Содержание к диссертации
Введение
2 Трансмембранный транспорт белков у бактерий 13
2.1 Истинная секреция у грамотрицательных бактерий 14
2.2 Sec-система трансмембранной транслокации белков у бактерий 19
2.2.1 Адресация синтезируемых полипептидов в транслоказу 20
2.2.1.1 Структура сигнальной последовательности субстратов Sec-транслоказы 21
2.2.1.2 Адресация при участии SRP 22
2.2.1.3 Адресация при участии шаперона SecB 26
2.2.1.4 Взаимоотношение SRP- и SecB/SecA-зависимых способов адресации 29
2.2.2 Структура и функции Sec-транслоказы 30
2.2.2.1 Стехиометрия компонентов транслоказы 31
2.2.2.2 SecA—молекулярный мотор транслоказы 31
2.2.2.3 Трансмембранный комплекс SecYEG — кор транслоказы 33
2.2.2.4 Роль Sec-транслоказы в биогенезе мембранных белков 39
2.2.2.5 Сигнальные пептидазы первого типа (SPasel) 40
2.2.2.6 Общая схема функционирования Sec-системы транслокации 41
2.2.3 Образование транслоцированными полипептидами нативной конформациив периплазме 43
2.3 ТАТ-система трансмембранной транслокации белков у бактерий 46
2.3.1 Сигнальные пептиды субстратов ТАТ-системы 47
2.3.2 Структурные компоненты ТАТ-системы 49
2.3.3 Особенности функционирования ТАТ-системы транслокации 50
2.4 Использование трансмембранного транспорта при получении рекомбинантных белков 50
3 Энтеротоксины Staphylococcus aureus 54
3.1 Структура стафилококковых энтеротоксинов 55
3.1.1 Пространственная структура 56
3.1.2 Взаимодействие SE с молекулами МНС II 58
3.1.3 Связывание с TCR 60
3.2 Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе 61
3.2.1 Стафилококковые пищевые отравления (SFP) 61
3.2.2 Синдром токсического шока (TSS) 62
3.3 Медицинское значение энтеротоксинов S.aureus 63
3.3.1 Усиление специфичного иммунного ответа 64
3.3.2 Терапия опухолей .' 65
3.3.3 Создание вакцин против стафилококковых энтеротоксинов 67
3.3.4 Перспективы медицинского применения стафилококковых энтеротоксинов 68
4 Материалы и методы 70
4.1 Материалы 70
4.1.1 Реактивы 70
4.1.2 Ферменты 70
4.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды 70
4.1.4 Микробиологические среды 72
4.1.5 Олигонуклеотиды 72
4.2 Методы 72
4.2.1 Полимеразная цепная реакция 72
4.2.2 Выделение хромосомной ДНК S.aureus 73
4.2.3 Операции с ДНК 73
4.2.4 Электрофоретическое разделение белков 74
4.2.5 Иммуноблот 74
4.2.6 Фракционирование клеток E.coli 75
4.2.7 Очистка рекомбинантного SEB с помощью ионообменной хроматографии 76
4.2.8 Очистка рекомбинантных SEA и SEB с помощью аффинной хроматографии 76
5 Результаты и обсуждение 78
5.1 Клонирование генов, кодирующих SEA и SEB. Изучение их экспрессии в E.coli 78
5.1.1 Получение плазмид для экспрессии SEA и SEB в E.coli 78
5.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli 84
5.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации энтеротоксина А первичной структуры его сигнального пептида 87
5.2.1 Конструирование форм энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом и исследование накопления рекомбинантных белков в клетках E.coli 87
5.2.2 Вероятный механизм влияния исследованных вариантов аминокислотных замен в сигнальном пептиде SEA на его функцию 94
5.3 Очистка рекомбинантных SEB и SEA 97
5.3.1 Очистка SEB путем ионообменной хроматографии 97
5.3.2 Биологическое тестирование очищенного препарата SEB 99
5.3.3.Очистка SEA и SEB путем аффинной хроматографии 101
5.3.3.1 Получение форм SEA и SEB, несущих С-концевой гексагистидиновый мотив 101
5.3.3.2 Проведение аффинной хроматографии 102
5.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков в периплазматическое пространство E.coli на модели энтеротоксинов из S.aureus 104
5.4.1 Клонирование гена, кодирующего ТогА и исследование его внутриклеточной локализации при гиперэкспрессии в E.coli 107
5.4.2 Конструирование плазмид для исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков 109
