Содержание к диссертации
Введение
1. Белки обонятельного эпителия наземных позвоночных (обзор литературы) 7
1.1. Введение 8
1.2. Строение органа обоняния наземных позвоночных 11
1.2.1. Структура и функции слизи обонятельного эпителия 15
1.3. Белки, участвующие в перирецепторных процессах 17
1.3.1. Одорант-связывающие белки 17 1.3.1.1. Запах-связывающие свойства ОСБ in vitro и их физиологическая роль in vivo 20
1.3.2. Ферменты биотрансформации 23
1.4. Белки, принимающие участие в рецепции обонятельного сигнала 27
1.4.1. Белки, специфичные для ресничек обонятельных рецепторных клеток 29
1.4.2. Мембранные белки обонятельного эпителия, способные эффективно связывать молекулы одорантов 32
1.4.3. Семейство генов, кодирующих белки, принадлежащие к классу рецепторов, сопряженных с G-белками 34
1.4.4. Рекомбинантные белки, продукты экспрессии генов, кодирующих обонятельные рецепторы позвоночных 39
1.5. Заключение 41
2. Результаты и обсуждение 43
2.1. Введение 44
2.2. Определение полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка 46
2.3. Анализ аминокислотной последовательности 45-кДа белка 58
2.4. Определение полной аминокислотной последовательности 28-кДа белка 63
2.5. Анализ аминокислотной последовательности 28-кДа белка 67
3. Экспериментальная часть (материалы и методы) 71
3.1. Материалы 72
3.1.1. Реактивы 72
3.1.2. Ферменты 73
3.1.3. Штаммы Е. coli и плазмидные векторы 73
3.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы 73
3.1.4.1. Микробиологические среды 73
3.1.4.2. Буферные растворы для денатурации и иммобилизации ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах 74
3.1.4.3. Растворы для гибридизации нуклеиновых кислот 74
3.1.4.4. Растворы для in situ гибридизации на тканевых срезах 74
3.1.4.5. Растворы для выделения плазмидной ДНК 75
3.1.4.6. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК и РНК 75
3.1.4.7. Буферные растворы для приготовления компетентных клеток Е. coli 76
3.1.4.8. Фотографические растворы 76
3.1.4.9. Другие растворы 77 3.2. Методы 77 "
3.2.1. Протеолиз 45-кДа белка 77
3.2.2. Обратно фазовая ВЭЖХ 77
3.2.3. Определение N-концевой аминокислотной последовательности 78
3.2.4. Масс-спектрометрический анализ 78
3.2.5. Приготовление агарозного геля 78
3.2.6. Выделение ДНК фага А. 78
3.2.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соИ 80
3.2.8. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК 81
3.2.9. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна 82
3.2.10. Перенос и иммобилизация ДНК фага Я. на фильтрах 82
3.2.11. Перенос и иммобилизация ДНК из Е.coli на нитроцеллюлозных фильтрах 83
3.2.12. Ник-трансляция ДНК 83
3.2.13. Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов 84
3.2.14. Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек 84
3.2.15. Извлечение ДНК из агарозных гелей 85
3.2.16. Получение компетентных клеток Exoli 86
3.2.17. Трансформация компетентных клеток Е.соИ 86
3.2.18. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 87
3.2.19. Клонирование продуктов ПЦР 87
3.2.20. Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера 88
3.2.21. In situ гибридизация на тканевых срезах 89
4. Выводы 92
5. Спрісок сокращений 93
6. Список литературы
- Строение органа обоняния наземных позвоночных
- Анализ аминокислотной последовательности 45-кДа белка
- Микробиологические среды и буферные растворы
- Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек
Введение к работе
Эпителиальные ткани млекопитающих имеют непосредственный контакт с окружающей средой и больше, чем другие ткани, подвержены ее деструктивному воздействию. Некоторые из этих тканей, в т.ч. и обонятельный эпителий, покрыты слизью, являющейся первым защитным барьером, обеспечивающим нормальное функционирование клеток эпителия. В слизи находится множество белков, определяющих ее защитные свойства, это антибактериальные белки, иммуноглобулины, ферменты биотрансформации, включая некоторые ферменты-антиоксиданты, защищающие клетки эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода.
