Содержание к диссертации
Введение
2. Морфология бактериальной рибосомы, элонгационный цикл, функционально-важные участки рибосомы. 10
3. Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомиых субчастиц Е. coli. 15
3.1. Формирование малой рибосомиой субчастицьт Е. coli. 15
3.2, Участие рибосомных белков в формировании функциональных сайтов
30S рибосомиой субчастицы. 21
3.2.1. Специфическое связывание тРНК в А-сайте 30S субчастицы. 22
3.2.2. Связывание тРНК в Р-сайте. Роль белков S9 и S13. 24
3.2.3. Роль белка S1 в связывании мРНК, 26
3.3. Сборка большой рибосомиой субчастицы Е. coli. 28
3.4, Участие рибосомных белков в формировании функционально-важных
участков 50S субчастицы. 32
3.4.1. Пептидилтрансферазиый центр. 32
3.4.2. ГТФазный центр, роль белков L7/L12 и L11 в трансляции, 34
3.4.3. Ll-BbicTyn50S субчастицы. 35
4. Дополнительные функции рибосомных белков. 36
4.1. Рибосомные белки, регулирующие экспрессию генов. 36
4.2. Внерибосомиые функции рибосомных белков Е. coli. 38
5. Заключение, 39
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
1. Материалы и приборы. 41
1.1 Химические реактивы. 41
1.2 Питательные среды. 41
1.3 Приборы. 42
1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды . 43
2. Методы. 44
2.1. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии. 44
2.1.1. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация плазмидной ДНК. 44
2.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli. 45
2.1.3. Полимеразная цепная реакция. 46
2.1.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции. 47
2.1.5. Клонирование гена белка СТС Bacillus subtiltis и гена N-концевого фрагмента белка TL5 Thermus thermophilus для экспрессии в клетках & coli. 47
2.1.6. Направленный мутагенез N-концевого фрагмента белка TL5 Т. thermophilus. 48
2.1.7. Экспрессия рекомбинантных генов в клетках Е coli. 50
2.1.8. Нокаут хромосомных генов Е. coli с использованием метода «recombineering». 50
2.1.9. Клонирование генов in vivo с использованием «recombineering», 54
2.1.10. Анализ необходимости гена для выживания клеток Е. coli. 57
2.1.11. Общая траисдукция бактериофагом PL 58
2.1.12. Определение времени удвоения клеток Е. coli. 59
2.1.13. р-галактозидазный тест. 60
2.2. Биохимические методы. 61
2.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле. 61
2.2.2. Электрофорез РНК в ПААГ в присутствии мочевины и ЭДТА. 62
2.2.3. Электрофорез РНК и РНК-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях. 62
2.2.4. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН. 63
2.2.5. Двумерный электрофорез белков в ПААГ. 64
2.2.6. Выделение белка СТС Bacillus subtilis из клеток суперпродуцентного штамма Е. coli. 65
2.2.7. Выделение N-концевого фрагмента белка TL5 Т. thermophilus и его измененных форм из клеток суперпродуцентного штамма Е. coli. 66
2.2.8. Выделение рибосом из Е. со/г". 67
2.2.9. Анализ рибосом Е. coli центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. 67
2.2.10. Получение безрибосомного экстракта S100 и тотальной ферментной фракции из клеток Е. coll. 68
2.2.11. Трансляция ікши(ІІ) и природных мРНК в бесклеточной системе из Е. coli. 68
2.2.12. Ограниченный гидролиз 5S рРНК РНКазой А. 69
2.2.13. Выделение SSpPHK Е. coli и мечеыие по 5'-концу. 70
2.2.14. Определение константы диссоциации комплекса TL5-5S рРНК методом сорбции на натроцеллюлозных фильтрах. 70
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 72
1. Нокаут генов рибосомных белков «платформы» 30S рибосомной субчастицы Escherichia coli. 72
2. Нокаут генов 5S рРНК-связывающих рибосомных белков Е. coli. 81
3. Изучение механизма взаимодействия белков семейства СТС с 5S рРНК. 93
3.1. РНК-связывающие свойства основного стрессового белка СТС Bacillus subtilis. 93
3.2. Поиск аминокислотных остатков, ответственных за узнавание 5S рРНК белками семейства СТС. 97
ВЫВОДЫ 107
БЛАГОДАРНОСТИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
- Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомиых субчастиц Е. coli.
- Бактериальные штаммы и плазмиды
- Нокаут генов рибосомных белков «платформы» 30S рибосомной субчастицы Escherichia coli.
