Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2.1. Структура генома вгс 8
2.2. Белки вгс 11
2.2.1. Белок капсида 12
2.2.2. Гликопротеины оболочки е1 и е2 14
2.2.3. Белок р7 15
2.2.4. Белки ns2,ns3 и ns4a 15
2.2.5. Белок ns4b 18
2.2.6. Белок ns5a 19
2.2.7. Рнк-зависимая рнк-полимераза (ns5b) 27
2.2.7.1. Структура белка 27
2.2.7.2. Биохимические свойства р-рнкп 31
2.2.7.3. Синтез вирусной phkde novo 35
2.2.7.4. Состав и функционирование репликационного комплекса вгс. Белок-белковые взаимодействия 37
2.2.7.5. Ингибиторы р-рнкп вгс 39
2.3. Жизненный цикл вгс 50
2.3.1. Проникновение вирусных частиц в клетку 51
2.3.2. Репликация вгс 54
2.3.3. Трансляция рнк вгс 54
2.3.4. Протеолитическии процессинг и сборка вирусной частицы 56
2.4. Заключение 58
3. Материалы и методы 59
3.1. Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli 61
3.2. Трансформация бактериальных клеток 62
3.3. Манипуляции с плазмидной ДНК 62
3.4. Полимеразная цепная реакция 63
3.5. Конструирование плазмид 63
3.6. Экспрессия и выделение NS5B белка 67
3.7. Экспрессия и выделение белка NS5A 69
3.8. Экспрессия и выделение казеинкиназ I и II 69
3.9. Моделирование вторичной структуры мРНК 70
3.10. Выделение РНК и Nothern-blot гибридизация 71
3.11. Препаративное получение (-)-IRES РНК-матрицы для определения активности Р-PHKndenovo 72
3.12. Определение активности РНК-зависимой РНК-полимеразы 72
3.13. Исследование модифицированных ди- и тригидроксибензолов как ингибиторов активности Р-РНКП 74
3.14. Компьютерное прогнозирование сайтов фосфорилирования белка NS5A казеинкиназами I и II 75
3.15. Фосфорилирование белков казеинкиназами I и II 75
3.16. Получение лизата культуры гепатоцитов человека Huh7 76
3.17. Получение и частичная очистка лизата печени кролика 76
3.18. Протеолиз меченого белка NS5A в SDS-ПААГ 77
3.19. Протеолиз меченого NS5A белка в растворе 78
3.20. Анализ продуктов протеолиза NS5А белка 78
3.21. Оценка влияния степени фосфорилирования белка NS5A на активность Р-РНКП 79
3.22. Определение РНК-связывающей активности белкаNS5А 79
3.23, Определение термодинамических параметров взаимодействия белков NS5A и NS5B 80
3. Результаты и обсуждение 82
3.1, Конструирование системы для эффективной экспрессии белков NS5A и NS5B 82
3.2. Изучение физико-химических свойств Р-РНКП ВГС, оптимизация условий определения РНК-полимеразной активности и изучение ингибиторных свойств производных тригидроксибензола (пирогаллола) 94
Фосфорилирование белка NS5A in vitro и оценка влияния степени фосфорилирования белка на его способность ингибированть Р-РНКП ВГС 103
4. Выводы 116
5. Литература 117
Благодарности 145
- Состав и функционирование репликационного комплекса вгс. Белок-белковые взаимодействия
- Протеолитическии процессинг и сборка вирусной частицы
- Исследование модифицированных ди- и тригидроксибензолов как ингибиторов активности Р-РНКП
- Изучение физико-химических свойств Р-РНКП ВГС, оптимизация условий определения РНК-полимеразной активности и изучение ингибиторных свойств производных тригидроксибензола (пирогаллола)
Введение к работе
Гепатит С представляет собой одно из опаснейших заболеваний человека. В настоящее время по оценкам ВОЗ около 3% мирового населения мира (170 млн) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС) [1]. У 3-10% инфицированных в течение примерно 20 лет развивается цирроз печени с возможным последующим развитием гепатоцеллюлярной карциномы [2]. Кроме того, с данным вирусом ассоциировано большое количество других заболеваний, непосредственно не связанных с печенью, затрагивающих кровь (например, криоглобулинемия), почки (например, гломерулонефрит) и.т.п. [3].
