Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 8
П.1. Структура и функции 8НЗ-доменов 8
II. 1.1. Общая характеристика БНЗ-доменов 8
II. 1.2. Структура 8НЗ-доменов 9
II. 1.3. Спектриновый SH3-домен дикого типа и его варианты 12
П.2. Структурные и термодинамические особенности р-шпилек в изолированном виде и в составе 8НЗ-доменов 16
П.2.1. Принципы организации изолированной Р-структуры 16
П.2.2. Химерные формы спектринового SH3-домена типа «Бержерак» 20
II.3. Анализ структуры комплексов 8НЗ-доменов с лигандами 22
11.3.1. Полипролиновая спираль И 22
11.3.2. Взаимодействие БНЗ-доменов с полипролиновыми пептидами 23
П.3.3. Способность БНЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях 25
П.3.4. Энергетика связывания пептидных лигандов SH3-доменами 27
III. Материалы и методы 31
III. 1. Материалы 31
III. 1.1. Химические реактивы, приборы 31
III. 1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды 33
III.2. Методы 34
Ш.2.1. Методы генной инженерии и микробиологии 34
Ш.2.2. Биохимические методы 38
Ш.2.3. Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных 41
Ш.2.4. Спектроскопия ЯМР 43
Ш.2.5. Физические методы исследования 45
ПІ.2.5.1. Анализ данных сканирующей калориметрии и проверка справедли вости модели двух состояний 46
Ш.2.5.2. Флуоресцентная спектроскопия и применение модели двух состоя ний к анализу денатурации белков мочевиной 52
ІП.2.5.3. Более сложные модели равновесных переходов 54
IV. Резульаты и обсуждение 57
IV. 1. Структурно-термодинамические исследования белков семейства «Бер-
жерак» 57
IV. 1.1. Кристаллизация белков и исследование их структуры методом РСА.57
IV. 1.2. Структуры SHH-SH3 и SHA-SH3, определенные методом ЯМР 64
IV. 1.3. Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак» 67
IV. 1.4. Спектры флуоресценции и разворачивание SHA-SH3 мочевиной 74
IV.1.5. Отклонения от одностадийной модели разворачивания 75
IV. 1.6. Обсуждение результатов исследований белков «Бержерак» 76
IV.2. Структурно-термодинамические исследования доменов с пришитыми лиганадами 83
IV.2.1. Дизайн химерных белков с пришитыми лигандами 83
IV.2.1.1. Дизайн F2-SH3 84
IV.2.1.2. Дизайн химерных белков с длинным линкром на основе PWT-SH3.85
IV.2.2. Клонирование белков с пришитыми лигандами 87
IV.2.3. Кристаллизация белков с пришимыми лигандами 88
IV.2.4. Структура F2-SH3, определенная методом ЯМР 89
IV.2.5. Кристаллографическая структура С1-SH3 92
IV.2.6. Исследования термодинамики разворачивания структуры химерных белков с пришитыми лигандами 96
IV.2.6.1.Спектры флуоресценции и равновесное разворачивание структуры химерных белков мочевиной 97
IV.2.6.1.1. Разворачивание F2-SH3 мочевиной 99
IV.2.6.1.2. Разворачивание WT-SH3 и С1-SH3 мочевиной 101
IV.2.6.2. Калориметрические исследования белков 103
IV.2.6.2.1. Исследования F2-SH3 103
IV.2.6.2.2. Оценка возможных отклонений от «идеализированной» модели двух состояний для белка F2-SH3 108
IV.2.6.2.3. Оценка теплоемкости и других параметров для F2-SH3, исходя из структуры белка 115
IV.2.6.2.4. Калориметрические исследования химерных белков с длинными линкерами 119
IV.2.7. Обсуждение результатов структурно-термодлинамических исследований химерных белков с пришитыми лигандами 120
V. Выводы 125
Благодарности 127
Список цитируемой литературы
- Спектриновый SH3-домен дикого типа и его варианты
- Способность БНЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях
- Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных
- Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак»
Введение к работе