5.4.3 Исследование накопления гибридных белков в клетках E.coli 114
5.4.4 Возможные механизмы взаимного влияния сигнального пептида и
зрелой части белка на эффективность процесса транслокации 117
6 Выводы 121
7 Список литературных источников
- Структура сигнальной последовательности субстратов Sec-транслоказы
- Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе
- Бактериальные штаммы и плазмиды
- Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli
Введение к работе
Бактериальная клетка отделена от внешней среды плазматической мембраной, основу которой составляет гидрофобный двойной слой липидов. Основополагающая функция мембраны — барьерная. Она отделяет содержимое клетки от окружающей среды, делая возможным поддержание гомеостаза и защищая от внешних воздействий. При этом, мембрана работает как высоко селективный фильтр, избирательно пропуская одни соединения, задерживая другие и активно перемещая третьи. Задачи транспорта решаются целым рядом селективных белковых каналов и активных транспортеров, ассоциированных с мембраной.
Для нормального функционирования клетки необходимо перенести через
плазматическую мембрану или встроить в нее большое количество различных
белков. Задачу по перемещению через гидрофобный слой высокомолекулярных
полипептидных субстратов решают специальные системы, состоящие из
большого количества компонентов и утилизирующие производимую клеткой
энергию в виде нуклеозидтрифосфатов и/или трансмембранного
электрохимического потенциала [2]. Основная система трансмембранного транспорта белков — Sec-транслоказа. С её помощью происходит выведение из цитоплазмы наружу несвернутых полипептидов или их встраивание в мембрану. Открытая позднее ТАТ-система позволяет преодолевать мембранный барьер белкам, имеющим нативную третичную или даже четвертичную структуру [3].
Актуальность темы исследования.
Активные исследования трансмембранного транспорта белков ведутся в течение последних четырех десятилетий, что позволило вскрыть молекулярные аспекты этого процесса. В тоже время, в данной области в настоящее время остается значительное количество нерешенных проблем. Доказано, что для транспорта полипептида через мембрану он должен иметь аминоконцевой участок с характерной структурой — т.н. сигнальный пептид [2]. Однако, как
следует из большого количества экспериментов, его наличие в составе рекомбинантных белков далеко не всегда приводит к их транслокации. В настоящее время до конца не ясно, какое влияние на трансмембранный транспорт полипептидов оказывает структура их зрелой части, в частности, присутствуют ли в полипептидах какие-либо необходимые для переноса элементы, помимо сигнального пептида. Не разработана также проблема взаимного влияния структуры сигнального пептида и остальной части белка. Одной из нерешенных окончательно проблем остается эффективная секреция рекомбинантных белков в периплазматическое пространство или культуральную среду.
Одним из характерных субстратов Sec-системы транслокации являются энтеротоксины грамположительной патогенной бактерии Staphylococcus aureus. В процессе размножения в организме млекопитающих, данный микроорганизм секретирует большое количество энтеротоксинов нескольких типов [4]. По механизму действия они относятся к группе так называемых суперантигенов — белков, вызывающих неспецифическую активацию больших субпопуляций Т-лимфоцитов. Их главная задача — подавление иммунного ответа организма-хозяина [4]. Действием стафилококковых энтеротоксинов обусловлен ряд заболеваний, в том числе пищевые отравления и синдром токсического шока [4]. Особенности воздействия стафилококковых энтеротоксинов на иммунную систему человека делают их потенциальным объектом для создания медицинских препаратов различного назначения — иммуностимуляторов, усилителей иммунного ответа при вакцинации, компонентов противоопухолевых лекарств (см. п. 3.3).