Терапия вируса в настоящее время весьма ограничена по своим возможностям и почти исключительно основана на использовании интерферона а, а также его комбинации с нуклеозидным аналогом рибавирином (I) [2]. Следует отметить крайне низкую эффективность такой терапии, особенно в отношении вируса первого генотипа (к терапии чувствительно менее 30% пациентов). Поиск новых противовирусных препаратов затруднен из-за отсутствия доступных экспериментальных систем. Кроме того, последнее осложняет изучение молекулярно-биологических аспектов функционирования ВГС.
Основными задачами данной работы были разработка системы высокоэффективной экспрессии для получения двух неструктурных белков ВГС (РНК-зависимой РНК-полимеразы и ее регуляторного бежа NS5A), являющихся основньши компонентами репликационного комплекса вируса, поиск низкомолекулярных ингибиторов репликации ВГС, а также изучение некоторых аспектов посттрансляционной модификации белка NS5A.
Состав и функционирование репликационного комплекса вгс. Белок-белковые взаимодействия
Анализ протеолитического процессинга полипептида, являющегося результатом трансляции генома ВГС, первоначально показал образование девяти продуктов [41]. Спустя полтора года был обнаружен десятый короткий пептид молекулярной массы 7 кДа (р7), который располагается в составе исходного полипептида между Е2 гликопротеином и NS2-npoTeHHa3ofl [42]. Белок р7 содержит два гидрофобных трансмембранных домена, соединенных одним гидрофильным участком [43]. Было показано, что этот белок является фактором инфекционности вирусных частиц [44].
В настоящее время считается, что белок р7 в виде гексамера образует кальциевые каналы в черных липидных мембранах [45, 46]. Активность данных каналов может быть ингибирована амантадином - ингибитором аналогичных каналов вируса гриппа, [45] и производными иминосахаров, содержащими длинные алифатические заместители [46].
Белки NS2 и NS3 образуют две функциональных протеиназы (NS2-NS3 и NS3) (рис. 2Б), основной функцией которых является протеолитический процессинг неструктурных белков ВГС [4]. Домен NS2 (810-1026 аминокислотные остатки полипротеина ВГС) проявляет протеиназную активность только в составе NS2-NS3 полипротеина, и его роль в процессинге полипептида ВГС сводится лишь к автопротеолизу с образованием индивидуального NS2. Данный автокатализ необходим для репликации ВГС in vivo, что было подтверждено введением мутации в геном ВГС, лишшившей полипротеин NS2-NS3 протеииазной активности, [11]. Минимальный участок, необходимый для автокатализа, расположен с 904 до 1206 аминокислотного остатка полипротеина. Активность NS2-NS3 автопротеиназы ие зависит от активности протеиназы NS3 (см. ниже) [47]. Стимуляция активности NS2-NS3 в присутствии ионов металлов, в особенности цинка, и ее ингибирование при добавлении ЭДТА позволяют определить NS2-NS3 как цинкзависимую металлопротеиназу. Следует отметить, что структурно-функциональный анализ NS2-NS3 затруднен ввиду гидрофобности белка, препятствующей его выделению.
Биологические функции индивидуального белка NS2, образующегося в результате автокатализа, мало исследованы. Тем не менее, на настоящий момент обсуждается его роль в гиперфосфорилировании другого неструктурного белка ВГС - NS5A (см. далее) [48], ингибировании экспрессии генов с ряда различных клеточных и вирусных промоторов [49], а также ингибировании апоптоза, вызываемого CIDE-B белком клеток печени [50]. Деградация NS2 белка осуществляется при участии протеасом, сигналом для данного процесса является фосфорилирование Serl 68 казеинкиназой II (CKII) [51].