Ранее при исследовании белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом SDS-электрофореза было выявлено два новых водорастворимых белковых компонента, имеющих молекулярную массу 28 и 45 кДа соответственно, каждый из которых составлял порядка 2% всех белков обонятельного эпителия. Столь значительное содержание этих белков в слизи предполагало их важную роль в обеспечении нормального функционирования клеток обонятельного эпителия, что послужило основанием для последующего изучения их структуры и свойств. Цель работы состояла в определении и анализе полной первичной структуры 28- и 45-кДа белков.
Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору В.М. Липкину за внимание к данной работе и помощь в ее проведении, кандидату химических наук Т.М. Шуваевой за внимание к данной работе, помощь в оформлении диссертации и проведение экспериментов по определению частичной аминокислотной последовательности 45-кДа белка, СВ. Новоселову за помощь в проведении in situ гибридизации, лабораторию биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН за плодотворное сотрудничество, кандидату химических наук Н.С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов, кандидату _ химических наук Т.А.
Мурановой, Ю.Ф. Леоновой и Н.И. Хорошиловой за определение N-концевых аминокислотных последовательностей пептидов и белков, кандидату химических наук О.В. Соловьевой, кандидату химических наук И.А. Костанян и кандидату химических наук Т.В. Ракитиной за ценные советы в работе.
Строение органа обоняния наземных позвоночных
Особенности строения органа обоняния связаны с осуществлением его основной функции - рецепцией обонятельного сигнала. Орган обоняния образован слизистой оболочкой, выстилающей верхнюю часть стенок, а также крышу задней части каждой полости носа. [5]. Обонятельная слизистая оболочка (выстилка) состоит из высокого многорядного эпителия и толстой собственной пластинки - Lamina propria, (рис.3). В собственной пластинке обнаруживается хорошо развитая эластичная базальная мембрана. Более глубокие слои соединительной ткани, образующей собственную пластинку, содержат многочисленные вены, а также трубчато-альвеолярные железы, называемые железами Боумена (рис.3). Эти железы располагаются только в области обонятельной выстилки. Секретируемые ими вещества выводятся по протокам на поверхность обонятельного эпителия, постоянно обновляя состав омывающей его слизи.
Обонятельный эпителий образован тремя основными типами клеток: 1) обонятельными рецепторными клетками, 2) поддерживающими (опорными) и 3) базальными клетками.
Обонятельные рецепторные клетки. Обонятельные рецепторы представляют собой биполярные нейроны. Как и поддерживающие их опорные клетки, рецепторные клетки располагаются перпендикулярно поверхности слизистой оболочки. Их проксимальная часть выступает над поверхностью нейроэпителия в виде булавы и погружена в слизь. От булавы отходит группа длинных (в среднем 20-30 мкм) постепенно суживающихся в дистальном направлении ресничек (цилий), также омываемых слизью. Проксимальные районы ресничек ориентированы перпендикулярно поверхности обонятельного эпителия, а дистальные - параллельно и погружены в слизь на глубину около 5 мкм. [6]. У млекопитающих реснички неподвижны [7]. Многочисленные реснички образуют обширную хеморецепторную поверхность, с которой взаимодействуют молекулы одорантов. В дистальной части обонятельные нейроны дают по одному отростку, который по функциональной роли представляет собой аксон. Аксоны соседних нейронов собираются в группы вблизи базальной мембраны, проходят ее в области перфораций и с помощью многочисленных Шванновских клеток собираются в пучки, образуя немиелинизированные обонятельные нервы, идущие в обонятельную луковицу.