В настоящее время стафилококковые энтеротоксины, в том числе и рекомбинантные, получают, в основном, из культур S.aareus. Данный микроорганизм одновременно продуцирует большое количество различных токсинов, поэтому получение препарата со степенью очистки, допускающей медицинское применение, связано со значительными трудностями. Получение рекомбинантных энтеротоксинов в экспрессионной системе Escherichia coli
позволяет упростить наработку и выделение данных белков. Поскольку генно-инженерные методы для Е.соН отработаны лучше, чем для любого другого организма, при этом открываются широкие возможности по модификации исходных белков посредством сайт-направленого мутагенеза и созданию комплексных многофункциональных препаратов в виде энтеротоксинов, слитых с другими белками.
Нами было показано, что аутентичные сигнальные пептиды ряда стафилококковых энтеротоксинов обеспечивают транспорт этих белков в периплазму при гетерологичной экспрессии в клетках Е.соН. Несмотря на сходство пространственной структуры, разные типы стафилококковых энтеротоксинов имеют идентичность аминокислотной последовательности лишь около 30% [5] и различные по структуре сигнальные пептиды. Данное обстоятельство позволило нам использовать полученные рекомбинантные токсины в качестве модели, комбинируя различные лидерные последовательности и зрелые части белков, заведомо способных к переносу в перплазматическое пространство Е.соН. Подобный подход мы использовали для ответа на вопросы о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной транслокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми.
Цели и задачи работы.
Целью работы являлось:
конструирование штаммов-продуцентов Е.соН для получения стафилококковых энтеротоксинов А и В;
выделение рекомбинантных энтеротоксинов А и В в гомогенной форме;
изучение влияния сигнальных пептидов на внутриклеточную локализацию белков на модели энтеротоксинов S.aureus при их гетерологичной экспрессии в Е.соН.
В ходе работы ставились следующие задачи:
клонировать участки ДНК, кодирующие стафилококковые энтеротоксины А и В и получить экспрессионные плазмиды для E.coli;
отработать гетерологичную экспрессию стафилококковых энтеротоксинов А и В в E.coli, изучить их внутриклеточную локализацию;
отработать методы очистки энтеротоксинов А и В;
провести перекрестный обмен сигнальными пептидами между энтеротоксинами А, В, Н из S.aureus, стрептавидином из Streptomyces avidinii, а также получить формы этих белков с заменой аутентичного сигнала транслокации на сигнальный пептид белка E.coli ТогА, который является субстратом альтернативной Sec-транслоказе транспортной системы — TAT (twin arginine translocation);
исследовать внутриклеточную локализацию полученных гибридных белков;
изучить влияние ряда аминокислотных замен на функциональную роль сигнального пептида энтеротоксина А.
Научная новизна.
В результате проведенных исследований впервые получены штаммы E.coli, продуцирующие стафилококковые энтеротоксины А и В в растворимой форме. Показано, что аутентичные сигнальные пептиды данных белков обеспечивают их локализацию в периплазме при гетерологичной экспрессии в E.coli. Отработана высокотехнологичная хроматографическая методика выделения SEA и SEB и получены очищенные препараты данных белков. Сконструирован ряд гибридных полипептидов и исследована их локализация в клетках E.coli, в результате чего показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации данных белков.
Практическая значимость.
Практическая значимость данной работы заключается в двух аспектах. Во-первых, полученные штаммы-продуценты SEA и SEB могут быть использованы для наработки препаратов данных белков в значительных количествах без использования в работе патогенных культур S.aureus. При этом открываются широкие возможности по модификации данных токсинов, генетическому и химическому конъюгированию их с другими белками. Это, в свою очередь, позволяет проводить исследования воздействия энтеротоксинов на иммунную систему млекопитающих и их противоопухолевой активности. В перспективе, модифицированные токсины могут найти практическое применение в медицинской практике — данному направлению в настоящее время уделяется большое внимание при конструировании противоопухолевых препаратов нового типа.
Во-вторых, проведенные исследования влияния сигнальных пептидов на трансмембранный транспорт модельных белков позволяют определить несколько направлений анализа структурно-функциональных взаимоотношений в системе сигнальный пептид — секретируемый полипептид. Результаты, полученные в данной работе закладывают хорошую базу для дальнейших исследований в данной области, которые могут помочь в поиске путей оптимизации переноса рекомбинантных белков в периплазму E.coli, что является актуальной задачей современной биотехнологии. Периплазматическая локализация существенно облегчает выделение и очистку рекомбинантных белков, а также позволяет существенно уменьшить проблемы, связанные с токсичностью продукта для продуцирующих его клеток и, в значительной степени, с образованием телец включения.