Белок NS3 представляет собой полифункциональный белок, обладающий двумя каталитическими активностями. Его N-концевой домен представляет собой химотрипсин-подобную цинк-связывающую сериновую протеиназу, осуществляющую процессинг С-концевых неструктурных белов ВГС (Рис. 3) [52]. Каталитическая область NS3 протеиназы составляет около 180 N-концевых аминокислотных остатков [53]. Расположение ее протеолитических сайтов в составе полипротеина ВГС соответствует N-концевым остаткам сформированных белков NS4A, NS4B, NS5A и NS5B [52]. На основании сравнительного анализа субстратных свойств синтетических пептидов по отношению к 1Я53-протеиназе была определена первичная структура сайта, расщепляемого ШЗ-протеиназой: (E/D)XVV(L/P)C/(S/A) [54].
Эффективность действия NS3-протеиназы увеличивается при образовании стабильного комплекса с NS4A - маленьким белком размером 54 аминокислотных остатка (Рис. 3) [55]. Кроме усиления протеиназной активности NS3 белка, NS4A способен также ингибировать трансляцию белков клетки-хозяина [56].
С-концевой домен NS3, охватывающий две трети белка, содержит структурные мотивы, характерные для DEAD-box РНК-хеликаз, и обладает хеликазной и полинуклеотид-стимулируемой нуклеозидтрифосфатазной активностями [57]. NS3- еликаза способна расплетать двуцепочечные РНК и ДНК, а также ДЫК-РНК-гетеродуплексы в направлении 3 -5 [58], утилизируя как рибо-, так и дезоксирибоиукле-озидтрифосфаты [59]. Кофактор NS4A усиливает хеликазную активность вследствие увеличения процессивности фермента [60]. Сайт-направленный мутагенез указывает, что некоторые точечные мутации консервативных остатков в ШТазном и РНК-хеликазном мотивах приводят к потере обеих функций, а некоторые - лишь одной из них [57, 61].
Белок NS3 влияет на ряд клеточных функции. Так, сообщаюсь о понижении фосфорилироваиия гистонов вследствие взаимодействия данного вирусного белка с сАМР-зависимой протеинкиназой, что приводит к ингибированию активности последней, изменению ее локализации и, как следствие, нарушению сАМР-зависимого сигнального пути [62]. Экспрессия NS3 белка в В-клетках или клетках печени индуцирует изоформы синтазы оксида азота (iNOS), вызывающие двуцепочечные разрывы ДНК (DSBs) при участии N0, что приводит к повышению частоты мутаций в генах опухолевых супрессоров и активации iNOS промотора при участии NF- B и АР-1 факторов транскрипции [63]. Показано также образование комплекса NS3 с белком р53 без изменения стабильности и транскрипционной активности последнего [64], а также р53-индуцируемое накопление NS3 хеликазы в ядре [65]. Взаимодействие NS3-p53 приводит к подавлению промотора р21-бежа, что, в свою очередь, повышает скорость роста клеток, экспрессирующих NS3, по сравнению с его не содержащими [64]. В ряде случаев наблюдается увеличение теломеразной активности в клеточных линиях с последующей их трансформацией [66]. В то же время, белок NS3 и его предшественник NS2-NS3 способны повышать чувствительность клеток к FAS-индуцированному апоптозу [67], Данный процесс протекает при активации каспаз и блокируется ингибиторами каспазы-8.
Протеиназа NS3 взаимодействует с компонентом иммунопротеасомы LMP7, что не отражается на собственной протеазной активности, но подавляет пептидазную активность протеасомы [68]. Ингибирование последней может нарушать процессинг вирусных антигенов, необходимый для их последующей презентации основным комплексом гистосовместимости (МНС), Возможно, это представляет собой механизм защиты ВГС от иммунной системы хозяина.
Протеолитическии процессинг и сборка вирусной частицы
Синтез (+)-цепи вирусной РНК инициируется с участка, комплементарного (+)-5 -UTR, называемого также (-)-IRES, который в данном случае выполняет ту же роль, что и (+)-3 -UTR [Ю] (рис. 2Б). Первая и вторая шпильки в составе (-)-IRES выполняют при репликации роль негативного и позитивного регуляторов, соответственно [202].