Продолжительность жизни обонятельных нейронов обычно составляет менее трех месяцев [8], поэтому в любой момент времени в обонятельном эпителии можно обнаружить нейроны, находящиеся на разных стадиях созревания и различающиеся по своим морфологическим, физиологическим, биохимическим и иммуноцитохимическим характеристикам. Так, например, зрелые обонятельные нейроны можно отличить по присутствию в них специфичного цитозольного белка, называемого обонятельным маркерным белком (ОМБ) [9,10]. Этот водорастворимый белок с молекулярной массой 19 кДа, локализованный в цитоплазме зрелых обонятельных нейронов, составляет около 1% всех цитозольных белков [9]. Была определена полная аминокислотная последовательность ОМБ [11]. Специфические антитела, полученные против ОМБ, широко используются при идентификации обонятельных рецепторных клеток [12] и анализе нейрогенеза обонятельного эпителия [13]. Вместе с тем физиологическая функция ОМБ до настоящего времени не выяснена.
Поддерживающие (опорные) клетки. Все обонятельные нейроны отделены друг от друга опорными клетками, с которыми они образуют плотные соединения (контакты), локализованные в основании булавы нейронов. Это высокие (150 мкм) клетки, имеющие цилиндрическую форму. Сверху свободная поверхность этих клеток покрыта микровилями (микроворсинками) длиной 3-5 мкм. Микровили окружают булаву обонятельных нейронов- и играют существенную роль в движении слизи в области обонятельного эпителия [14].
Опорные клетки служат «диэлектриками», изолирующими соседние обонятельные нейроны, и, таким образом, выполняют функцию, аналогичную функции глиальных клеток ЦНС. В отличие от клеток млекопитающих, опорные клетки амфибий содержат в апикальной части многочисленные секреторные везикулы, поэтому считается, что они участвуют в формировании слизи, покрывающей обонятельный эпителий [15]. Кроме того, опорные клетки могут выполнять функцию транспорта веществ внутрь ткани и направлять миграцию вновь образующихся рецепторних клеток к поверхности обонятельного эпителия [16].
Базальные тетки. Наконец, третьим основным типом клеток обонятельного эпителия являются базальные клетки. Эти клетки, конической формы, лежат на базальной мембране, располагаясь на определенном расстоянии друг от друга. Различают плоские и шаровидные базальные клетки [17]. Раньше считалось, что базальные клетки дают начало только новым поддерживающим клеткам, за счет чего их состав постоянно обновляется. Однако в дальнейшем было показано, что происходящая в результате воздействия окружающей среды или старения гибель обонятельных нейронов стимулирует деление популяции шаровидных базальных клеток обонятельного эпителия, дочерние клетки которых образуют новые обонятельные нейроны [18]. Способность к восстановлению нервных клеток в течение жизни взрослого организма - это уникальное свойство обонятельного эпителия, представляющее существенное исключение из общего правила, согласно которому нейроны в постнатальном периоде не образуются.
Анализ аминокислотной последовательности 45-кДа белка
Реконструированная из нуклеотидной последовательности кДНК аминокислотная последовательность 45-кДа белка содержит 400 а. о. Рассчитанная молекулярная масса белка составляет 46026 Да, что соответствует полученным ранее данным по SDS 59
электрофорезу [102]. Белок характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных аминокислотных остатков и имеет рассчитанную изоэлектрическую точку 5,73, что соответствует полученным ранее данным по изоэлектрофокусированию [102].
Выявлена существенная гомология между аминокислотной последовательностью 45-кДа белка и аминокислотными последовательностями некоторых белков-переносчиков гидрофобных лигандов, таких как ретиналь-связывающий белок из японского кальмара [121], дрожжевой фосфатидилхолин/фосфатидилинозит транспортный белок SEC 14 [122], ретинальдегид- и а-токоферол-связывающие белки млекопитающих [123-125], а также аминокислотной последовательностью некаталитического домена тирозинфосфатазы [126] (рис. 14). На основании того, что эти белки способны in vitro связывать гидрофобные молекулы (ретиналь, ретинол, токоферол, фосфатидилинозит, фосфатидилхолин), считается, что они являются белками-переносчиками гидрофобных соединений. У всех перечисленных белков, включая 45-кДа белок, присутствует консервативный участок KPFL (у 45-кДа белка - в положении 206-209), который входит в состав лиганд-связывающих участков этих белков [122]. Кроме того большинство из этих белков имеет в составе лиганд-связывающих участков консервативные остатки Е-184, F-198, L-204, К-216, 1-217 (нумерация аминокислотных остатков приведена для первичной структуры 45-кДа белка) [122]. На основании сходства аминокислотной последовательности 45-кДа белка с белками-переносчиками гидрофобных соединений, которое прослеживается и в их лиганд-связывающих участках, было сделано предположение, что 45-кДа белок также выполняет функцию транспортировки гидрофобных молекул. В настоящее время проводятся биохимические исследования по определению того, какое вещество или вещества являются лигандами 45-кДа белка.