Проблема сворачивания полипептидной цепочки в уникальную пространственную структуру является одной из важнейших и находится на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена известно, что аминокислотная цепочка белка в растворе способна самопроизвольно переходить из развернутого состояния в упорядоченное, соответствующее минимуму свободной энергии. За последние годы в понимании термодинамики сворачивания биополимеров достигнут большой прогресс и разработаны алгоритмы предсказания пространственной структуры белков, основанные на минимизации энергии. Эти алгоритмы, однако, до сих пор не дают однозначного решения из-за недостаточной точности их параметризации. Особенно это актуально для факторов, определяющих стабильность (3-структуры в растворе, а также для оценки энергетики образования полипролиновой спирали II, которая в последнее время считается наиболее предпочтительной конформацией полипептидной цепи в развернутых белках. Фрагменты белков, находящиеся в этой конформации, играют важную роль и в регуляции внутриклеточных процессов эукариот через взаимодействие пролин богатых участков с SH3-доменами - компонентами и других мультидоменных белков. Данная работа посвящена созданию белковых моделей и уточнению на их основе термодинамических параметров образования элементов Р-структуры и полипролиновой спирали II, а также параметров белок - пептидных взаимодействий в системе SH3 -домен/лиганд.
Экспериментальные подходы к исследованию модельных олигопептидов, имеющих тенденцию к образованию р-шпилек, сильно ограничены ввиду их малых размеров, плохой растворимости, склонности к агрегации и неспособности находиться в полностью структурированной форме без фиксации концов. С целью одновременного устранения перечисленных проблем и облегчения прямых калориметрических и структурных исследований мы решили использовать небольшие химерные белки, в которых имеющаяся в бел ке-хозяине Р-шпилька удлинена на несколько пар остатков, так чтобы эти остатки выступали в раствор за пределы глобулы. Структурные исследования, проведенные с помощью ЯМР и РСА, показали, что встроенные фрагменты действительно находятся в конформации (3-шпильки. В результате использования таких модельных белков впервые путем прямых калориметрических измерений были определены тепловые эффекты и изменения других термодинамических функций при образовании квази-изолированной р-структуры в растворе. Этим исследованиям посвящена первая часть диссертации.
Кроме того, в данной работе был выполнен дизайн новых белков путем включения в полипептидную цепь спектринового SH3-домена олигопептидов (лигандов) богатых пролином, через линкеры разной длины. Проведены термодинамические исследования вновь созданных белков, а также определена структура некоторых из них, что позволило дать адекватную структурную интерпретацию термодинамической информация.
Спектриновый SH3-домен дикого типа и его варианты
При этом замены в 47 положении не меняют тип р-поворота и конформация главной цепи в нем остается практически неизменной (рис. II-4A), а в случае мутанта D48G-SH3 происходит смена на более предпочтительный и чаще встречающийся в укладках белков тип Г (рис. ІІ-4Б).
Несмотря на то, что остатки аспарагина в 47 положении и аспарагиновой кислоты в 48 положении экспонированы на воду и не являются частью гидрофобного ядра, их замена привела к изменению стабильности всего домена, причем, в одном случае к снижению, а в другом к ее повышению (Маг tinez et al., 1998; Vega et al., 2000; Casares et al., 2003). Так, замена аспарагина на аланин (N47A-SH3) понизила стабильность структуры белка на 1.9 кДж/моль при рН 3.0 (Vega et al., 2000; Casares et al., 2003). Замены же остатков на глицин, напротив, привели к стабилизации: в случае Asn47— Gly (N47G-SH3) на 2.0 кДж/моль независимо от условий (Vega et al., 2000; Casares et al., 2003), а в случае Asp48- Gly (D48G-SH3) на 3.64 кДж/моль (усредненные данные, полученные из кинетических экспериментов) (Martinez et al., 1998). Было отмечено, что замена аспарагиновой кислоты 48 на глицин привела к стабилизации структуры за счет увеличения скорости сворачивания полипептидной цепи без изменения механизма перехода. Исследование такого типа мутантов дало возможность оценить энергетический эффект некоторых замен в (3-повороте независимо от контекста, что невозможно или очень сложно выполнить на изолированных модельных пептидах. Было исследовано влияние и других замен на кинетику и термодинамику сворачивания ЭНЗ-доменов, в частности было проведено компенсаторное ремоделиро-вание гидрофобного ядра с сохранением его объема и общей топологии белка, оказавшее слабое влияние на процесс самоорганизации (Cobos et al., 2003).