З -UTR взаимодействует с вирусными белками, также с рядом клеточных факторов, что может вносить вклад в эффективность и регуляцию репликации и трансляции. Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин hnRNP-1/PTB, способный связываться с полипиримидиновыми последовательностями, взаимодействует с З -UTR (+)-цепи вирусной РНК, причем для такого взаимодействия необходим не только полипиримидиновый участок, но и "шпильки" II и III Х-РНК (Рис. 2Б) [203]. Следствием этого является частичная репрессия репликации, Аутоантиген La также связывается с (+)-З -UTR, однако в данном случае имеет место усиление репликации вируса. Наконец, среди белков ВГС с данным нетраслируемым регионом (+)-цепи РНК взаимодействуют белок нуклеокапсида [204], хеликаза NS3 [205] и регуляторный белок NS5A [206], однако их роль в репликации вируса достоверно не показана. Тем не менее, согласно одному из предположений, С-белок и NS5A при взаимодействии с вирусной РНК способны приводить к ее димеризации [204] или образованию кольцевой структуры [206], что может быть необходимым для репликации генома вируса.
Инициация трансляции у ВГС происходит по кэп-независимому механизму с четвертого AUG кодона 5 -UTR, кодирующего IRES [7] (Рис. 2А). В случае клеточных мРНК она начинается с взаимодействия eIF4E (кэп-связываюгдей субъединицы eIF4F) с m7G кэпом и связывания 43S комплекса (40S субъединица pH6ocoMbi/eIF2/GTP/MetPHK и eIF3) с мРНК при участии дополнительных факторов eIF4A (хеликазы) и eIF4B. Последующее продвижение комплекса к AUG кодону приводит к образованию 48S иыициаторного комплекса [7]. Напротив, в случае кэп-независимой трансляции ВГС 43S комплекс взаимодействует с AUG-кодоном без участия eIF4A, eIF4B и eIF4F, и данный процесс не зависит от гидролиза АТР [7]. 40S субъединица рибосомы прочно и специфично связывается с II и III доменами IRES [389] так, что Р-сайт располагается в непосредственной близости от AUG кодона. При этом добавления eIF2/GTP/MetPHK оказывается достаточным для закрепления связанной 40S субъединицы с инициаторным кодоном [7, 207]. При этом происходит расположение Р-сайта рибосомы непосредственно напротив AUG, стадия поиска которого у ВГС отсутствует [207]. Кроме того, у-субъединицы eIF2 (eIF2Bgamma и eIF2gamma) взаимодействуют и с IRES [208]. Фактор eIF3, хотя и не является необходимым для образования 48S комплекса, может вносить вклад в эффективность и селективность его образования, так как обладает сродством как к свободной 40S субъединице рибосомы, так и к IRES [7]. Роль фактора сводится к взаимодействию с 40S субъединицей, с которой и связывается eIF2/GTP/MetPHK при гидролизе GTP [207]. Инициация синтеза белка происходит при гидролизе второй молекулы GTP, сопровождающего связывание фактора eIF5, в свою очередь привлекающий 60S субъединицу рибосомы, при ассоциации с которой происходит образование полноценной 80S рибосомы [207]
На эффективность трансляции влияет связывание hnRNP-1/PTB с областью РНК, кодирующей С-белок, 3 - или 5 -UTR с ядерным рибонуклеопротеином, причем данные взаимодействия компенсируют влияние друг друга [209]. Антиген La селективно связывается с 5 -UTR в районе инициаторного AUG кодона, увеличивая сродство IRES к рибосо-мальному белку S5, что способствует сборке рибосом и приводит к усилению трансляции [210]. Кроме того, правильное позиционирование РНК вируса при связывании 40S субъединицы рибосомы зависит от взаимодействия первой с рибосомальным белком S9 [211]. На эффективность трансляции, по-видимому, влияет и другой белок, взаимодействующий с IRES - нуклеолин (ядерный РНК-связывающиЙ белок) [212]. Ряд данных свидетельствует о том, что на эффективность трансляции также влияют изменения в З -UTR [213].
Эффективность трансляции зависит от генотипа ВГС. Так, активность IRES генотипа 2Ь (наиболее активного) превышает таковую IRES генотипа 6а (наименее активного) в три раза [214].
