Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 7
1.1. Успехи традиционной селекции земляники садовой. 7
1.2. Молекулярная селекция земляники садовой. 11
1.2.1. Агробактериальная трансформация земляники садовой. 11
1.2.2. Основные развивающиеся направления молекулярной селекции земляники садовой . 20
1.3. Стратегии повышения антигрибной устойчивости. 26
1.3.1. Использование PR-протеинов для повышения устойчивости к патогенам. 27
1.3.2. Использование дефензинов для повышения устойчивости растений к фитопатогенам. 36
1.3.3. Другие стратегии повышения устойчивости к грибам фитопатогенам . 38
1.4. Молекулярная селекция на изменение вкусовых качеств плодов. 42
Заключение по обзору литературы. 48
Глава 2. Цели и задачи исследований. 50
Глава 3. Объекты и методы исследований. 51
3.1. Объекты исследований. 51
3.2. Культура земляники садовой in vitro. 51
3.3. Регенерация адвентивных побегов из листовых эксплантов. 51
3.4. Адаптация растений к условиям in vivo. 53
3.5. Агробактериальная трансформация земляники садовой. 53
3.6. Выделение тотальной растительной ДНК земляники садовой. 56
3.7. ПЦР-анализ трансгенных линий. 58
3.8. Гистохимический и флюориметрический анализы GUS-активности. 60
3.9. Иммунологический анализ экспрессии тауматина И. 61
3.10. Органолептический анализ плодов земляники садовой. 62
3.11. Анализ влияния экспрессии тауматина II на устойчивость земляники садовой к Botrytis cinerea. 63
3.12. Полевые испытания трансгенных растений земляники садовой с геном суперсладкого белка тауматин II. 66
Глава 4. Результаты исследований. 69
4.1. Адвентивный органогенез из листовых эксплантов земляники садовой. 69
4.2. Генетическая трансформация земляники садовой сорта Фейерверк. 71
4.2.1. Интродукция безинтронного и интрон-содержащего генов uidA. 74
4.2.2. Интродукция в землянику садовую гена редечного дефензина rs-afp2 . 84
4.2.3. Интродукция в землянику садовую гена суперсладкого белка thaumatin II. 89
4.3. Полевые испытания трансгенных растений земляники садовой с геном суперсладкого белка тауматин II. 105
Выводы. 114
Список использованной литературы. 116
- Основные развивающиеся направления молекулярной селекции земляники садовой
- Другие стратегии повышения устойчивости к грибам фитопатогенам
- Анализ влияния экспрессии тауматина II на устойчивость земляники садовой к Botrytis cinerea.
- Интродукция в землянику садовую гена редечного дефензина rs-afp2
Введение к работе
По данным Б АО к 2030 году ожидается увеличение населения планеты с 2 биллионов до 8. В связи с этим в течение 21-го века человечество столкнется с рядом новых трудностей, для решения которых потребуются принципиально новые подходы. Основная проблема, ожидающая человечество в ближайшие десятилетия - продовольственная. Эффективность современного с/х производства не позволит удовлетворить постоянно растущие потребности человечества. По мнению мировой научной общественности, биотехнология является новым и на сегодняшний день наиболее эффективным подходом в решении проблем связанных с повышением продуктивности сельскохозяйственного производства.
Биотехнология по определению является применением наших знаний в решении конкретных практических задач. Чтобы точно охарактеризовать ту ее область, которая нашла свое практическое применение в сельском хозяйстве, используются такие термины как генная инженерия растений, генетическая трансформация, трансгенная технология и молекулярная селекция. По нашему мнению последний термин на сегодняшний день более точно и корректно отражает суть комплекса используемых методик.
Технология генетического модифицирования впервые была разработана в 70-х годах. Наиболее существенным достижением данной технологии являются новые трансгенные с/х культуры с улучшенными агрономическими характеристиками. Наиболее ярким показателем эффективности технологии генетического модифицирования (молекулярной селекции) являются данные о возделываемых площадях генетически модифицированных (ГМ) культур. Они также отражают скорость, с которой научные разработки в данной сфере коммерциализуются и внедряются в с/х производство. Ежегодно на протяжении последних семи лет США, Канада,
Аргентина и Китай являются странами, в которых возделывается подавляющая часть ГМ культур (99% общей мировой площади), таких как соя, хлопчатник, табак, картофель и кукуруза. По данным 2001 года мировая площадь с/х угодий под ГМ культурами составила 52.6 миллионов га (James, 2001). Прирост по сравнению с 2000 годом составил 19 % или 8.4 млн. га, а по сравнению с 1996 годом площадь под ГМ культурами возросла более чем в 30 раз (от 1.7 до 52.6 млн. га).
