Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1 Апоптоз - запрограммированная клеточная смерть 8
2.1.1 Молекулярные механизмы апоптоза 10
Каспазы 10
Семейство белков Bcl-2 12
2.1.2 Внешний путь развития апоптоза 13
2.1.3 Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза 15
2.2. Ингибиторы апоптоза 17
2.3. Сурвивин 18
2.3.1 Структура сурвивина 19
2.3.2 Экспрессия гена BIRC5 21
2.3.3 Биологические активности сурвивина 21
Ингибирование апоптоза 21
Роль сурвивина в митотическом делении клетки 22
Влияние сурвивина на ангиогенез 23
2.4. PML - (promyelocytic leukemia gene - ген промиелоцитарной лейкемии) 24
2.4.1 Структура гена PML и классификация изоформмРНК 25
2.4.2 Доменная структура белка PML, характеристика его изоформ и компартментализации в клетке 27
2.4.3 Экспрессия гена PML 29
2.4.4 Биологические активности PML 31
РML - регулятор экспрессии генов 31
Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML 32
Противовирусная активность PML 35
2.5. SMAC/DIABLO (Second Mitohondria-derived Activator of Caspases) 36
2.5.1 Структура SMAC/DIABLO 37
2.5.2 Экспрессия гена SMAC/DIABLO 37
2.5.3 Проапоптотическая активность SMAC/DIABLO 38
2.6 Заключение 40
3. Материалы и методы 41
3.1. Материалы 41
3.2 Методы 48
4. Результаты и их обсуждение 58
4.1.Введение 58
4.2. Анализ экспрессии гена BIRC5 и генов его ингибиторов SMAC и PML 58
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях
человека при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода 58
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека 66
4.2. Создание экспрессионных генно-инженерных конструкций, содержащих гены SMAC и PML 69
4.3. Получение клеточных линий А549, HeLa, Calul и NCI-H358, стабильно экспрессирующих SMAC и PML 72
4.4. Анализ эффекта экспрессии гена PML в условиях транзиентной трансфекции клеток линий HeLa, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-N1-PML1 75
4.5. Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5 78
4.6 Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 80
4.7 Анализ влияния стабильной экспрессии гена SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату
цисплатину клеток линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358 82
4.8. Заключение 84
5. Выводы 86
Список цитируемой литературы
- Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза
- Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML
- Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека
- Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5
Введение к работе
Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (IAP, Inhibitor of Apoptosis Protein) [1]. Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза.
Ген BIRC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей [1].
Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ингибирующее действие по отношению к каспазам [2].
Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia) [3]. PML - многофункциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом [4]. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связан с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют [3].
Таким образом, на основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на
значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка [5-7], и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC [8, 9]. Способность подавлять активность промотора BIRC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучена лишь в двух работах и показана только для одной изоформыРМЬ, PML6 [3, 10].
Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами немелкоклеточныи рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект. Цель работы
Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом немелкоклеточныи рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Онкологические заболевания являются одной из важнейших причин смертности в мире и их число с каждым годом растет. Нарушение процесса программируемой клеточной гибели, или апоптоза, играет ключевую роль в прогрессии злокачественных опухолей. Процесс апоптоза контролируется большим числом индукторов и ингибиторов [11]. Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз [12]. Сурвивин (BIRC5) - уникальный белок семейства IAP, который участвует в трёх клеточных процессах (ангиогенез, клеточное деление и процесс апоптоза) и экспрессируется на повышенном уровне практически при всех типах рака [1]. SMAC и PML - природные ингибиторы сурвивина [2, 3], которые могут быть использованы для подавления сурвивина в опухолевых клетках.
Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза
Высвобождаемый цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы 9. APAF-1 - белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD домен HaN-конце и 12 повторяющихся WD-40-последовательностей (WD-дипептид из триптофана и аспартата, терминирующий последовательность из 40 аминокислотных остатков) на С-конце [13]. CARD домен белка APAF-1 в присутствии дАТФ и цитохрома с соединяется с гомологичным доменом прокаспазы 9, образуя апоптосому, аналог DISC комплекса [28]. Образовавшаяся в результате автокаталитического протеолиза зрелая форма каспазы 9, активирует эффекторные каспазы 3, 6 и 7, которые реализуют дальнейшее развитие апоптоза [29].