Наконец, показана зависимость эффективности трансляции от фазы клеточного цикла. Так, максимальная эффективность трансляции ВГС в гепатоцитах Huh7 достигается во время митоза (М-фазы), в то время как минимальная - во время фазы покоя G(0). Исходя из этих данных можно предположить, что клеточные факторы либо стимулируют кэп-независимуго трансляцию во время фаз G1 и S, или, наоборот, ее ингибируют во время фаз G2 и М [215].
Исследование модифицированных ди- и тригидроксибензолов как ингибиторов активности Р-РНКП
Выделение РНК. Клетки E.coli штамма Rosetta(DE3), несущие плазмиды рЕТ-21-5ВД55, рЕТ-21-5ВД55-ТАТСА или рЕТ-21-2с-5ВД55, выращивали и индуцировали белок ИПТГ, как описано выше. Аликвоты клеточных культур (2 мл) переносили в пробирки и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин). Осадок суспендировали в 200 мкл буфера G (0,02 М CHjCOONa, рН 5,5, 0,5% (w/v) SDS, and 1 мМ ЭДТА), экстрагировали 200 мкл фенола, предварительно уравновешенного 0,02 М раствором СНзСООЫа (рН 5,5), нагревали при 60С в течение 5 мин при слабом встряхивании и центрифугировали (13200 об/мин, 1 мин). Водную фазу повторно экстрагировали фенолом, после чего РНК осаждали тремя объемами этанола при -70С в течение 30 мин. Осадок отделяли центрифугированием (13200 об/мин, 15 мин), растворяли в 100 мкл буфера G, и РНК переосаждапи еще 2 раза, как описано выше. Конечный осадок растворяли в 50 мкл воды. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм.
Nothern-blot гибридизация РНК. Аликвоты полученного раствора, содержащие 5, 1,3, 0,3 или 0.08 мкг РНК, разбавляли водой до 10 мкл, прибавляли 300 мкл 6,15 М раствора формамида в 10-кратном буфере SSC (1,5 М NaCl, 0,15 М НазС О?). Образцы прогревали при 65С в течение 15 мин, быстро охлаждали во льду и наносили на нитроцеллюлозную мембрану HybondN под вакуумом при помощи прибора MiniFold I vacuum spot-blotter (Schleicher & Schuell). Затем мембрану высушивали на воздухе и гибридизовали с [5 -32Р]-олигонуклеотидом в буфере Н (0,5 М NaH2P04, 1% (w/v) БСА, 1 мМ ЭДТА и 7% (w/v) SDS) при 51С 20 ч, последовательно промывали буферами I (40 мМ NaH2PO„, 0,5% (w/v) БСА, 5% (w/v) SDS и 1 мМ ЭДТА) и J (40 мМ NaH2P04, 1% (w/v) SDS и 1 мМ ЭДТА) при той же температуре и высушивали на воздухе. Визуализацию результатов гибридизации проводили с помощью Packard Cyclone Storage Phosphor System и программы TotalLab 2.01 software (Nonlinear Dynamics Ltd.). 3.11. Препаративное получение (-)-IRES РНК-матрицы для определения активности Р-РНКП de novo
Плазмида, кодирующая РНК ВГС изолята Н77 с удаленным участком, ограниченным сайтами рестрикции BamHl, находящимися в областях, соответствующих белкам Е1 и NS5A, была любезно предоставлена S. Liivac (Бордо, Франция). Амплификация ее участка с использованием олигонуклеотидов 28 и 29 позволила получить линейную ДНК, в которой участок, кодирующий З -UTR (-) цепи вирусной РНК, называемый в литературе (-)-IRES, находился под контролем Т7-промотора. Препаративная транскрипция in vitro проводилась в 250 мкл буфера Трис-НС1 (40 тМ, рН 7,9), содержащего 4 мкг продукта ПЦР, 10 мМ NaCl, б мМ MgCb, 10 мМ спермидин, 1 мМ дитиодреитол, по 2 мМ ATP, GTP, СТР и UTP и 40 мкг РНК-полимеразы бактериофага Т7. Реакционную смесь выдерживали 3 ч при 37С, центрифугировали (13200 об/мин, 5 мин), затем супернатант инкубировали в присутствии 1 ед.акт. RQ1 ДНКазы в течение 15 мин при 37С и последовательно экстрагировали фенолом и хлороформом. (-)-IRES РНК-продукт осаждали в присутствии 0,3 М CHjCOONa (рН 5,2) прибавлением трехкратного количества этанола при -20С. Через 1 ч суспензию центрифугировали (13200 об/мин, 15 мин), осадок дважды промывали 80% (v/v) этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в 35 мкл воды. РНК отделяли от низкомолекулярных примесей на колонке MicroSpin G-50 Column («Amersham Biosciences», Англия). Концентрация РНК в полученном препарате определялась спектрофотометрически и составляла 2 мкг/мкл.