Введение к работе
С тех пор, как в конце 50-х годов XX века было установлено, что рибосомы ответственны за включение аминокислот в белковую цепь, и по сей день исследования структуры и функции рибосом остаются приоритетным направлением молекулярной биологии. Являясь неотъемлемым компонентом всех живых клеток, рибосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс, который состоит из двух компонентов - белков и рибонуклеиновых кислот (РНК). В настоящее время общепринято, что едва ли не все функции рибосомы, связанные с синтезом белка, осуществляются рибосомной РНК (рРНК), В то же время, известно, что лишенная белков рРНК, сама по себе, не способна осуществлять ни одну из функций рибосомы. Таким образом, роль рибосомных белков в функционировании рибосомы представляется не менее значимой, чем роль рРНК,
Основной подход к изучению роли рибосомных белков в трансляции -получение рибосом, лишенных отдельных белков, и определение активности этих рибосом. Такие рибосомы могут быть получены двумя способами:
Реконструкция рибосомных субчастиц in vitro из изолированных РНК и белков, исключая изучаемый белок.
Получение бактериальных штаммов, не имеющих гена определенного рибосомного белка, либо имеющих существенные мутации в генах изучаемых рибосомных белков, и выделение рибосом из таких штаммов.
Первый подход позволил получить обширную информацию о ступенчатой сборке рибосомы и изучить влияние связывания с рРНК одних белков на связывание других белков. Однако, информация, полученная в экспериментах щ vitro, не может полностью осветить то, что происходит в клетке.
Второй подход не только позволяет получать дефицитные по определенным белкам рибосомы, собранные в клетке, но таюке позволяет проверить, как отсутствие того или иного рибосомного белка отражается на жизнедеятельности клеток. В 80-х годах прошлого века было получено полтора десятка штаммов Escherichia coli, лишенных некоторых рибосомных белков (см, обзор [1]). Однако в те годы методы направленного мутагенеза не были развиты, изучались спонтанные или индуцированные различными реагентами мутации. Информация о роли рибосомных белков в выживании клеток и в сборке рибосомных субчастиц, полученная из этих исследований, была довольно ограниченной. В настоящее время прогресс в молекулярной генетике позволяет осуществлять направленный нокаут хромосомных генов, что существенно облегчает получение дефицитных по рибосомным белкам бактериальных штаммов. Используя современные подходы, можно изучить роль всех рибосомных белков в выживании клеток. А для тех белков, отсутствие которых не является летальным для клетки, можно получить подробную информацию об их влиянии на сборку рибосомных субчастиц и функционирование рибосом.
Первая часть диссертационной работы посвящена изучению необходимости рибосомных белков «платформы» малой рибосомиой субчастицы, а таюке белков 5S рРНК-белкового комплекса для выживания клеток и формирования in vivo рибосомы Е. coli. Для этого мы осуществили нокаут генов рибосомных белков S11, S21, L5, L18 и L25. Нокаут первых четырех генов оказался летальным для клеток Е. coli. Были изучены ростовые характеристики штамма Е. coli, лишенного белка L25, и охарактеризованы функциональные свойства AL25 рибосом. Кроме того, нами исследовались лишенные белков S15 и S6 рибосомы из жизнеспособных штаммов Е. coli., дефицитных по этим белкам.
Во второй части данной работы изучались особенности взаимодействия рибосомного белка TL5 Thermus thermophilm (TthTL5), который гомологичен рибосомному белку L25 Е. coli (EcoL25), с рибосомиой 5S рРРГК. Рибосомные белки TthTL5 и EcoL25 относятся к семейству СТС, которое получило свое название от основного стрессового белка СТС Bacillus subtilis (BsuCTC). Анализ расшифрованных за последние годы геномов показал наличие генов, кодирующих белки этого семейства, в подавляющем большинстве бактерий. Белок BsuCTC продуцируется клетками В. subtilis в ответ на действие различных видов стресса и обнаруживается в рибосомиой фракции клеток. Мы показали, что этот белок способен специфически связываться с тем же участком 5S рРНК, с которым связываются EcoL25 и TthTL5, а также DraCTC (белок, найденный в 5 OS рибосомиой субчастице Deinococcus radiodurans). В данной диссертационной работе при помощи направленного мутагенеза были найдены пять аминокислотных остатков, которые играют ключевую роль в узнавании 5S рРНК рибосомным белком TthTL5. Эти остатки являются сірого консервативными в белках СТС. Анализ пространственных структур комплексов EcoL25-5S рРНК, TthTL5-5S рРНК и структуры 50S рибосомной субчастицы D. radiodurans показывает, что эти пять строго консервативных аминокислотных остатков вовлечены в связывание 5S рРНК соответствующими белками. Полученные результаты позволяют предположить, что мишенью всех белков семейства СТС (как рибосомных, так и шоковых) является 5S рРНК.
