Введение к работе
Актуальность проблемы. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (АХР) являются лиганд-управляемыми ионными каналами и подразделяются на две основные группы: рецепторы мышечного типа и нейрональные. Сведения о пространственной организации всего класса АХР до недавнего времени основывались главным образом на данных криоэлектронной микроскопии АХР мышечного типа, выделяемого в значительных количествах из электрического органа ската Torpedo califomica. Установлено, что субъединицы этого рецептора (две а- и по одной р~, у- и 6-субъединице) образуют пентамерный комплекс, вдоль оси которого располагается пронизывающий мембрану ионный канал. Согласно существующим представлениям, каждая субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный участок, а также цитоплазматический домен. К настоящему времени получена информация о форме трансмембранных фрагментов, выстилающих канал, а также об элементах вторичной и третичной структуры экстрацеллюлярного домена. Установление пространственной структуры более высокого разрешения с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) натолкнулось на трудности получения кристаллов цельного рецептора. В связи с этим представляется целесообразным провести детальный структурный анализ отдельных функциональных доменов АХР.
В экстрацеллюлярном домене АХР происходит связывание ацетилхолина, а также различных других агонистов и антагонистов. Следует отметить, что экстрацеллюлярные домены а-субъединиц (или их фрагменты) были достаточно давно получены с помощью гетерологичной экспрессии в Escherichia сой, как правило, в виде тел включения. Изучение пространственных и функциональных свойств этих белков требовало проведения их ренатурации. С помощью спектроскопии КД в ряде зарубежных лабораторий, а также в нашем институте была определена вторичная структура белков, отвечающих экстрацеллюлярному домену а-субъединиц мышечного АХР мыши и рецептора Т.califomica, изучено связывание этими доменами токсинов и моноклональных антител. При этом стала очевидной необходимость оптимизации условий сборки белка и предотвращения образования агрегатов при достижении достаточно высоких концентраций белка, при которых возможно изучение пространственной структуры методом РСА или ЯМР.
Каждая субъединица АХР содержит достаточно протяженную цитоплазматическую петлю (100-150 аминокислотных остатков) между третьим и четвертым трансмембранными фрагментами. Цитоплазматическая петля играет важную роль в
функционировании рецептора. Фосфорилирование внутриклеточного домена вызывает
увеличение скорости десенситизации рецептора.
Цеди и задачи работы. Основной целью исследований явилось экспрессия
внемембранных (экстрацеллюлярных и цитоплазматических) доменов субъединиц
никотинового ацетилхолинового рецептора в E.coli с последующей ренатурацией
очищенных продуктов и изучением физико-химических свойств доменов. В качестве
объектов исследования мы выбрали:
1. экстрацеллюлярный домен а-субъединицы АХР Т. califomica. Рецептор Torpedo является наиболее исследованным объектом. Однако к началу нашей работы практически отсутствовала информация о пространственной структуре экстрацеллюлярного лиганд-связывающего домена. Кроме того, на этом объекте можно проверить условия ренатурации с помощью теста "функциональной активности" по связыванию классического блокатора- а-бунгаротокина;
2. разработанные условия ренатурации были использованы для получения
фторсодержащего эктрацеллюлярного домена и изучения возможности применения
F-ЯМР для контроля за процессом ренатурации и для изучения топографии лиганд-связывающих участков;
-
важной задачей работы являлась также экспрессия и ренатурация цитоплазматического домена 5-субъединицы рецептора Torpedo с целью анализа вторичной структуры и проверки способности к фосфорилированию. Во всех описанных в литературе случаях цитоплазматические домены были получены в денатурированном состоянии.
-
экстрацеллюлярный домен al АХР из мышц человека. Против конформационно зависимых эпитопов в этом домене образуется бо'льшая часть аутоантител у больных миастенией (мышечная слабость). Мы планировали получить ренатурированные (или частично ренатурированные) формы этого домена и проверить, может ли соответствующий белок использоваться для определения уровня аутоантител у больных миастенией;
-
большое значение имеют и нейрональные АХР. В частности, аП АХР - один из наиболее представленных в мозгу АХР. Нарушения в функционировании этого типа рецептора сопровождают ряд нейродегенеративных заболеваний, таких, например, как болезнь Альцгеймера. Отличительной чертой а7-субъединиц АХР является их способность образовывать пентамеры. Подобно рецептору Torpedo, <х7 АХР с высоким сродством связывает a-бунгаротоксин. Поэтому в рамках настоящей работы планировали экспрессировать в E.coli домен а7-субъединицы и изучить его свойства;
Научная новизна и практическая ценность работы, В ходе выполнения данной диссертационной работы получены необходимые конструкции, осуществлена экспрессия всех перечисленных белков и найдены условия их ренатурации. При этом впервые получены лиганд-связывающие домены, содержащие атомы фтора. Для экстрацеллюлярного домена а-субъединицы Torpedo и цитоплазматического домена 5-субъединицы Torpedo впервые получены экспериментальные данные об их вторичной структуре. Найдены условия получения указанных доменов, а также лиганд-связывающего домена а.1 нейронального АХР, практически не содержащего высокомолекулярных агрегатов. Активность экстрацеллюлярных доменов
Апробация полученных данных и публикации. Результаты настоящей работы представлены на чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 1996), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 16 конференции Международного нейрохимического общества (Бостон, США, 1997), Международном конгрессе по ЯМР в белок-белковых и белок-ДНК взаимодействиях (Москва, 2000). По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, изложения полученных результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 102 страниц и включает 37 рисунков и 7 таблиц; список литературы насчитывает 222 наименования.