Система 1. Поли(А)-зависимое включение UMP. Стандартная реакционная смесь (20 мкл) содержала 0,3 мкг Р-РНКП, 100 мкг/мл poly(A), 25 мкг/мл (Up)5U, 10 мкМ UTP и мкКи [a-32P]UTP в буфере К (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 20 мМ КСІ, 4 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ). Преинкубацию фермента с праймером и матрицей проводили в течение 20 минут во льду, после чего прибавляли UTP и проводили реакцию в течение 30 мин при 30С. Реакции останавливали нанесением реакционной смеси на DE-81 фильтры, которые затем четырежды промывали 0,5 М натрий-фосфатным буфером (рН 7.0), один раз этанолом и высушивали на воздухе. Сорбированную радиоактивность оценивали по методу Черенкова.
Система 2. Поли(С)-зависимое включение GMP. В данном случае реакционная смесь была аналогичной описанной выше (Система 1), а поли(А), (Up U, UTP и [сс-32P]UTP были заменены на эквимольные количества поли(С), (Gp)i iG, GTP и [cc-32P]GTP.
Система 3. Р-РНКП активность de novo. Реакционная смесь {20 мкл) содержала 0,5 мкг Р-РНКП, 10 ед.акт. РНКзина, 1 мкКи [a-32P]UTP, 3 мкМ UTP, по 100 мкМ АТР, GTP и СТР и 0,4 мкг (-)-IRES РНК-матрицы в буфере К. Реакцию проводили 40 мин при 30С без предварительной инкубации фермента с РНК и наносили реакционную смесь на DE-81 фильтры, которые промывали и измеряли сорбированную на фильтрах радиоактивность, как описано выше.
Система 4. Р-РНКП активность в системе самокомплементарпого праймера SSU. Олигонуклеотид SSU (5 -GCAUGGGCCC-3\ 30 пмоль) фосфорилировали по 5 -концу с помощью [у-32Р]АТР и Т4 полинуклеотидкиназы в объеме 30 мкл в течение 40 мин при 37С. После инактивации фермента при 70С в течение 10 мин к смеси прибавляли 270 пмоль немеченого олигонуклеотида, раствор нагревали до 90С и охлаждали до 20С за 4 ч. Образовавшийся дуплекс отделяли от непрореагировавшей радиоактивной метки на колонке Miscrospin G-50 column («Amersham Biosciences», Англия).
Стандартную реакционную смесь (10 мкл), содержащую 1 пмоль полученного дуплекса, 1 мкг NS5B-BLA8, 0,01-100 мкМ соответствующего/щих NTP в буфере К, инкубировали 30 мин при 30С. Реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на гель (98% деионизированный формамид, 10 мМ ЭДТА, 1 мг/мл бромфеноловый синий, 1 мг/мл ксиленцианол). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% (w/v) ПААГ, радиоактивность визуализовали с помощью Packard Cyclone Storage Phosphor System. 3.13. Исследование модифицированных ди- и тригидроксибензолов как ингибиторов активности Р-РНКП
Определение эффективности ингибиторов. Ингибирующую способность соединений (XXIV-XXVHI) оценивали по величине 1Сэо (концентрация, при которой активность Р-РНКП подавляется на 50%). Для этого в системы 1-3 для определения ферментативной активности (см. выше) добавляли исследуемое вещество до конечной концентрации 0,1-1000 мкМ Ингибиторы вносили в реакционную смесь вместе с NTP после преинкубации фермента с праймером и матрицей (системы 1 и 2). При тестировании соединения (XXIV-XXVIIIa,b,d-f,i,j,l-u) были растворены в ДМСО, а в контрольные пробы добавляли эквивалентный объем ДМСО. Ингибиторы (XXIV-XXVIIIc,g,h,k) вносили в реаіщионную смесь в виде водных растворов, и в контрольную смесь ДМСО не добавляли.