Помимо введения аминокислотных замен, были произведены и более радикальные перестройки первичной структуры белка, в частности, были созданы так называемые круговые пермутанты (рис. П-5) — белки, в которых природные С- и N- концы соединены, а новые концы образованы разрывом в одной из петель белка (Viguera et al., 1996, Martinez et al., 1999; Viguera and Serrano, 2001). Для облегчения генно-инженерных манипуляций при конструировании круговых пермутантов был создан вариант белка дикого типа, названный псевдодиким типом (PWT - pseudo wild type) (PDB: 1PWT) со слегка измененной N-концевой последовательностью (mGTG вместо mDETG в WT-SH3).
Путем трансформации последовательности PWT-SH3 было создано три круговых пермутанта. Один из них с разрывом в RT-петле был назван
S19P20s-SH3 (PDB: 1TUC). Он важен для дальнейшего рассмотрения, поскольку на его основе нами были созданы химерные белки с пептидным ли-гандом, присоединенным к N-концу этого пермутанта. Из рисунка Н-5 видно, что расположение элементов вторичной структуры и общая трехмерная организация у пермутантов те же, что у исходного домена. Исключения составляют конформации участков, близких к точкам разрывов (Viguera et al., 1995; Viguera et al.} 1996; Berisio et al., 2001).
Оказалось, что стабильность структур пермутантов несколько ниже, чем у структуры PWT-SH3, однако, она достаточно высока для того, чтобы белок находился в свернутом состоянии при нейтральных рН. Кинетика сворачивания изменяется и белок находит новые пути к минимуму свободной энергии, однако сам этот минимум по-прежнему соответствует нативной укладке (Viguera et al., 1996).
Одной из самых простых форм антипараллельного Р-складчатого листа является Р-шпилька. Ещё в 1989 году были разработаны две номенклатуры Р-шпилек (Sibanda et al., 1989), различающиеся по количеству аминокислотных остатков в р-повороте (рис. П-в). Наиболее распространенными являются 2:2 шпильки, однако в белках молено встретить 3:5 и 4:4 шпильки и другие, с менее распространенными конформациями Р-листа.
Способность БНЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях
Уникальная способность Pro и полипролиновых повторов влиять на стабильность и функции белков исследуется с помощью биофизических подходов на сигнальных доменах, мышечных белках, фрагментах прионов. Остаток пролина является уникальным - единственным элементом природной пептидной цепи, который, будучи встроенным в регулярную структуру её остова, принудительно фиксирует конфигурацию участка, лишенного торсионных углов со, ф и ограничивает возможности внутримолекулярных вращений. Ограничения торсионного угла (р по N-C связи Pro незначительные и составляют около - 63, тогда как ограничения для угла \j/ по Са-С связи могут варьировать от — 35 (а - область) до + 150 ф - регион). Однако наиболее сильные ограничения на торсионные углы накладываются на остаток X, предшествующий Pro. Остаток Pro встречается в белках и пептидах, принимая две различные конформации: РРП и PPL РРП - это левозакрученная поли-Ь-пролиновая спираль II типа, в которой все Х-Pro связи находятся в транс - положении (двугранный угол со для Cx-NPro равен 180). PPI - правозакрученная поли-Ь-пролиновая спираль I типа, у которой все Х-Pro связи находятся в цис - положении (со = 0), встречается, когда в качестве растворителя выступают органические соединения, такие как пропанол или бутанол. РРП спирали встречаются чаще на поверхности глобулярных белков, поскольку в этом случае «завязывается» максимальное количество водородных связей между пептидом и молекулами воды.