Сравнение полной аминокислотной последовательности 45-кДа белка со структурами, хранящимися в SWISS-PROT и GenBank базах данных. Условные обозначения: 45-кДа - 45-кДа белок из обонятельного эпителия крысы, GenBank, AJ132352; АС004997 - гипотетический белок, человек, GenBank, АС004997; RALBP - ретиналь-связывающий белок, японский кальмар, SWISS-PROT, Р49193; SEC14 -фосфатидилхолин/фосфатидилинозит транспортный белок, дрожжи, SWISS-PROT, Р24280; а-ТТР - а-токоферол связывающий белок, крыса, SWISS-PROT, Р41034; CRALBP - ретинальдегид-связывающий белок, мышь, GenBank, AF084638; acommon peptide - пептид, аминокислотная последовательность которого является общей для GTP-связывающего домена a-субъединиц известных G-белков. Жирным шрифтом выделены аминокислотные остатки, инвариантные в четырех и более последовательностях, серым цветом -аминокислотные остатки идентичные остаткам 45-кДа белка. Прочерки введены для оптимизации выравнивания. Цифры справа означают номера последних в строке аминокислотных остатков 45-кДа белка.
Первоначально 45-кДа белок был выделен из обонятельного эпителия крысы и
предполагалось, что он может участвовать в первичных процессах восприятия запахов [102]. Для подтверждения этого предположения необходимо было выяснить, является ли 45-кДа белок специфичным для обонятельного эпителия или локализован и в других тканях крысы. Ранее в нашей лаборатории для определения локализации 45-кДа белка был проведен иммуноблоттинг водорастворимых белков различных тканей крысы (обонятельный эпителий, трахея, легкие, мозг, матка, печень, почки, мышца, кожа) с использованием кроличьих поликлональных антител против 45-кДа белка [127]. Максимальное содержание 45-кДа белка было обнаружено в обонятельном эпителии, несколько меньше - в трахее, легких и коже. Эти ткани были использованы для проведения in situ гибридизации с целью выявления места синтеза 45-кДа белка.
В качестве зондов для экспериментов in situ гибридизации были получены [ Р]-меченные фрагменты мРНК 45-кДа белка гомологичные и комплементарные его мРНК. Для этого плазмиду pGEM-5Zf(+) со вставкой ПЦР-фрагмента А кДНК 45-кДа белка гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Sail или Ncol и полученную ДНК использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro в присутствии [a-j3P]UTP с помощью комплекта реактивов "RNA labelling kit" (Amersham, USA). Транскрипцию проводили с помощью Т7 РНК-полимеразы для получения [ Р]-меченной комплементарной (антисмысловой) рибонуклеотидной пробы и с помощью SP6 РНК-полимеразы для получения [33Р]-меченной гомологичной (смысловой) рибонуклеотидной пробы.
Для подтверждения специфичности гибридизации использовали следующие контроли: отрицательные - 1) гибридизация с [33Р]-меченной смысловой рибонуклеотидной пробой, 2) гибридизация на срезах, обработанных РНКазой и 3) гибридизация с немеченой антисмысловой рибонуклеотидной пробой; и положительный -с [33Р]-меченной антисмысловой рибонуклеотидной пробой на Р-актин.