Изучение механизма действия ингибиторов. Для определения влияния соединений на стадию элонгации праймера в системе 1 в реакционную смесь одновременно с UTP и ингибитором вносили гепарин до конечной концентрации 20 мкг/мл для предотвращения реинициации синтеза.
Для оценки действия соединений на образование комплекса фермент-праймер-матрица сравнивали IC5Q ДЛЯ случаев, когда вещество добавляли в преинкубационную смесь вместе с РНК или вместе с UTP после преинкубации.
Изучение физико-химических свойств Р-РНКП ВГС, оптимизация условий определения РНК-полимеразной активности и изучение ингибиторных свойств производных тригидроксибензола (пирогаллола)
Введенные нуклеотидные замены приводили к изменению двух аминокислотных остатков N-концевой области белка, но не отражались на его ферментативной активности. У исходной формы Р-РНКП, образующейся из плазмиды pET-21d-5BA55, три аминокислотных остатка отличаются от таковых для природного NS5B белка (MAMY- vs SMSY-, жирным выделены отличающиеся а.о.). В то же время введение мутаций (плазмида рЕТ-21d-5BA55ATGA) приводит к структуре, более близкой к нативной (MNSY-).
Другим подходом, позволяющим увеличить эффективность инициации трансляции, является введение новой короткой рамки считывания (цистрона) так, чтобы стоп-кодон нового цистрона был вблизи или перекрывался со старт-кодоном второго цистрона, кодирующего целевой белок [230, 233]. Эффект увеличения выхода белка возникает за счет так называемого трансляционного сопряжения, имеющего место в природе в том числе в триптофановом опероне Е.соН [234]. Тремя возможными механизмами сопряжения в литературе называют неполную диссоциацию рибосом на стоп-кодоне первого цистрона, расплетание возможных вторичных структур при трансляции первого цистрона в районе реинициации, а также повышение локальной концентрации факторов трансляции [235]. В данной работе в качестве проксимального цистрона была выбрана короткая АТ-богатая последовательность (Рис. ПС), ранее успешно примененная для создания продуцента бычьего гормона роста [233]. Следует отметить, что данная рамка считывания содержала дополнительную последовательность Шайн-Дальгарна на несколько нуклеотидов выше старт-кодона гена Р-РНКП для обеспечения реинициации трансляции. Выход белка при индукции ИПТГ в течение 4 ч с полученной двуцистронной плазмиды рЕТ-2Ы-2с-5ВД55 повысился в 3,5 раза по сравнению с таковым в случае плазмиды pET-21d-5BA55ATGA (Таблица 6, Рис. 15). Исследование кинетики накопления продукта показало, что максимальный выход белка достигался спустя 6,5-8,5 часов после его индукции ИПТГ и составлял 5 мг/л клеточной культуры (Рис. 16В). Следует отметить, что произведенное изменение достаточно протяженного участка мРНК, предшествующего гену белка NS5B, не привело к нарушению ее вторичной структуры (сохраняется структура, приведенная на рис. 14В). Кроме трансляционного сопряжения, частичный вклад в усиление экспрессии может вносить и 1,9-кратное повышение в клетке уровня соответствующей мРНК (Рис. 15В). Таким образом, замена шести нуклеотидов в районе старт-кодона и введение дополнительного цистрона позволили повысить выход белка в 29 раз, по-видимому, за счет увеличения эффективности инициации трансляции. Выход белка NS5BA55, достигающий 5 мг/л клеточной культуры, соответствует уровню около 2% от общего количества белков Е.соїі. В то же время по литературным данным двуцистронная система позволяет повышать уровень экспрессии рекомбинантных белков до 30-40% [напр. 233]. Одной из возможных причин столь сильного различия между уровнями экспрессии различных белков может быть нарушение природного сопряжения транскрипции (40 нуклеотидов в секунду) и трансляции (около 15 аминокислотных остатков в секунду). Авторы работы [235] высказали предположение, согласно которому для получения максимального выхода необходимо, чтобы транскрипция двуцистронной мРНК осуществлялась РНК-полимеразой Е.соїі. Замена ее промотора на промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 может приводить к дисбалансу между скоростями трансляции и транскрипции и, как следствие, повышению доступности образующейся мРНК для нуклеаз. Чтобы проверить это предположение, мы заменили Т7 промотор на более слабый lac промотор (плазмида pLac-2c-5BA55), однако данная модификация привела к резкому понижению выхода Р-РНКП ВГС (Таблица 6). Таким образом, высказанный в литературе эффект понижения стабильности двуцистронной мРНК, транскрибируемой бактериофаговыми РНК-полимеразами, кажется мало вероятным, по крайней мере в случае Р-РЫКП ВГС.