Очень часто полипролиновые лиганды взаимодействуют с функционально важными сигнальными доменами через РРП спирали. Энергетика таких взаимодействий более подробно будет описана ниже. Однако функции полипролиновых олигопептидов много разнообразнее и достаточно подробно описаны в литературе (Reiersen and Rees, 2001; Otvos, 2002; Markossian et al., 2004).
SH3-домены из различных белков в комплексе с пролин - содержащими последовательностями широко используются для исследования белок-пептидных взаимодействий. Соответствующие комплексы, вероятно, являются одними из наиболее известных моделей молекулярного узнавания (Mayer, 2001; Musacchio et al., 1994b; Renzoni et al., 1996; Arold et al., 1997; Pisabarro et al., 1998; Gnose et al., 2001).
В последние годы была накоплена детальная информация, как структурная, так и термодинамическая о силе и специфичности взаимодействия различных 8НЗ-доменов с их партнерами (Kay et al., 2000; Viguera et al., 1994a; Pisabarro and Serrano, 1996; Mayer, 2001; Cesareni et al., 2002; Tong et al., 2002). Пролин - богатые последовательности могут располагаться как во внутридоменной области мульти - доменных белков, так и на поверхности многих глобулярных белков. Одной из возможных причин избыточного количества пролинов в белках, содержащих, например, полипролиновые спирали, это их устойчивость к действию протеаз. Остатки пролина, формируя неровную гидрофобную поверхность в пептиде, очень хорошо контактируют с ароматическими остатками с образованием Ван-дер-Ваальсовых контактов. Также, была показана возможность образования водородных связей, например, между карбонильной группой пролина и индольным протоном триптофана для всех белковых доменов, которые взаимодействуют с полипролино-выми пептидами, а именно, для SH3-, EVH1- доменов, профилина и WW-домена (Macias et al, 2002). Как видно из рис. П-8, связывающий участок SH3-домена состоит из гидрофобной поверхности, включающий в себя три мелких кармана, ограниченных консервативными ароматическими остатками триптофана, двумя тирозинами и пролином (Kay et al., 2000). Первые два кармана связывают остатки пролинов, разделенных гидрофобными остатками в РххР мотиве. Третий карман, известный как «карман специфичности», фланкирован RT - и n-src петлями и играет важную роль в определении специфичности взаимодействия (Mayer, 2001). На его дне, как правило, расположены ароматические остатки. Рис. П-8. Комплекс Sro-домена белка Grb2 с лигандом, связанным в ориентации П. Сиреневым цветом выделены четыре консервативных остатка, образующих поверхность связывания в большинстве 8НЗ-доменов. II. 3.3. Способность 8НЗ-доменов связывать полипролиновые спирали в двух ориентациях
Было показано (рис. П-9), что SFD-домены способны связывать пролин - богатые последовательности в двух ориентациях, I и И. К первому классу относятся лиганды, имеющие следующую консенсусную последовательность: RxhPPhP, где х - любой, h - гидрофобный аминокислотные остатки. Ко второму классу лигандов относятся лиганды с последовательностью: PxhPxR. Оба консенсуса являются частью PxhP мотива, характерного для по-липролиновой спирали II типа (Fernandez-Ballester et al., 2004).
Важным отличием между лигандами I и II типов в том, что связывание осуществляется в противоположных ориентациях относительно поверхности Sro-домена (Feng et al., 1994, Fernandez-Ballester et al., 2004). Возможность связывания в двух ориентациях обеспечивается зеркальной симметрией по-липролиновой спирали (Fernandez-Ballester et al., 2004).