Наиболее высокий уровень экспрессии был обнаружен в слое эпителия, содержащем тела обонятельных, опорных и стволовых клеток обонятельного эпителия, апикальном районе трахеи, поверхностном слое мерцательного эпителия бронхов и легких и эпидермисе кожи (рис.15).
Микробиологические среды и буферные растворы
В работе использовали: N, N -метиленбисакриламид, акриламид, персульфат аммония, N, N, N , N -тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), додецилсульфат натрия, агарозу, -Bio-Rad, USA; трис-гидроксиметиламинометан (Трис), цитрат натрия, диметилсульфоксид (ДМСО), хлорид магния, ацетат натрия, хлорид кальция, уксусную кислоту, метанол, Р-меркаптоэтанол -Merck, Germany; ампициллин, борную кислоту, бромистый этидий, мочевину, глицерин, БСА, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), Histoplast-S -Serva, Germany; бромфеноловый синий, ксилолцианоловый голубой, триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, - Difco, USA; 2 -дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - Boehringer-Mannheim, Germany; ДЭАЭ-целлюлозу DE-52, ватман 3MM -Whatman, England; дитиотреитол (ДТТ), поливинилпирролидон, фиколл-400, глицерин, мочевина, БСА -Sigma, USA; колонка с обращенной фазой Ultrasphere С18, 5 мкм (0,46x25 см) -Beckman, USA; ионнообменную ДЭАЭ-бумагу NA-45 - Schleicher and Schuell, Germany; нитроцеллюлозу Hybond-C, нейлон Hybond-N, [y-32P]ATP удельной активностью 5000 Ки/ммоль, [а-32Р]АТР удельной активностью 5000 Ки/ммоль - Amersham, USA; [сс-33P]UTP удельной активностью 5000 Ки/ммоль, - ИЗОТОП. Реактивы отечественного производства, использовавшиеся для приготовления буферных и других растворов, имели квалификацию о.с.ч. или х.ч.
Эндонуклеазы рестрикции - Promega, USA; Amersham, USA; Boehringer-Mannheim, Germany; endoproteinase Lys-C из Lysobacter enzymogenes, щелочная фосфатаза из кишечника теленка (CIP)- Boehringer-Mannheim, Germany; ДНК-лигаза фага Т4, полинуклеотидкиназа фага Т4, Promega, USA; РНКаза А, Т7 Sequenase version 2.0 ДНК-полимераза - Amersham, USA; Taq-ДНК полимераза, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli - Promega, USA.
Среда LB: 1%триптон , 0,5% дрожжевой экстракт , 1% NaCl, 0,01М Трис-HCl, рН 8,0. Среда SOB: 2% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ КО, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgS04, рН среды 6,8-7.0. Среда SM: 0.58 % NaCl, 0,2% MgS04,x7H20, 0,05 М Трис-HCl, рН 7,5, 0,01% желатин. Для получения твердых сред добавляли бакто-агар до 1,5% или агарозу до 0,7%. Микробиологические среды стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа при давлении 1 атм. SSC (20Х) - 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0; Денатурирующий раствор - 0,5 М NaOH (для бактериальньк колоний), 0,5 М NaOH; 1,5 М NaCI (для фагов); Нейтрализующий раствор I - 0,2 М Трис-HCl, рН 8,0; 1 М NaCl; Нейтрализующий раствор II - SSC (2Х); 0,05 М ЭДТА; 0,02 М КН2Р04, рН 7,0. Раствор Денхардта (50Х) -1% фиколл-400; 1% поливинилпирролидон; 1% БСА; Гибридизационный раствор - SSC (6Х); раствор Денхардта (5Х); 0,1% SDS; 200 мкг/мл тРНК; Отмывочный раствор - SSC (4Х); 0,1% SDS. РВ - 130 мМ NaCl, 7мМ Na2HP04, ЗмМ NaH2P04. Гибридизационный раствор - 50% формамид, 0,3M NaCl, 20 мМ трис-HCl рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaP04, рН 8,0, 10 % декстрансульфат, раствор Денхарда (IX), 50 мкг/мл тРНК из дрожжей. Отмывочный раствор - 50% формамид, SSC (2Х); ОД М ДТТ. Раствор I - 50 мМ глюкоза; 25 мМ Трис-НСІ, рН 8,0; 10 мМ ЭДТА рН 8,0. Раствор II - 1% SDS; 0,2 М NaOH. Раствор III - 3 М CH3COONa, рН 4,8. Буферные растворы для эндонуклеаз рестрикции: Буфер А: 33 мМ Трис-СН3СООН (рН=7.9), 10 мМ Mg(CHCOOH)2, 66 мМ СНзСООК, 0,5 мМ ДТТ. Буфер М: 10 мМ Трис-НСІ (рН=8.0), 5 мМ MgCl2,100 мМ NaCl, 1 мМ 2-МЭ. Буфер Н: 50 мМ Трис-НСІ (рН=7.5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ. Буферный раствор для ДНК-лигазы фага Т4: 30 мМ Трис-НСІ, рН 7.8, 10 мМ MgCl2,10 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР Буферный раствор для щелочной фосфатазы fCIP): 0,05 М Трис-НСІ, рН 9,0; 1 мМ MgCl2; 0,1 мМ ZnCl2; 10 мМ спермидин. Буферный раствор для Tag ДНК-полимеразы (10X 1: 166 мМ (NH4)2S04; 670 мМ Трис-НС1 (рН=8,8); 15 мМ MgCl2; 0,1% TWEEN-20. Буферный раствор (10х для фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli: 0,5 М Трис-НСІ (рН=7,2); 0,1 М MgS04, 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл БСА. Буферный раствор для полинуклеотидкиназы фага Т4: 0,05 М Трис-HCl, рН 7,6; 0,01 М MgCb ; 0,005 М ДТТ; 0,001 М спермидин; 0,0001 М ЭДТА. Буферный раствор для РНКазы А: 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 8,0. TFB-1 - 30 мМ ацетат калия, рН 5.8; 50 мМ МпС12; 100 мМ КС1; 10 мМ СаС12; 15% глицерин. TFB-2 - 10 мМ MOPS, рН 6,5; 10 мМ КС1; 75 мМ СаС12; 15% глицерин. Проявитель D-19. 2,2 г метола, 96 г Na2SC 3 (безводный), 8,8 г гидрохинона, 20 г Na2CC 3, 5 г КВг растворяли в 1000 мл воды. Проявитель: 1. 14 г метола, 14 г гидрохинона, 500 мл воды 2. 53 г Na2S03 (безводный), 10 г NaOH, 10 г КВг, 500 мл воды Растворы 1 и 2 объединяли и фильтровали. Прерыватель: 2,5%о уксусная кислота Фиксаж: 1. 200 г Na2S203,20 г Na2S03, 800 мл воды 2. 25 мл ледяной уксусной кислоты разводили водой до 100 мл, 3. растворы 1 и 2 объединяли; 4.40 г NH4C1 растворяли в 100 мл Н20; 5. растворы 3 и 4 объединяли.
Блот-гибридизация по Саузерну. Гибридизация in situ бактериальных колоний и фаговых бляшек
Нуклеотидная последовательность субклонированных фрагментов определялась по методу Сенгера на двухцепочечной матрице с использованием набора реактивов "Reagent kit for DNA sequencing with 7-deaza-dGTP and T7 sequenase DNA polymerase" (Amersham, USA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Реакция секвенирования
2-3 мкг плазмидной ДНК денатурировали с помощью 0,4 М NaOH в объеме 10 мкл в течение 10 мин при комнатной температуре. К раствору добавляли 2 мкл раствора праймера для секвенирования (75 нг/мкл), 3 мкл 2 М ацетата аммония, рН 4,5 и 75 мкл 95% этанола. Смесь охлаждали при -70С в течение 20-30 мин. и центрифугировали 15 мин. при 12000 об/мин. Осадок осторожно промывали 0,5 мл 70% этанола и высушивали. Нуклеиновые кислоты растворяли в 8 мкл воды. К раствору добавляли 2 мкл 5Х буфера для секвеназы (200 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 125 мМ NaCl),
2 мкл смеси для мечения (1,5 мкМ dGTP, 1,5 мкМ dTTP, 1,5 мкМ dCTP), разведенной 1:5, 1 мкл 100 мМ ДТТ, 0,5 мкл [a- P]-dATP и 3-5 е.а. Т7 Sequenase version 2.0 ДНК-полимеразы. Смесь инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре. В четыре пробирки, содержащих по 2,5 мкл терминирующей смеси G, А, Т или С, добавляли по 3,5 мкл реакционной смеси и инкубировали 10 мин при 37С Реакцию останавливали добавлением 2 мкл буфера для нанесения (95% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксиленцианол).