Другой белок межмембранного пространства митохондрий — AIF, транслоцируется в ядро, где активирует нуклеазу, разрывающую ядерную ДНК на крупные фрагменты длиной 50 тыс. п.н. и более. Апоптоз, вызванный AIF, происходит без участия каспаз [13].
Механизм высвобождения апоптозных белков из межмембранного пространства на сегодняшний день до конца не ясен. Одним из возможных механизмов является образование порового комплекса permeability transition роге (РТР), формирующегося в местах контакта внешней и внутренней мембраны митохондрии. Главными компонентами этого комплекса являются транспортёр аденина, находящийся на внутренней мембраны митохондрии, и потенциал-зависимый канал (порин), находящийся на внешней митохондриальной мембране. Проницаемость порового комплекса регулируется множеством факторов, в том числе концентрацией Са2+ и Mg2+, соотношением АДФ/АТФ, поверхностным зарядом на внешней мембране митохондрии, а так же белками семейства Вс1-2 [21]. Открытие этого канала приводит к притоку ионов в межмембранное пространство и набуханию митохондрии. Это вызывает разрыв внешней мембраны и высвобождение апоптозных белков, в то время как внутренняя мембрана остается интактыой, поскольку имеет большую площадь поверхности. Однако существование такого порового комплекса на настоящий момент под вопросом, предполагается, что он существует не всегда или появляется только на поздних стадиях апоптоза [30].
Недавние исследования показали, что внешний и внутренний мезанизмы апоптоза не функционируют независимо друг от друга. Связующим звеном между этими двумя механизмами является каспаза 8. В некоторых случаях зависимый от рецепторов путь ведет к малоэффективной активации прокаспазы 8, тогда подключается путь апоптоза зависимый от митохондрий, как уже говорилось выше. Каспаза 8 (образовавшаяся в небольших количествах) модифицирует Bid, белок семейства Вс1-2, превращая его в укороченную форму tBid. Далее С-концевой домен tBid внедряется в митохондриальную мембрану, индуцируя выход цитохрома с и развитие апоптоза по митохондриальному пути[31](Рис.2.3). Иногда выделяют и третий механизм развития апоптоза, связанный с накоплением во внутреннем пространстве эндоплазматического ретикулума большого количества белков с неправильной третичной структурой. Это приводит к развитию так называемого ЭР стресса и связанному с ним нарушению Са гомеостаза. Депонированные в ЭР ионы Са2+ выходят в цитоплазму и индуцируют апоптоз предположительно влияя на проницаемость митохондриальной мембраны, либо на активацию прокаспазы 12. Прокаспаза 12 локализована в мембране ЭР и активируется при ЭР-стресс-индуцируемом апоптозе, механизм её активации до конца не ясен, предполагается что в этом принимают участие Са -зависимые цистеиновые протеазы. Помимо каспазы 12 ключевым белком в развитии ЭР-стресс-индуцируемого апоптоза также принимает участие белок ВарЗІ, который активирует прокаспазу 8 [21, 32].
Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз, а также регулировать клеточный цикл и процесс передачи сигнала внутри клетки. В настоящее время у человека обнаружено 8 белков семейства IAP: XIАР (X-linked Inhibitor of Apoptosis, ассоциированный с X хромосомой ингибитор апоптоза), c-IAP-1, c-IAP-2, ILP2, ML-IAP (известный также как ливин), BRUCE (BIR Repeat Containing Ubiquitin-conjugating Enzyme, коньюгированный с убиквитином белок, содержащий BIR-домен), NAIP (Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein, нейрональный белок-ингибитор апоптоза) и сурвивин.