Структура сигнальной последовательности субстратов Sec-транслоказы
SRP представляет собой рибонуклеопротеин, высоко консервативный у прокариот, эукариот и архей [38]. SRP связывается с сигнальной последовательностью растущей полипептидной цепи и образует тройной комплекс рибосома-растущий полипептид-SRP (RNC-SRP). Данный комплекс связывается с мембранассоциированным рецептором для SRP при участии ГТФ, что приводит к транслокации полипептида Sec-системой [38].
SRP E.coli имеет наиболее простое строение из всех известных. Она включает 4,5S РНК и один полипептид — р48 или Ffh (fifty four homologue — гомолог белка SRP54 млекопитающих) [20, 21, 38]. SRP млекопитающих обладает заметно более сложной структурой и состоит из 7S-PHK и шести полипептидных субъедениц: SRP54, SRP19, SRP68, SRP72, SRP 14, SRP 9 [38]. SRP Bacillus subtilis образована scPHK (малой цитоплазматической РНК), Ffh и двумя молекулами гистоноподобного белка Hbsu [39]. Белок SRP54/Ffh — единственный, обнаруженный во всех исследованных SRP, он играет ключевую роль в связывании сигнального пептида и SRP-рецептора [38].
Длина и вторичная структура SRP-PHK консервативны у эукариот и архей, в то время как у эубактерий значительно различаются. Средняя длина SRP-PHK грамположительных бактерий около 270 нуклеотидов, а грамотрицательных — 120. Так, длинна 7S-PHK человека составляет 300 нуклеотидов, сходный размер и у scPHK В.subtilis — 271 нуклеотид. В то же время, 4,5S РНК E.coli намного короче — 114 остатков [39] ( рис. 3). in SRP-PHK имеет модульную конструкцию, упрощение её структуры в ряду организмов связано не с упрощением модулей, а с уменьшением их числа, и, следовательно, редукцией части функций SRP. 7S-PHK млекопитающих образует 4 отдельных структурных домена (I-IV). Пространственная структура SRP-PHK грамположительных бактерий чрезвычайно близка к таковой у млекопитающих, но при этом отсутствует домен III [39]. 4,5S РНК E.coli соответствует одному домену IV, и, по всей видимости, является минимальной функциональной структурой (рис. 3). При этом, уменьшение размеров SRP-PHK мало отражается на структуре отдельных доменов. Так, четвертый домен эубактерий содержит последовательность длинной 22 нуклеотида, идентичную у всех исследованных представителей данной группы, и имеет 68% идентичности с таковой у человека [41].
Домен IV SRP-PHK имеет размер 50 нуклеотидов и образует высококонсервативную жесткую структуру, представляющую собой три коротких спирали, соединенных внутренними петлями [32, 38]. Он имеет сродство к рибосоме, необходимое для функции распознавания сигнала. Нуклеотидная последовательность 23S рРНК E.coli в районе 1068-1077 остатков, формирующая сайт связывания белка EF-G, идентична нуклеотидам 58-67 4,5S РНК [42]. Из этих десяти нуклеотидов восемь расположены в двадцатидвухчленной высококонсервативной области 4,5S РНК.
Показана возможность функциональной комплиментации SRP-PHK из разных организмов. Экспрессия 7S РНК человека в Е.соН супрессирует летальное отсутствие 4,5S РНК. В клетках Е.соН обе РНК ассоциированы с Ffh, in vitro как Ffli, так и SRP54 связывают 4,5S РНК. Таким образом, 4,5 S РНК может быть функционально заменена 7S SRP-PHK человека [43]. При экспрессии в B.subtilis, дефектных по scPHK, 4,5S РНК Е.соН, укороченного варианта scPHK, соответствующего домену IV и 7S РНК человека, во всех трех случаях достигалась компенсация функций scPHK [44]. Таким образом, экспериментально показана не только высокая консервативность первичной структуры SRP-PHK, но и сходство пространственного строения у наиболее филогенетически отдаленных групп организмов [43, 44].