Кристаллизация белков и сбор дифракционных данных
Ограничения по расстояниям были получены из трехмерных экспериментов 15N- и 13С- NOESY (для алифатической и ароматической области спектра) с временем смешивания компонент намагниченности, равным 80 мс. Редактирование и интегрирование собранных сигналов проводилось в программе "CARA". Торсионные углы ср и \/ полипептидной цепи были предсказаны программой "PREDITOR", исходя из химических сдвигов ядер атомов основной цепи HN, 15N, !На, 13Са, 13СО и I3CP (Berjanskii et al., 2006).
Структуры рассчитывались с помощью программы CYANA (Guntert, 2004). Использовали стандартный протокол, включающий семь циклов комбинированного автоматического отнесения ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) и расчета структур 100 конформаций на каждом шаге цикла. В результате было отобрано по 20 структур с минимальным значением, которые были использованы для заключительного анализа. Полученный ансамбль структур находится в соответствии с экспериментальными данными и показывает хорошую статистику по Рамачандрану (табл. Ш/З). Кроме того, структуры удовлетворяют критериям сходимости, необходимым для достоверного расчета в программе "CYANA".
Сходимость решений соответствует рентгеноструктурному разрешению 2 А, что обусловлено хорошим качеством 3D- NOESY-спектров и практически полным набором отнесения 96.5%. Экспериментально полученные ЯМР - ограничения и атомные координаты 20 структур химерных белков SHA-, SHH-, F2- SH3 были депонированы в базу данных PDB с кодами доступа 2RMO, 1PDB, 2RN6 соответственно.
Для исследования свойств глобулярных белков используется большое число различных физико-химических методов, чувствительных к различным уровням организации белковой молекулы. Такой многосторонний подход позволяет получить наиболее полную информацию о структурных изменениях, претерпеваемых молекулой белка в процессах денатурации и ренатурации. В данной работе использовался метод триптофановой флуоресценции и метод сканирующей микрокалориметрии.
Микрокалориметрические измерения осуществлялись на дифференциальном сканирующем микрокалориметре «Scal-І» (Россия) со стеклянными ячейками объемом 0.32 мл при избыточном давлении 2 — 2.2 атм и скорости сканирования 1 К/мин. Сбор данных осуществлялся автоматически с шагом 0.1 К. Для записи данных использовалась программа "Wscal", разработанная в лаборатории термодинамики белка (Институт белка РАН, Пущино). Анализ кривых теплопоглощения проводили с помощью программы "SigmaPlot", используя алгоритмы, разработанные ранее (Filimonov et al., 1982).
Перед экспериментом лиофильно высушенный белок растворялся в соответствующем буфере и диализовался против двух смен 200 кратного объема этого буфера не менее 16 часов. Концентрация белка измерялась спектрофотометрически на длине волны 280 нм, используя молярный коэффициент экстинкции 16150 см М"1 для WT-, PWT- и D48G- SH3, и 17300 см" М 1 для всех химерных вариантов «Бержерак», для C1-SH3 и других вариантов с коротким и длинным линкерами - 16150 см М" .
Подробное описание методов анализа равновесных денатурационных кривых и, в частности, кривых теплопоглощения, полученных методом сканирующей микрокалориметрии, изложено в публикациях (Filimonov et al., 1999; 1982; Matveev et al., 1983). Ниже излагаются основы применения этих методов для модели двух состояний и более сложных моделей.
Еще в ранних работах по денатурации небольших белков (Мг 25 кДа) было обнаружено (Privalov, 1979), что процесс равновесного разворачивания их структуры хорошо описывается самой простой моделью двух состояний: Ku N - U (ПІЛ).
При этом физические характеристики, отражающие состояние системы, будут меняться с температурой или ростом концентрации денатуранта S-образно. А зависимости для их производных, в частности парциальной теплоемкости, соответственно будут иметь форму пика. Формально для модели двух состояний должно выполняться: FN + FV = 1 (III.2), где FM И FU фракции или заселенности макроскопических состояний - нативного и развернутого. Для их нахождения надо знать статсумму системы, которая выражается как: Q = і + ки (ш.з), если термодинамические параметры нативного состояния приняты за точку отсчета. Заселенности состояний определяются через статсумму: Ftrl/Q, Fu=Ka/Q (IIL4-III.5), после чего любая функция состояния, в частности, энтальпия выражаются как: Н = HNFN + HvFu (111.6), где Н - усредненное значение энтальпии системы.