На долю США в 2001 году приходилось 68 % общей площади ГМ культур (35.7 млн.га), Аргентины - 22 % (11.8 млн.га), Канады - 6 % (3.2 млн.га), Китая - 3 % (1.5 млн.га) (James, 2001).
Ведущими ГМ культурами по итогам 2001 года стали: соя - 63 % (33.3 млн.га), кукуруза - 19 % (9.8 млн.га), хлопчатник - 13 % (6.8 млн.га), рапс - 5 % (2.7 млн.га). На протяжении шестилетнего периода с 1996 до 2001 года устойчивость к гербицидам являлась неизменно ведущей новой агрономической характеристикой всех ГМ культур, после которой следует устойчивость к насекомым обусловленная Bt-токсином. Так, в 2001 году соя, кукуруза и хлопчатник, устойчивые к гербицидам занимали 77 % (40.6 млн.га) общей мировой площади ГМ культур, а культуры с геном Bt-токсина - 15 % (7.8 млн.га) (James, 2001).
Все приведенные выше статистические данные относятся исключительно к ГМ культурам, которые уже запущены в масштабное с/х производство. Однако, этих данных недостаточно для формирования полной картины масштабов и скорости развития этой сферы знания, а также прогнозирования ожидаемых изменений в мировой с/х индустрии. Эти недостатки компенсируются широко доступной в настоящее время информацией о проводимых в мире полевых испытаниях трансгенных культур. Так, лидирующее место в мире по числу всех ежегодно проводимых полевых испытаний занимают США: с 1987 до 1998 гг общее их число возросло в 120 раз от 9 до 1086, в последующие годы оно равнялось 982
(1999 г), 882 (2000 г), 1111 (2001 г), 845 (2002 г). Из них на долю кукурузы приходится 4049, хлопчатника - 590, картофеля - 777, табака - 227. Необходимо также отметить, что ГМ формы таких ведущих плодово-ягодные культур как яблоня, груша, виноград и земляника по данным департамента сельского хозяйства США также успешно проходят стадию полевых испытаний: яблоня - 38, груша - 5, виноград - 40, земляника - 42 (FTR Database of USA).
Таким образом, технология генетического модифицирования нашла широкое применение в создании новых форм ведущих с/х культур с улучшенными характеристиками. Более того, в ближайшее десятилетие будет не только продолжаться рост площади мировых с/х угодий занятых ГМ культурами, но главное, принципиально расширится видовой ассортимент возделываемых культур. Все это неоспоримо доказывает актуальность и перспективность проводимого нами исследования.
Основные развивающиеся направления молекулярной селекции земляники садовой
James и др. (1990) изучили влияние длительности периода селекции трансфомантов на частоту трансформации. По мере удлинения периода селекции от 1 до 60 дней увеличивалась доля трансгенных побегов в общем числе регенерантов - от 28,5 % до 100 %, что привело к увеличению частоты трансформации от 2 % до 12 %. Аналогичная картина наблюдалась и при трансформации черешков листьев, частота трансформации в этом случае возрастала от 5,7 % до 19,9 %. Удлинение периода селекции сопровождается также уменьшением вероятности получения химерных растений.