Второй обязательный компонент всех SRP — белок SRP54/Ffh. Он образует три домена. N-концевой домен отвечает за связывание с мембраной. G-домен содержит сайт связывания ГТФ и обладает ГТФазной активностью. G-домен родственен p21Ras семейству ГТФаз [45]. С-концевой метионин-богатый М-домен, пакет из четырех а-спиралей, связывается с сигнальным пептидом транслоцируемого белка. М-домен также ответственен за взаимодействие с SRP-PHK (рис. 4) [46, 47, 48].
М-домен имеет глубокий желоб, поверхность которого образована гидрофобными радикалами консервативных аминокислотных остатков, который является сайтом связывания сигнального пептида (рис. 4) [40, 49]. В тоже время, М-домен ответственен за распознавание домена IV SRP-PHK, сайт связывания которой расположен рядом с гидрофобным желобом. РНК, возможно, участвует в распознавании сигнала совместно с полипептидом [40].
После связывания SRP с сигнальным пептидом растущей полипептидной цепи, комплекс RNC-SRP взаимодействует с мембраносвязанным рецептором. Прокариотический SRP-рецептор FtsY является односубъединичным белком. Эукариотический рецептор состоит из двух субъедениц — SRa и SRp\ FtsY гомологичен SRa [20, 38], но, в отличие от SRa, не имеет трансмембранных участков [32].
Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе
Основной причиной развития токсического шока, опосредованного стафилококковой инфекцией, является активация суперантигенами Т-клеток. Например, было показано, что циклоспорин А, блокирующий активацию Т-клеток и продукцию лимфокинов, полностью защищает от летального шока мышей, которым был введен SEB [123].
В то время, как присутствие обычного антигена приводит к стимуляции 0,01-0,0001% от общего числа Т-клеток, суперантигены активируют 5-30% [122]. Наиболее серьезным последствием этого является высвобождение больших количеств лимфокинов и монокинов Т-клетками и макрофагами (рис. 17).
Ряд данных позволяет заключить, что основную роль в развитии SE-опосредованного TSS играют, по-видимому, фактор некроза опухолей (TNF) и у-интерферон (IFNy) [124]. Нейтрализация TNF с помощью специфичных к нему антител предотвращает летальный эффект SEB для мышей, сенсибилизированных D-галактозамином. Мыши с отсутствующим рецептором к TNF полностью устойчивы к данному воздействию. Сходным образом, летальный эффект SEB для мышей, снимается с помощью антител, специфичных к IFNy [124]. SE, кроме всего прочего, обладают свойством усиливать действие бактериальных эндотоксинов — компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Возможная причина SE-индуцированной гиперчувствительности к эндотоксинам — замедление их выведения из циркуляции печенью [4].
Роль стафилококковых энтеротоксинов в возникновении различных заболеваний описана выше. С другой стороны, показана способность суперантигенов усиливать специфичный иммунный ответ при одновременной вакцинации антигеном и суперантигеном [111, 125]. В литературе описан ряд работ, направленных как на поиск способов инактивации токсинов во время стафилококковой инфекции млекопитающих, так и на использование их в качестве иммуностимуляторов там, где надо получить быстрый и мощный иммунный ответ, например, при терапии опухолей.
С целью инактивации SE в организме исследуются возможности иммунизации либо исходными токсинами, либо инактивированными (химически, генетически) формами [112, 113, 126], а также рассматривается применение пептидов- антагонистов [127, 128]. Большой интерес вызывает применение SE для терапии опухолей [129] посредством стимуляции иммунного ответа [113]. Ведутся работы по увеличению эффективности противоопухолевой вакцинации при проведении совместной иммунизации опухоль-специфическим антигеном и SE [130]. Показано также, что воздействие эндотоксинов способно замедлить образование и рост некоторых опухолей [131,132].
Другой подход подразумевает создание двухкомпонентных молекул, в которых эффекторная часть (SE) химическим либо генно-инженерным способом связана с опухоль-адресующей (например, специфическим моноклональным антителом) [133, 134, 135].