Семейство белков ингибиторов апоптоза (IAP) ([12]). Эти белки объединяют в семейство IAP по наличию от одной до трёх копий 70-80 аминокислотного BIR-домена (baculovirus IAP repeat) на N конце. Некоторые из ингибиторов апоптоза содержат также CARD домен (caspase recruitment domain, каспаза рекрутирующий домен) или RING finger мотив. По наличию/отсутствию RING finger домена и гомологии BIR доменов белки семейства IAP разделяют на 3 класса [12] (см. Рис.2.5). К первому классу относятся белки, содержащие RING finger мотив и гомологичные BIR домены. XIAP, относящийся к этому классу, был первым обнаруженным и хорошо охарактеризованным белком этого семейства. Он связывает и ингибирует каспазы 3, 7 и 9, но не каспазу 8. Во второй класс входит только один белок NAIP, который содержит NB (nucleotide binding) домен, 3 BIR домена, отличающиеся по последовательности от BIR доменов белков 1 класса и не содержит RING finger мотив. Для него показана способность иигибировать каспазы 3 и 7, но не каспазы 1, 4, 5 и 8. Третий класс содержит белки сурвивин и BRUCE, содержащие единственный BIR домен и не имеющие RING finger мотива [12].
Способность белков IAPs взаимодействовать с той или иной каспазой определяется набором имеющихся BIR доменов. Показано, что BIR2 домен белка XIAP способен взаимодействовать с каспазами 3 и 7, a BIR3 домен образует гетеродимер с мономерной формой каспазы 9, препятствуя тем самым её димеризации и активации. Другой путь ингибирования апоптоза показан для белков XIAP и NAIP, которые взаимодействуют с белками сигнального каскада, приводящего к активации антиапоптотического фактора NF-kB. Долгое время оставался неясным вопрос о возможности взаимодействия сурвивина с каспазами ввиду отсутствия у этого белка доменов гомологичных BIR2 и BIR3. На настоящий момент большинство исследователей склоняются к мысли о том, что такое взаимодействие невозможно, и ключевым механизмом инибирования апоптоза сурвивином является его взаимодействие с белком SMAC, которое предотвращает его связывание с другими белками IAP (этот вопрос подробнее обсуждается ниже). Помимо участия в ингибировании апоптоза, сурвивин и XIAP принимают участие в регуляции клеточного цикла (см обзор [12]).
Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML
Известно о роли PML-NB как белкового депо, увеличение уровня PML в клетке вызывает колокализацию многих транскрипционных факторов в PML-NB, что приводит к снижению или повышению транскрипционного уровня контролируемых генов. PML является, по-видимому, не только важным транскрипционным фактором. В ряде исследований показано, что PML участвует в процессе постранскрипционной регуляции экспрессии ряда важных генов [127, 128]. Было установлено, что PML взаимодействует с белком - регулятором трансляции EIF4E [129] и ингибирует EIF4E —зависимый ядерный экспорт мРНК. Ген EIF4E кодирует РНК-связывающий белок, который является онкогеном для клеток человека, так как его эктопическая экспрессия приводит к иммортализации и трансформации нормальных эпителиальных клеток [130]. Белок EIF4E входит в состав дискретных рибонуклеопротеидных частиц образующих функциональные единицы РНК - регулоны (посттранскрипционные опероны), которые регулируют координированную экспрессию эукариотических генов с общими функциями [131]. EIF4E - зависимый РНК регулон контролирует ядерно-цитоплазматический транспорт и трансляцию более 200 различных мРНК генов, белковые продукты которых функционируют как ингибиторы апоптоза и регуляторы клеточной пролиферации: циклины D и Е, сурвивин, ODC, MDM2, MYC, PIM1, FBOX1 [132]. Таким образом, белок PML способен потенциально осуществлять координированную регуляцию экспрессии большого числа генов, многие из которых считаются доказанными онкогенами и важными регуляторами клеточного цикла [127].
Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML PML обладает проапоптотической активностью и способностью подавлять клеточный рост. Повышение содержания PML вызывает индукцию независимого от р53 и Rb апоптоза и остановке клеточного роста [80, 93, 103]. Так, например, инфекция клеток человека линии NB4 ретровирусом, содержащим PML 2 (V), приводила к супрессии способности клеток формировать колонии на мягком агаре, а кондиционированная среда подавляла образование колоний клетками линии NB4 дикого типа. Инъекция мышам таких стабильно трансфицированных клеток приводила к формированию опухолей меньшего размера, появляющихся после большего латентного периода по сравнению с инъекцией клеток дикого типа [80]. Высокий уровень PML 2(V) в клетках линии Hela приводил к ингибированию клеточного роста, формированию колоний в мягком агаре, и остановке клеток в G1 фазе, сопровождающейся снижением содержания циклина Е, cdk2 и р27 [78, 93]. Показано, что повышенная экспрессия PML 2(V) в клеточной линии UMUC-2 (карцинома мочевого пузыря) приводила к снижению содержания белка сурвивина и к повышению содержания активированной каспазы-3 и расщеплённого PARP белка [10]. Подобные эффекты наблюдали в клетках линий HeLa, СНО и NIH, стабильно трансфицированных геном PML [118]. Использование антисмысловых олигонуклеотидов ко всем формам PML приводило к повышению выживаемости клеток линии NIH ЗТЗ в безсывороточной среде, в которой обычно клетки не растут и гибнут в результате апоптоз а [95].