Ген Р-РНКП ВГС содержит значительное количество так называемых «редких кодонов». В работе была показана необходимость использования для высокоэффективной экспрессии NS5BA55 белка штаммов Е.соїі, содержащих дополнительные копии редких тРНК. Так, замена штамма Rosetta(DE3) на BL-21 (DE3) приводила к понижению выхода NS5BA55 белка в 2,3 раза (Рис. 15А). Таким образом, эффективность элонгации трансляции также определяет уровень экспрессии белка.
Чтобы оценить возможности двуцистронной системы экспрессии, ген NS5BA55 был заменен геном другой мутантной формы, а именно NS5B-BLA8. Несмотря на то, что выход последней при экспрессии с использованием плазмиды pET-21d-NS5B-BLA8 составлял менее 30 мкг/л клеточной культуры, в случае pET-21d-2c-NS5B-BLA8 целевой белок был получен с. миллиграммовым выходом. Следует отметить, что данный мутант Р-РНКП, описанный в литературе [132], был успешно экспрессирован только в случае одного из изолятов ВГС, тогда как в случае других, таких как 1Ь, использовавшийся в нашей работе, экспрессии не наблюдалось (СЕ. Cameron, неопубликованные данные).
Экспрессия неструктурного белка ВГС - NS5A. Разработанная нами двуцистронная система экспрессии позволила получить другой неструктурный белок ВГС - NS5A. В данной работе NS5A был получен с последовательностью из шести остатков гистидина на N- (His-NS5A) или С-конце (NS5A-His) полипептидной цепи. Рекомбинантные формы белка NS5A выделяли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой (Рис. 17В), причем было показано, что NS5A практически не имеет сродства к слабым ионообменникам, как (ДЭАЭ- и КМ-целлюлоза) и слабо связывается с гепарин-агарозой.
Экспрессия NS5A-His с плазмиды рЕТ-21-2с-5А приводила к целевому белку с выходом, сравнимым с таковым для NS5BA55 (около 4 мг/л, таблица 6). Выход His-NS5A, напротив, составлял 30 мг/л (Рис. 17А, Таблица 6). Таким образом, несмотря на идентичность структуры вектора, наличие шести остатков гистидина, расположенных (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLE-) на N-коіще, приводило к 7,5-кратному повышению выхода белка. Это подтверждает высказанное выше предположение о том, что вектор не препятствует высокоэффективной экспрессии гетерологичных белков, тогда как реальный выход в том или ином случае обуславливается структурой экспрессии-руемого гена. Таким образом, для создания продуцента, позволяющего получать целевой белок с выходом 20 мг/л, целесообразно экспрессировать его с эффективно транслируемой аминокислотной последовательностью на N-конце. В пользу этого свидетельствует выход белков His-NS5A и GST-NS5A, равный 30 мг/л при их экспрессии с использованием одноцистронных векторов рЕТ-15Ь и pGEX-5X-l (Таблица 6), а также ряд литературных данных, посвященных экспрессии других белков [напр. 236].