James и др. (1990) и Nehra и др. (1990а,Ь) использовали для селекции канамицин в концентрации 50 мкг/мл. James и др. (1990) проводил селекцию трансформантов при этой концентрации постоянно из пассажа в пассаж, в то время как Nehra и др. (1990b) после 4-6 недель селекции снижали концентрацию канамицина до 25 мкг/мл. Mathews и др. (1995) трансформировали кусочки листа, черешков, сегменты стебля и такие сложные гетерогенные экспланты, как основания активно пролиферирующих побегов. Для уменьшения вероятности регенерации химер ими была разработана ступенчатая система селекции трансформантов. После ко- культивации с агробактериями экспланты переносили на среду, содержащую 25-50 мкг/мл канамицина или 10 мкг/мл гигромицина, в зависимости от сорта и типа вектора. После 3 недель культуры некрозные участки ткани отбрасывали, а зелёные растущие каллусы и регенеранты пассировали с интервалом в 3-4 недели на свежую среду, постепенно увеличивая концентрацию канамицина до 150 мкг/мл, гигромицина- до 40 мкг/мл. Регенеранты, пролиферирующие при таких высоких концентрациях селективных антибиотиков, нарезали на экспланты, и переносили на среду регенерации, содержащую канамицин или гигромицин в максимальной концентрации. Если в какой-то линии регенерантов у части эксплантов отмечались некрозы, то эта линия рассматривалась как химерная, и этапы регенерации-селекции продолжались до полного исчезновения чувствительных к селективным антибиотикам участков ткани.
Приведённые Mathews и др. (1995) данные не позволяют корректно сравнить частоту трансформации, полученную в этой работе, с данными других исследователей.
Сравнение вирулентности штаммов A. tumefaciens LBA4404, ЕНА101 и ЕНА105 показало, что супервирулентные штаммы ЕНА101 и ЕНА105 обеспечивают в 1,5-5,0 раз более высокую частоту трансформации, чем LBA4404, в зависимости от сорта, вектора и концентрации канамицина.
Как отмечают Mathews и др. (1995), в ряде линий трансгенных растений сорта Tristar методом гистохимического окрашивания выявляются участки нетрансформированной ткани, что указывает на химерную природу полученных растений. Авторы для получения чистых нехимерных линий использовали большое количество циклов регенерации через промежуточную каллусную фазу при жестком селективном давлении канамицина или гигромицина.
Основываясь на результатах исследований Nyman и Wallin (1992) и du Plessis и др. (1996) можно утверждать, что многоэтапная система селекции трансгенной ткани, использованная в работе Mathews и др. (1995), может привести к накоплению различных хромосомных аберраций в трансформантах и, следовательно, к отклонению от признаков исходного сорта.
В последующих работах (Graham и др., 1995; Finstad и Martin, 1995; Du Plessis и др., 1996; Graham и др., 1997; Barcelo и др., 1998; Firsov и Dolgov., 1999; De Mesa и др., 2000) исследователи при анализе трансформантов уже не сталкивались с проблемой химеризма.
James и др. (1990) для быстрого скрининга трансформантов использовали тест на активность гена нопалинсинтазы в каллусах и листьях трансгенных растений. Nehra и др., (1990а,Ь) определяли активность генов uidA и npt II в различных органах трансгенных растений. Экспрессия npt II изучалась методом dot blot гибридизации, гена uidA- гистохимически и флуориметрически (Jefferson, 1987). Судя по данным Nehra и др. (1990а,Ь) и Mathews и др. (1995), наиболее подходящим репортёрным геном для земляники является ген -глюкуронидазы (uidA), который легко детектируется в тканях трансгенных растений.
В большей части известных нам публикаций, посвященных генетической трансформации земляники садовой использовались последовательности селективных, репортерных и смысловых генов без интронов в своем составе. Только в исследованиях Graham и др. (1995) и De Mesa и др. (2000), были получены трансгенные растения земляники садовой с геном /3-глюкуронидазы с картофельным интроном PIV2 в своем составе. Авторы использовали данную генетическую конструкцию, чтобы исключить возможность экспрессии гена uidA в бактериальных клетках и корректно анализировать его транзиентную экспрессию в растительных клетках. Однако в данных работах не были получены растения с безинтронным геном uidA, а также не анализировалось влияние интрона на детектируемую GUS активность.
Работы последних десяти лет показывают, что для стабильной экспрессии гетерологичных генов в ряде случаев недостаточно минимальное регуляторное окружение экспрессирующих кассет, входящих в состав бинарных векторов первого поколения. Включение в структурную часть генов последовательностей одного или нескольких растительных интронов во многих случаях позволяло исследователям повысить уровень и стабильность экспрессии рекомбинантных белков в трансгенных растениях (Koziel и др., 1996; Simpson и Filipowicz, 1996).