Белок PML 6(14) способен индуцировать апоптоз в опухолевых клетках. Одним из свойств опухолевых клеток является потеря поверхностных антигенов МНС I, что позволяет раковой клетке избежать узнавания и последующей элиминации клетками иммунной системы. Экспрессия гена PML 6(IV) индуцирует синтез белков, участвующих в сборке комплекса МНС I [96], и восстановлению комплекса МНС I на поверхности опухолевых клеток. Иммуноциты распознают клетки, несущие чужеродный антиген в составе комплекса МНС I и индуцируют в этих клетках апоптоз по независимому от митохондрий пути.
Для PML 6 (IV) (обозначенного в работе как PML 3) [97] показано, что его взаимодействие с белком р53 приводило к повышению уровня транскрипции регулируемых р53 проапоптотических генов и снижению выживаемости клеток. Взаимодействие с р53 характерно только для PML б (IV) и осуществляется, по-видимому, за счёт уникального для этой формы С-концевого фрагмента, так как показано, что PML-RARan PML III не взаимодействуют с р53 [97, 100].
Кроме того, PML способен индуцировать апоптоз и по независимому от каспаз пути. Связывание PML со структурными белками рибосомы приводит к деградации 28S рРНК, что является одним из ключевых, независимых от р53 проапоптотических стимулов [82]. PML также вызывает ингибирование NF-к/З-зависимого антиапоптотического пути в результате транслокации в PML-NB ключевого белка этого пути — RelA [74].
Недавно было показано, что одна из изоформ PML - PML 6 (IV) способна ингибировать активность промотора гена BIRC5, кодирующего сурвивин [3]. Повышенная экспрессия PML 6(IV) в клетках линии А549 приводила к снижению содержания сурвивина и апоптозу, сопровождающемуся активацией прокаспазы 9 и каспаз 3 и 7. Данная активность описана только для шестой изоформы PML. Показано, что главную роль в ингибировании трансактивации промотора BIRC5 играет С-концевай домен белка PML 6(IV). Однако механизм подавления активности промотора BIRC5 до сих пор не выяснен. Возможно, это осуществляется через связывание PML 6(IV) с белком Spl, многочисленные сайты связывания которого обнаружены в промоторе гена BIRC5 [133].
Были проведены исследования, определяющие способность белка Мус связываться с различными изоформами PML [99]. Из пяти исследованных изоформ PML (I-V), только
PML 6(IV) вызывал дестабилизацию белка Мус. Связывание белков PML осуществлялось за счёт N- и С-концевых доменов Мус и специфического С-концевого домена PML 6(IV). Повышение экспрессии гена Мус наблюдается в 70% случаев при различных типах рака и приводит к неконтролируемой пролиферации и дифференцировке клеток. Дестабилизация белка Мус вызывает активацию ингибируемых им генов, таких как cdknla/p21 и cdkn2b/pl5 и снижение скорости роста и дифференцировки клеток.
В ядерных тельцах PML 6(IV) колокализован и взаимодействует с белком ретинобластомы (pRB), ключевым белком в регуляции клеточного цикла. Образование комплекса PML с pRB in vivo несомненно является важным для регуляции клеточной дифференцировки и пролиферации [98]. В экспериментах in vitro бьшо показано, что PML 6(IV) взаимодействует с гипофосфорилированной формой pRB и для формирования комплекса необходим как RBCC домен, так и специфический С-конец PML 6(IV). Однако роль специфического домена PML 6(IV) в связывании с pRB не является решающей, так как PML 9(11) также способен взаимодействовать с pRB, только намного слабее, чем PML 6(IV).
