Ahdl выполняет двоякую роль в регуляции экспрессии собственного гена и гена ЭР: взаимодействие C.Ahdl с дистальным сайтом (Оц) «С-бокса» активирует транскрипцию с промотора VahdICR, а взаимодействие с проксимальным сайтом (Or) - репрессирует транскрипцию с этого промотора Обнаружено, что транскрипция с промотора VahdlMS не является C.AhdI-зависимой, а регулируется путем ковалентной модификации сайта узнавания, расположенного в промоторной области гена ahdIM. С..Еур13961 является негативным
регулятором транскрипции с промотора гена МТ; показано, что регуляторный белок ингибирует транскрипцию с промотора гена espl396IM в концентрациях более низких, чем те, которые необходимы для активации транскрипции с промотора генов espl396ICR. Установлено, что C.EcoRV не изменяет общую транскрипционную активность промоторов гена ecoRVM в результате того, что C.EcoRV подавляет транскрипцию с промотора PecoRVMoovm, и активирует транскрипцию с FecoRVMyp.
Практическая ценность работы. Исследование механизмов регуляции экспрессии генов является фундаментальной задачей молекулярной биологии и поэтому представляет несомненный научный интерес. Кроме того, уяснение способов регуляции активности генов и важно в практическом плане, так как дает возможность контроля уровня активности различных генов, используемых в биотехнологии. Полученные в ходе работы генно-инженерные конструкции могут быть использованы для создания различных вариантов контролируемых генных переключателей, функционирующих в самых разных бактериях. В ходе данной работы сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гены регуляторных белков трех различных СРМ, и разработана схема очистки каждого из них, что делает возможным получение очищенных- препаратов регуляторных белков для применения, например, в экспериментах по кристаллизации и изучению олигомерных комплексов и ДНК-белковых взаимодействий. Результаты данной работы открывают широкие возможности для экспериментального изучения динамики экспрессии генов систем рестрикции - модификации в реальном времени.