Перспективными представляются также исследования влияния SE на иммунный ответ при бактериальных инфекциях. Например, имеются данные о возможности терапии с помощью SEB a летальной инфекции Listeria monocytogenes у мышей [136, 137].
Целью данного обзора литературы не является систематическое освещение работ медицинской тематики по стафилококковым энтеротоксинам, поэтому ниже приведены лишь некоторые примеры подобных исследований с целью прояснить их общую направленность.
В работе [125] описывается исследование опосредованного суперантигенами усиления антиген-специфичной активности CD4+ Т-клеток при гуморальном В-клеточном ответе. В качестве антигенов (Ag) использовали Т-зависимые антигены BSA и HIVgpl20, Т-независимые Ag первого типа — LPS (липополисахариды), Т-независимые Ag второго типа — пневмококковые полисахариды. Инъекции BSA мышам сопровождались уколом комбинацией
SEA и SEB семь дней спустя. При этом титр анти-BSA антител (АЬ) возрастал примерно в четыре раза относительно мышей, получивших только BSA. Ответ на gpl20 усиливался примерно втрое. Ответ на Т-независимый Ag второго типа усиливался в 2,3 раза, в то время, как никакого эффекта воздействия суперантигенов не наблюдалось в случае LPS. Эффект суперантигенов полностью блокировался ингибитором CD4+ Т-клеток интерлейкином 10. Исходя из этого, авторы делают заключение о том, что суперантигены, такие как SEA и SEB, способны значительно повышать антиген-специфичный имунный ответ ТХ1 и ТХ2 СХ 4+ Т-клеток [125].
Бактериальные штаммы и плазмиды
Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили согласно [150] с использованием электрофоретической ячейки фирмы «Sigma» (США). Концентрация разделяющего геля составляла 12,5%, напряженность электрического поля — 20 В/см. В качестве лидирующего красителя в образцы добавляли бромфеноловый синий.
Белки электрофоретически разделяли в ПААГ (п.5.2.4). Перенос образцов на нитроцеллюлозную мембрану выполняли с помощью прибора SD semi-dry Transblotter (Bio-Rad, США) при плотности тока 1мА/см2 в течение 90мин. В качестве буфера для переноса использовали 48мМ Трис-ОН; 39мМ глицин; 0,037% SDS; 20% этанол. После переноса нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в 20 мл блокирующего буфера (lxPBS [146] рН 7,2; 1% BSA) в течение 45 минут при 37С при покачивании. После этого мембрану промывали дистиллированной водой и перемещали в 10мл PBS, куда добавляли антитела в разведении, соответствующим рекомендациям поставщика антител. Мембрану инкубировали 45 минут при 37С и покачивании, после чего промывали водой, а затем — PBS и снова водой. Далее, мембрану в течение 60-90 минут инкубировали в 10 мл PBS с добавлением моноклональных антител к Fc-фрагментам антител мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена («ИМТЕК», Россия) в разведении 1/5000, вслед за чем промывали водой и окрашивали раствором ТМВ («US Biological», США). Моноклональные антитела к SEB были любезно предоставлены к.м.н В.Л. Юриным (лаборатория иммунологии, ГосНИИгенетика).
Клетки культивировали в жидкой среде LB, как это описано выше. Измеряли оптическую плотность культуры клеток E.coli при длине волны 600 нм (СЮбоо)- Клетки осаждали центрифугированием (13x103 об/мин) и ресуспендировали в охлажденном лизирующем буфере (0,03М Трис-HCl рН 8,0; ImM ЭДТА; 1 мг/мл лизоцим; 25% сахароза) из расчета 100 мкл буфера на 3 единицы оптической плотности на 1 мл исходной культуры. Клетки лизировали на льду в течение 10 мин при перемешивании.
Лизат центрифугировали в течение 10 минут (13х103 об/мин). Супернатант, содержащий компоненты периплазмы, отделяли и, при необходимости, хранили в замороженном состоянии.
Для получения лизата протопластов, оставшихся после отделения периплазматической фракции, их ресуспендировали в 1% растворе SDS и инкубировали при 95С и интенсивном перемешивании до полного растворения осадка.