Электрофорез в ПААГ и радиоавтография
Электрофорез проводили в 5% ПААГ в ТВЕ буфере при постоянной мощности 55 Ватт. Продолжительность электрофореза варьировали в зависимости от желаемой длины прогона. В ряде случаев буфер в нижней камере содержал 1 М ацетат натрия для создания электролитного градиента. После завершения электрофореза гель, прикрепленный на стекле, фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение 15 мин, промывали холодной водой и высушивали при 80-100С. Высушенный гель экспонировали с рентгеновской пленкой в течение ночи при комнатной температуре. In situ гибридизация на тканевых срезах Подготовка гистологических срезов Животных, находящихся в глубоком наркозе (нимбутал 200 мг/100 г веса), перфузировали PBS (250 мл) с добавлением гепарина 1000 ЕД, затем фиксирующим раствором (0,25% глютаровый альдегид, 4% параформальдегид) как описано в [141]. Постфиксация длилась 4 часа. Исследуемые ткани иссекались, обезвоживались по схеме [142] и заливались в Histoplast-S (Serva, Germany). Срезы изготавливались сериями на микротоме "Райхерт" Австрия, толщина 4-6 мкм.
Контроль сохранности мРНК на гистологических срезах проводили окрашиванием акридиновым оранжевым [142].
Подготовка гистологических срезов к гибридизации проводилась согласно [143] по следующей схеме: депарафинизация - проводка срезов через ксилол дважды по 10 мин., проводка по спиртам понижающейся концентрации этанола (100, 90, 80, 60, 30%о) по 3 мин. в каждой порции, обработка 0,2 М НС1 -20 минут, 2 X SSC -10 минут, 0,1 X SSC - 30 минут при 50С, PBS - 1 минута, на контрольные срезы воздействуют РНКазой А (100 мкг/мл) - 30 минут при 37С, фиксация срезов 4% параформальдегидом - 20 минут, обработка 100 мМ триэтаноламином, 25 мМ ацетангидридом - 10 минут, промывка PBS дважды по 1 минуте, обезвоживание в серии спиртов возрастающей концентрации этанола.
Приготовление радиоактивно меченых РНК-зондов
Плазмиды, содержащие соответствующие вставки, линеаризовали эндонуклеазами рестрикции таким образом, чтобы размер зонда составлял 75-200 п.о.: более длинные зонды менее эффективно проникают к местам локализации мРНК на срезах, а более короткие не дают достаточно сильный гибридизационный сигнал. Полученную ДНК использовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro в присутствии [a-33P]UTP с помощью кита "RNA labelling kit" (Amersham, USA). Для удаления невключившейся метки реакционную смесь осаждали этанолом. Полученный осадок растворяли в гибридизационном буфере. Гибридизация
Гибридизация проводили как описано в [144]. На подготовленные препараты наносилось по 25 мкл гибридизационного буфера, содержащего меченый зонд, далее срезы покрывались покровными стёклами и заклеивались по периметру резиновым клеем. Гибридизация проходила в течение 12 часов при 55С. Постгибризационные отмывки
Срезы отмывали в трёх порциях 4 X SSC по 5 минут, 2 X SSC -30 минут при 45С, 0,1 X SSC - 45 минут при 45С, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации этанола.