Участие PML в регуляции Fas-зависимого апоптоза, связанного с активацией каспаз 3 и 1, было показано в работе [134]. Мыши, дефектные по гену PML (PML ) были устойчивы к действию ионизирующей радиации, которая у контрольных животных вызывает FAS-зависимый апоптоз. Белок Daxx, ингибирующий FAS-зависимый апоптоз, связывается с изоформой PML 5(VI) и входит в состав PML-NB [72] Известно, что Daxx непосредственно взаимодействует с гистондеацетилазами, подавляя транскрипцию генов, участвующих в FAS-зависимом апоптозе [72]. Взаимодействие Daxx происходит при участии RING finger домена PML 5 (VI) [95].
Кроме того, было показано, что только PML 6 (IV) способен вызывать независимое от активности теломсразы преждевременное старение эмбриональных фибробластов (premature senescence) [70].
Интересно то, что экзогенная экспрессия только формы PML 6(IV) не приводила к клеточному старению PML _/" фибробластов, что говорит о необходимости образования димеров с другими формами PML. Недавно бьшо показано, что среди изоформ PML только PML 1(1) и PML 6(IV) эффективно транспортируются в ядрышко в стареющих клетках или клетках, подвергшихся стрессу, именно присутствие PML 1(1) необходимо для такого транспорта [90].
Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека
Клеточные линии являются удобной моделью для исследований процессов опухолеобразования и механизмов подавления роста опухолей. Анализ экспрессии генов сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML важен как для понимания процессов опухолеобразования, так и для возможного использования клеточных линий в экспериментах по исследованию эффекта экспрессии генов SMAC и PML в опухолевых клетках.
В нашей работе методами ОТ-ПЦР и Вестерн-блот анализа был проведен анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в 14 клеточных линиях, происходящих как от разных форм рака легкого (А549, NCI-H23, NCI-H292, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, NCI-H322, NCI-H358, CALU-1, LUDLU-1), так и в клеточных линиях нелегочного происхождения (А431 (эпидермоидная карцинома кожи), НТ1080 (фибросаркома человека), НЕК-293 (трансформированные клетки эмбриональной почки человека), HeLa (аденокарцинома шейки матки)).
Результаты ОТ-ПЦР представлены в Таблице 4.3, а результаты Вестерн-блот анализа - на рисунке 4.3. Образцы кДНК были нормализованы по содержанию кДНК 18S рибосомной РНК. Ген BIRC5 экспрессировался в клетках всех исследованных линиях, при этом содержание мРНК BIRC5 не всегда коррелировало с содержанием белка. Среди всех исследованных клеточных линий наибольший уровень содержания мРНК BIRC5 был обнаружен в легочных клеточных линиях NCI-H1299 и NCI-H460, а в остальных линиях был приблизительно одинаков. Содержание белка сурвивина в экстрактах клеток нелегочных клеточных линий выше, чем в легочных (Рис. 4.3). При этом различия в уровнях транскрипции BIRC5 и содержании белка не зависело от происхождения клеточных линий. PML в экстрактах опухолевых клеточных линий человека.
Содержание мРНК PML1 в клеточных линиях было одинаковым за исключением NCI-H322 и Calu-І, где уровень транскрипции был снижен приблизительно в 8 раз, и линии NCI-H596, где уровень экспрессии был повышен приблизительно в 8 раз по сравнению с другими исследованными линиями клеток (разница при амплификации в 3 цикла ПЦР означает, что количество транскриптов различается в 8 раз). При этом содержание белка PML1 значительно отличалось от уровня транскрипции этого гена. В легочных клеточных линиях, за исключением линий Ludlul, NCI-H23 и NCI-H1299, содержание PML1 было значительно меньше, чем в нелегочных (Рис. 4.3). Интересно то, что в клеточной линии NCI-H596, для которой был показан наибольший уровень транскрипции гена PML1, белок PML1 не был обнаружен методом Вестерн-блот анализа. Возможно, это связано с повышенной деградацией белка PML1 в этой клеточной линии. Вестерн-блот анализ также показал наличие другой изоформы PML, PML9, в клеточных линиях А549, Calul, NCI-H292 и NCI-H596. При этом содержание мРНК PML1 и белков PML1 и PML9 не зависело от происхождения клеточной линии. Также как и для образцов опухолевых и нормальных тканей человека в работе методом ОТ-ПЦР было определено содержание суммарной мРНК всех изоформ PML для нескольких клеточных линии: А549, Calul, NCI-H292, NCI-H596, НЕК293 и HeLa. При этом содержание мРНК PML1 для всех исследованных линии полностью совпадало с содержанием суммарной мРНК всех изоформ PML.