Для получения мембранной фракции, протопласты ресуспендировали в воде и подвергали трехкратному замораживанию и оттаиванию. Полученый лизат центрифугировали в течение 10 минут (13x103 об/мин). После удаления супернатанта мембранную фракцию ресуспендировали в 1% растворе SDS и инкубировали при 95С и интенсивном перемешивании до полного растворения осадка.
Периплазматическую фракцию клеток E.coli получали, как это описано выше. Полученную из ночной культуры клеток Е. coli К-12 MG1655, трансформированных плазмидой pLSEB, периплазматическую фракцию переводили в 50 мМ Tris (рН8,0) с помощью ультрафилтрации с использованием фильтра YM10. После этого полученный препарат наносили на хроматографическую колонку с сорбентом Fractogel TSK DEAE-650M («Merck») и промывали 50 мМ Tris (рН8,0). Оптическую плотность элюата контролировали с использованием Uvicord («Pharmacia», Швеция) при длине волны 280 нм. Фракцию белков, не связавшихся с сорбентом, с помощью ультрафильтрации через мембрану YM10 переводили в 10 мМ фосфатный буфер (рН6,2), после чего наносили на хроматографическую колонку с карбоксиметилсефарозой (CM-Sepharose CL-6B, «Pharmacia», Швеция). Колонку промывали фосфатным буфером с градиентом концентрации фосфата от 10 до 50мМ при постоянном значении рН (6,2). Элюцию энтеротоксина В проводили фосфатным буфером с градиентом концентрации фосфата от 50 до 150 мМ и, одновременно, рН от 6,2 до 6,8. Оптическую плотность элюата контролировали с использованием ячейки «Uvicord» («Pharmacia», Швеция) при длине волны 280 нм. Детально процесс выделения SEB описан в п. 5.3.1.
Полученную из ночной культуры клеток Е. coli К-12 MG1655, трансформированных плазмидой pLM-SEA(H) (в случае SEA), либо pLSEB(H) (в случае SEB), периплазматическую фракцию осаждали путем добавления сульфата амонония до 80% от насыщения. Белки осаждали центрифугированием и растворяли в буфере для нанесения (25мМ Na2HP04; 0,5М NaCl; ЮмМ имидазол; рН 8,0). Хромато графическое разделение происходило на колонке с №2+-агарозой фирмы «Qiagen» (США). После нанесения образца колонку промывали буфером для нанесения, а затем — отмывочным буфером (25мМ Na2HPC 4; 0,5М NaCl; 20мМ имидазол; рН 8,0). Элюцию проводили буфером с концентрацией имидазола ЗООмМ (25мМ Na2HP04; 0,5М NaCl; ЗООмМ имидазол; рН 8,0). Контроль процесса хроматографии осуществляли измерением оптической плотности элюата при длине волны 280 нм. Подробно процесс аффинной хроматографии описан в п. 5.3.3.
Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli
Из представленных результатов можно сделать вывод о том, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации. В то же время, результаты данной работы и литературные источники не дают оснований предполагать наличие неких дискретных элементов первичной структуры, отвечающих за транслокацию, в составе зрелого белка. По-видимому, для успешного переноса белка через плазматическую мембрану E.coli, необходима некая совместимость белка и сигнального пептида, хотя ее природа остается неясной. С одной стороны, лидерные пептиды SEB и SEH обеспечивают транслокацию аутентичных белков, а также части других полипептидов, будучи слиты с ними (табл. 8) при синтезе в клетках E.coli, т.е. имеют все необходимые элементы для выполнения своей функции в комплексе с Sec-транслоказой данного организма. С другой стороны, слияние рассматриваемых сигнальных пептидов с некоторыми другими полипептидами, не приводит к накоплению рекомбинантных белков в периплазме. Так, SEA не обнаруживается в форме с лидером SEH, a SAV - с лидером SEB. В тоже время, SEA и SAV накапливаются в периплазме E.coli, если синтезируются в формах с рядом других сигнальных пептидов, что говорит об отсутствии в составе зрелой части данных белков элементов, препятствующих транслокации (как на уровне первичной структуры, так и структур более высокого порядка). Из всего вышесказанного можно заключить, что система «сигнальный пептид — полипептид» не является аддитивной. Объединение в одной молекуле частей, функциональных в других комбинациях, не всегда ведет к транслокационной компетентности новой формы. Таким образом, существуют дополнительные факторы, влияющие на транспорт, которые обусловлены суперпозицией элементов получаемого гибридного полипептида.