Роль рибосомных белков в функционировании и сборке рибосомиых субчастиц Е. coli
30S рибосомная субчастица имеет в своем составе 1 молекулу 16S РНК, состоящую приблизительно из 1500-1600 и.о. (1542 в Escherichia coli), и приблизительно 20 белков с молекулярной массой 10-30 кДа (21 в Е. coli, S1-S21 [19]). В конце 60-х годов XX века впервые было установлено, что 30S рибосомная субчастица утрачивает активность в синтезе полипептида при удалении из нее 40% рибосомных белков [20]. В то же время, было установлено, что при добавлении удаленных белков субчастицы восстанавливают свою активность. Впоследствии Номура с сотрудниками продемонстрировали, что активная 30S субчастица может быть реконструирована in vitro из изолированной 16S рРНК и соответствующих рибосомных белков [21; 22]. Таким образом, было установлено, что 30S рибосомная субчастица может быть реконструирована in vitro без участия каких-либо дополнительных факторов. Опыты по реконструкции 30S субчастицы из изолированных и очищенных компонентов [22; 23] позволили установить, что реконструкция малой рибосомной субчастицы in vitro происходит последовательно и кооперативно, то есть включение белков в образующийся рибонуклеопротеид представляет собой организованный процесс.
Впервые карта сборки in vitro малой рибосомной субчастицы Е. coli была предложена Номурой с соавторами, эта карта, ставшая классической, все же претерпела впоследствии незначительные модификации [22-26]. Данная карта отражает тот факт, что непосредственно с 16S рРНК связываются всего несколько рибосомных белков (первично-связывающиеся или сердцевинные белки: S4, S7, S8, S15, S17 и S20). Так называемые, вторично-связывающиеся белки: S5, S6, S9, S11, S12, S13, S16, S18 и S19, связываются с 16S рРНК только при условии, что некоторые из сердцевинных белков уже образовали комплекс с 16S рР
Бактериальные штаммы и плазмиды
Хроматографию белков проводили на колонках PD-l.0 (Pharmacia, Швеция), используя хроматографическую систему Econo System (BIO-RAD, США),
Оптическую плотность и спектры поглощения растворов белков, РНК и нуклеозидтрифосфатов регистрировали на спектрофотометре "Hitachi 150-20" (Япония) в кюветах толщиной 1,0; 0,5; 0.2; 0.1 см. Люминесценцию люциферазы детектировали с помощью люмииометра (Pribori Оу, Финляндия). Для измерения интенсивности флуоресценции зеленого флуоресцирующего белка использовали спектрофлуориметр RF-5301PC (Shimadzu, Япония). Для авторадиографии использовали экран Multipurpose (MP) и фосфоимиджер Cyclone (Packard Instruments, США).
Амплификацию фрагментов ДНК методом ПЦР осуществляли с использованием амплификатора Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Сингапур).
Для электрофореза белков, РНК и РНК-белковых комплексов использовали комплект оборудования для электрофореза Mini Protean II (Bio-Rad, США). Для двумерного электрофореза рибосомных белков использовали аппараты Gel Electrophoresis Cell Model 150 (Bio-Rad, CIllA) и Gel Electrophoresis Apparatus GE-4 (Pharmacia, Швеция). Источники постоянного тока служили Biometra Р-25 (Biotron, Германия) и POWER РАС 3000 (Bio-Rad, США).
Для центрифугирования использовались низкоскоростные центрифуги К-23, К-24 (Janetzky, ГДР), J2-21 (Beckman, США); eppendorf 5415С (Eppendorf Geratebau, Германия), а таже высокоскоростные центрифуги L5-75 и TL-100 (Beckman, США).
Клетки разрушались ультразвуком с использованием ультразвукового дезинтегратора Sonic Dismembrator 550 (Fisher Scientific, США).
Нокаут генов рибосомных белков «платформы» 30S рибосомной субчастицы Escherichia coli
Другой пример - это белок S13, который участвует в образовании «мостика» В1 [17]. Согласно недавно опубликованным данным, удаление белка S13 из рибосомы таюке приводило к дестабилизации 70S рибосом [68]. Таким образом, удаление любого из двух белков 30S субчастицы, принимающих участие в формировании «мостиков» с 50S субчастицей, может существенно ослабить ассоциацию рибосомных субчастиц.
На основании данных по химической модификации 16S рРНК можно заключить, что удаление белка S15 не приводит к существенным структурным перестройкам в 30S субчастице, так как изменяется доступность для модификации лишь нескольких «локальных» нуклеотидов [42]. Таким образом, весьма вероятно, что именно контакты самого белка S15 с 5OS рибосомной субчастицей существенно стабилизируют 70S рибосому.