Микрокалориметрические исследования белков «Бержерак»
В исследованиях, проведенных ранее, было показано, что для многих ЭНЗ-Бержерак наблюдается двухстадийная кинетика сворачивания, но наиболее стабильный белок SHH-SH3 и некоторые другие варианты имеют не идеальные шевронные графики, в частности, фланги кривых сворачивания (Viguera and Serrano, 2001; Viguera and Serrano, 2003). Поэтому было предположено, что эти белки интереснее исследовать в равновесных условиях, где вставка дополнительных остатков в виде «носа» может увеличивать заселенность промежуточного состояния при равновесном разворачивании, выражающееся на кривых СР(Т). Два варианта, SHI- и SHA- SH3, отличающиеся от SHH-SH3 одиночной и двойной заменами массивных гидрофобных групп в IVY кластере на аланины (табл. II/1), которые коррелируют с данными по разворачиванию белков мочевиной, не только имеют стабильность более низкую, по сравнению с SHH-SH3, но также демонстрируют практически идеальные шевронные графики. Другим интересным вариантом является SHE-SH3 с заменой N/A в оптимизированном Р-повороте. В некотором роде, этот последний вариант является аналогом N47A-SH3 мутанта, который показал очень сильную и неожиданную тенденцию к образованию олигомеров и амилоидов даже в очень мягких условиях (Morel et al., 2006). очками). CPJN и СР;и Т(К) теплоемкости нативного и развернутого состояний, соответственно.
При рН 7.0 тепло-индуцированное развернутое состояние всех «Берже-рак» показывает довольно сильную тенденцию к образованию олигомеров и/или агрегатов. Такое поведение является типичным для большинства глобулярных белков вблизи их изоэлектрических точек. Тем не менее, в области рН от 2.5 до 3.5 и относительно низкой концентрации белков (около 250 мкМ) и низкой ионной силе (25 мМ) тепловое разворачивание всех белков высоко обратимо, профили теплопоглощения не зависят от скорости прогрева или концентрации белка. Большинство записываемых в этих условиях СР(Т) функций очень хорошо описывается простой моделью двух состояний как индивидуальных кривых (рис. IV-10), так и семейства кривых, подгоняемых одновременно (рис. IV-11). Качество подгонок является довольно высоким и не предполагает заселения никаких других состояний, кроме заселенности нативного и развернутого состояний.
Разворачивание варианта SHA-SH3 было наилучшим во всех условиях, что позволило понижать точку его полуперехода Tm, {&uNG(Tm) = Q) вплоть до комнатной температуры просто изменяя рН. Поэтому для этого варианта наиболее полные данные представлены на рис. IV-11. данных. Подгонка экспериментальных данных осуществлялась по модели двух состояний. C/;/V и Ср и -теплоемкости нативного и разверну Согласно данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, зависимость стабильности структуры SHA-SH3 от рН близка к таковой для WT-SH3 при рН 3.0 (рис. IV-12), тогда как ниже этого значения кривые различаются, указывая на то, что вставка носа приводит к дополнительному сдвигу рК некоторых кислых групп. Скорее всего, эти сдвиги относятся к остаткам E45d и E48d, карбоксильные группы которых в структуре SHH-SH3 пространственно сближены с аминогруппой К46а. В любом случае, зависимости Тт от рН должны иметь энтропийную природу, поскольку энтальпия протонирования карбоксильных групп близка к нулю. Рис. IV-12. Зависимость точки полу перехода (Тп1) от рН для SHA-SH3 (открытые квадраты) и WT-SH3 (залитые кружки). Сплошная линия показывает наилучшую подгонку сигмоиды через данные SHA-SH3.