Существуют данные, свидетельствующие о влиянии начального участка зрелой части белка на эффективность его трансмембранного транспорта. В частности, в работе [165] показано снижение уровня транслокации щелочной фосфатазы в клетках E.coli вследствие увеличения суммарного положительного заряда в данной области полипептида. Несмотря на то, что среди использованных в данной работе модельных белков проследить подобной закономерности не удается, на основании наших данных и результатов из [165] можно предположить, что в определенных комбинациях полипептидов и лидеров возможна супрессия неблагоприятных структурных факторов, а в других — нет. Другое возможное объяснение феномена совместимости может заключаться во взаимодействии сигнального пептида и зрелой части белка с образованием элементов вторичной структуры, препятствующих корректному взаимодействию с компонентами транслоказы.
Как уже отмечалось, во всех случаях в ходе выполнения данной работы, когда нам не удавалось обнаружить рекомбинантный гибридный белок в периплазме, он не обнаруживался и в других клеточных фракциях (за исключением полноразмерного SEA дикого типа). Так как у грамотрицательных бактерий не наблюдается ареста трансляции (п. 2.2.1.2), можно предположить, что вновь синтезируемый полипептид, при невозможности транслоцироваться, не может приобрести нативную третичную структуру и подвергается протеолизу. В тоже время, исследованные полипептиды (зрелые SEA, SEH, SEB и SAV) устойчивы в цитоплазме Е.соїі в случае, когда клетка синтезирует их зрелые формы без сигнального пептида. Возможно, данный эффект обусловлен связыванием растущего полипептида, имеющего в своем составе лидер, с компонентами транслоказы, в том числе с моторным белком SecA и шапероном SecB.
В ходе адресации полипептида в трансмембранный канал задействовано большое количество множественных межмолекулярных взаимодействий (п. 2.2.1). В процессе синтеза с полипептидом связывается шаперон SecB, не позволяющий ему принять нативную конформацию. На следующем этапе важное значение имеет SecA, который помимо АТФ-зависимого перемещения транслоцируемой полипептидной цепи через трансмембранный канал, играет центральную роль в образовании предтранслокационного комплекса (п. 2.2.2.2). На рисунке 7 показано, что SecA способен специфично взаимодействовать с большим количеством других молекул. После связывания с главным белком ядра транслоказы — SecY, образующим канал в мембране, SecA изменяет конформацию. Вследствие этого он приобретает сродство к комплексу SecB и полипептида, одновременно взаимодействуя с шапероном, сигнальным пептидом и остовом зрелой части белка. Таким образом, существует три критические области взаимодействия комплекса полипептид-SecB с SecA. Мы предположили, что важную роль для успешной транслокации полипептида через мембрану играет, помимо них, структура перехода от сигнального пептида к зрелой части белка. Следствием образования предтранслокационного комплекса является дальнейшее изменение конформации SecA. В результате, сгнальный пептид проникает между двумя лабильными трансмембранными сегментами SecY в липидный слой мембраны, a SecA за счет гидролиза АТФ снова изменяет конформацию и высвобождается в цитоплазму (п. 2.2.2.2). Нарушение пространственной конфигурации комплекса вследствие некорректной структуры стыка сигнального пептида и зрелой части белка может привести к невозможности проникновения сигнального пептида в мембрану или его диссоциации с SecA. В этом случае транслоцируемый полипептид остается в цитоплазме, связанный с компонентами транслоказы. Шаперон SecB не дает ему свернуться, и полипептид, скорее всего, будет расщеплен протеиназами.
Выдвинутое предположение, основанное на результатах, представленных в данной работе и литературных данных, носит во многом гипотетический характер. Однако, предложенный механизм позволяет не только объяснить ряд литературных данных, но и обозначить конкретные направления дальнейшего развития исследований в данной области. В их числе — изучение влияния на процесс транслокации структуры перехода от сигнального пептида к зрелой части и следующего за ним участка полипептидной цепи.