К настоящему времени опубликована только одна работа, где приводятся результаты по определению и сравнению различных изоформ белка PML в клетках [87]. Авторами было показано, что изоформы PML1 и PML9 являются мажорными по представленности в клетках нормальных фибробластов линии MRC5 по сравнению с другими белками PML. Полученные нами данные подтверждают эти результаты. В то же время, в этой работе было показано, что содержание мРНК PML1 в клетках линии HeLa составляет лишь 10% от суммарного уровня транскриптов PML. В нашей работе напротив было показано, что мРНК PML1, также как и белок, являются мажорными по представленности среди всех изоформ PML как в HeLa, так и в других исследованных клеточных линиях.
Содержание мРНК SMAC в клетках линий NCI-H322, NCI-H358, NCI-H1299, LUDLU-1 и НТ1080 было в 8 раз больше, чем в остальных исследованных линиях. Содержание белка SMAC было приблизительно одинаковым во всех клетках (Рис. 4.3).
Таким образом, экспрессия генов BIRC5, SMAC и PML детектируется во всех исследованных клеточных линиях. До настоящего времени не было данных по анализу экспрессии всех трех генов в данных линиях клеток. Литературные данные по экспрессии этих генов в опухолевых клетках человека обсуждались выше. Полученные в этой работе результаты по экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека не противоречат данным по экспрессии этих генов в опухолевых тканях человека.
SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль под действием проапоптотических стимулов. Предшественник SMAC (full SMAC) состоит из 239 аминокислотных остатков, из которых 55 аминокислотных остатков на N-конце составляют сигнальный пептид и отщепляются при транспорте в митохондрии [2]. По литературным данным как зрелый белок (mSMAC) [8, 144], так и его предшественник [9] обладают проапоптотической активностью. В нашей работе для изучения проапоптотической активности белка SMAC были клонированы 2 последовательности кДНК, одна из которых (720 п.н.) кодировала полноразмерный SMAC, содержащий N-сигнальную последовательность, а вторая (555 п.н.) - зрелый белок.
Ген PML имеет размер 2649 п.о. В результате альтернативного сплайсинга РНК PML образуется 12 изоформ PML белка, содержание которых в клетках неодинаково (см. обзор [4]). Нами клонирована 3 -концевая последовательность кДНК длиной 1392 п.н., содержащая 5-9 (последний) экзоны гена PML и кодирующая 420-882 а.к. белка PML1. Выбранный для клонирования фрагмент PML1 включал в себя практически всю (за исключением 13 С-концевых аминокислот) С-концевую последовательность PML6, для которого была показана способность подавлять активность промотора BIRC5 [3].
кДНК генов SKMC и PML получали методом ОТ-ПЦР как описано в п.3.2.17, используя суммарную РНК из клеток, для которых нами была показана повышенная экспрессия этих генов (лимфатическая ткань человека и клеточная линия HL60 соответственно). Прямые праймеры содержали кодон инициации трансляции ATG и последовательность (G/A)NNATGG [155] для правильной трансляции эукариотических генов, а обратные праймеры - стоп-кодон TGA. Прямые и обратные праймеры содержали также сайты узнавания рестриктаз Sal I и Not I соответственно для последующего клонирования в плазмиды рС1 и pFB-Neo. Амгошфицированные ПЦР-фрагменты клонировали в вектор pGEM. pGEM имеет размер 3000 п.о. и предназначен для клонирования ПЦР продуктов. Наличие у линеаризованного вектора на 3 -конце каждой из цепей тимидилового нуклеотида, делает возможным клонирование ПЦР-продуктов, имеющих 3 -выступающие адениловые основания, и значительно снижает фон вектора без вставки. Полилинкер находится внутри последовательности, кодирующей а-пептид /3-галактозидазы, что позволяет осуществлять бело-голубую селекцию колоний, несущих вектор со вставкой клонируемого ПЦР-продукта.
Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5
В ряде работ ранее было показано, что повышенная экспрессия как зрелого, так и полноразмерного белка SMAC, пли обработка белком SMAC приводят к апоптозу или к увеличению чувствительности клеток к противоопухолевым химиотерапевтическим препаратам. Так, например, инфекция аденовирусами, несущими ген, кодирующий зрелый белок SMAC под контролем промотора цитомегаловируса, индуцировала апоптоз в клетках карциномы яичника, не оказывая влияния на нормальные клетки, и приводила к уменьшению периода полужизни белка сурвивина. Внутрибрюшинное введение таких аденовирусов мышам с привитыми опухолями яичника приводило к увеличению их выживаемости [9]. Трансфекция клеток нейробластомы экспрессионной конструкцией, содержащей ген, кодирующий зрелый белок SMAC, индуцировала апоптоз и замедляла пролиферацию опухолевых клеток в условиях роста при низкой клеточной плотности и также приводила к ингибированию активности белков сурвивин и ШАР [144]. В других работах SMAC приводил к увеличению чувствительности обрабатываемых клеток к цисплатину [6], [136], этопозиду, доксорубицину, паклитакселу и SN-38 [5].
В нашей работе анализ влияния стабильной экспрессии mSMAC и full SMAC на клеточную пролиферацию линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, а также в клеток дикого типа и клеток, трансфицированных ретровирусом без вставки проводили МТТ методом как описано в п.3.2.20. Оптическую плотность экстрагированного красителя измеряли через каждые 24 часа после добавления МТТ в течение 5 дней. Строили зависимость оптической плотности от времени роста клеток с помощью программы Excel.
На графиках, приведенных на рис. 4.12 видно, что скорость роста клеток всех исследуемых линий, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, не отличается от скорости роста клеток дикого типа и трансфицированных ретровирусом без целевого гена. Таким образом, стабильная экспрессия mSMAC и full SMAC не влияет на пролиферацию клеток исследуемых линий.
Определение чувствительности к цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu 1 и NCI-H358, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC ,а также клеток дикого типа и клеток, трансфицированных вирусом без вставки, проводили как описано в п.3.2.21. Через 72 часа инкубации с цисплатином из клеток экстрагировали белки с помощью раствора неионных детергентов и готовили нормализованные по концентрации белка образцы для Вестерн-блот анализа белков маркеров апоптоза, PARP и каспазы 7. Однако никаких изменений чувствительности к цисплатину в клетках стабильно эспрессирующих mSMAC и full SMAC по сравнению с нетрансфицированными и трансфицированными ретровирусом без целевого гена в этих эспериментах мы не наблюдали.
Кроме того, в клетках линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC было проанализировано количество эндогенного белка сурвивина (Рис. 4.13). Было обнаружено, что в клетках, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC практически во всех случаях наблюдается увеличение количества эндогенного сурвивина в от 1,2 до 1,8 раза (Таблица 4.5).
Таким образом, стабильная экспрессия SMAC, как зрелой формы, так и формы белка-предшественника, существенно не влияет на скорость роста опухолевых клеток и их чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину, а также может приводить к компенсаторному увеличению эндогенного сурвивина, что может объяснять отсутствие проапоптотического эффекта SMAC в трансфицированных клетках. Наблюдаемый эффект увеличения количества эндогенного сурвивина ранее не был описан в литературе. На основе полученных данных можно заключить, что SMAC не является перспективным агентом в терапии злокачественных опухолей.
Полученные в данной работе результаты позволяют утверждать, что ген BIRC5 является надежным маркером при опухолеобразовании у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и плоскоклеточным раком пищевода, в то время как гены SMAC и PML не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров опухолеобразования. PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении злокачественных опухолей с функционально активным р53, и, в отличие от PML6, его проапототическое действие не связано с подавлением активности промотора гена BIRC5. SMAC не является перспективным агентом в противоопухолевой терапии, по крайней мере для опухолей легкого, поскольку его повышенная экспрессия в раковых клеточных культурах легочного происхождения приводит к компенсаторному увеличению содержания эндогенного сурвивина, который является ингибитором апоптоза.