Известно, что интроны из таких генов кукурузы как Adhl, Shi, Bzl, Hsp82, actin, Gap Al стимулируют экспрессию гетерологичных последовательностей в ряде однодольных растений (Callis и др., 1987;
Luehrsen и Walbot, 1991; Maas и др., 1991; Sinibaldi и Mettler, 1992; Donath и др., 1995). Подобные результаты получены также при использовании интронов из генов риса salT, Actl, and tpi (McElroy и др., 1990; Xu и др., 1994; Rethmeier и др., 1997).
Другие стратегии повышения устойчивости к грибам фитопатогенам
Родоначальником семейства PR-5 протеинов является тауматин. Van der Wei и Loeve (1972) впервые обнаружили его в присеменниках спелых плодов Thaumatococcus daniellii. Как и остальные группы PR белков выполняют в растительных клетках защитную функцию. Экспрессия PR-5 (TL) протеинов активируется атаками патогенов, механическими повреждениями, а также такими метаболитами как салициловая кислота и ABA. Группа довольно обширна и включает две подгруппы: основную форму, накапливающуюся в вакуолях и кислотную, которая секретируется в апопласт (Stintzi и др., 1993). Последняя форма характеризуется присутствием в последовательности сигнального пептида и отсутствием С- концевого расширения (Bol и др., 1990). Среди TL-протеинов выделяют также две формы по специфичности экспрессии в тканях растения: листовую и «плодовую». Последовательности белков первой формы характеризуются С-концевыми делециями и/или вставками размером до 50 аминокислот. В качестве примера плодоспецифичных тауматин-подобных белков можно привести TL-протеины, обнаруженные в плодах хурмы, вишни и винограда. Так в плодах хурмы Vu с сотрудниками (1994) отмечено присутствие ранее не охарактеризованного белка, анализ последовательности которого показал высокое сродство с тауматином. Еще один член семейства TL-протеинов клонировал и охарактеризовал Fils-Lycaon и др. (1996) из спелых плодов черешни.
У TL-протеинов, которым свойственна плодо-специфичная экспрессия, транскрипционная активация соответствующих генов по времени тем или иным образом связана с аккумуляцией Сахаров в плодах в процессе их созревания (Tattersall и др., 1997). Конкретные механизмы инициации генов соответствующих PR-5 протеинов пока неизвестны, но на примере VVTL-1 из Vitis vinifera (Tattersall и др., 1997) ясно, что этот белок начинает экспрессироваться только выше определенного уровня концентрации гексоз в клетках плодов. Авторы приписывают белку защитную функцию, поскольку высокий уровень углеводов в плодах особенно благоприятствует грибным инфекциям.
Взаимосвязь экспрессии TL-протеинов и аккумуляции углеводов в генеративных органах более детально изучена на примере перматинов. По ряду биохимических и физиологических особенностей они выделяются в обособленную группу белков в пределах семейства PR-5. Впервые белки этой группы обнаружены в семенах кукурузы. Roberts и Selitrennikoff (1990) из семян Zea mays выделили и идентифицировали белок (зеаматин) размером 22 kDa, который в условиях in vitro проявлял антигрибную активность против таких грибов как Candida albicans, Neurospora crassa и Trichoderma reesei. Авторы, изучая свойства белка, пришли к выводу, что наиболее вероятный механизм проявляемой активности пермеабилизация грибной мембраны, вследствие чего изменяется ее проницаемость. В последующем зематин-подобные белки по механизму их антигрибной активности стали называть перматинами.
Совсем недавно Skadsen с сотрудниками (2000) из семян ячменя и овса выделили несколько белков (OATPERM1, BARPERM1 и BARPERM2), которые в силу высокой гомологии с зеаматином отнесены авторами в группу перматинов. Экспрессия OATPERM1 в эндосперме овса и BARPERM1 в эндосперме ячменя начинается в момент, когда накопление крахмала практически завершено Данная асинхронность плохо согласуется с предположением о возможной защитной функции плодоспецифичных TL- протеинов. В тоже время, изучение содержания различных mRNA в зерновках ячменя в период проникновения грибной инфекции внутрь семени показало, что уровень mRNA BARPERM1 не изменяется на фоне резкого снижения пула mRNA в клетках. Последний факт безусловно подтверждает участие перматинов в защитных реакциях растения, но пока не ясно каким именно образом они выполняет свою функцию. Можно предположить, что перматин в семенах накапливается в неактивной форме, а в процессе прорастания подвергается процессингу, и лишь зрелый белок обладает антигрибной активностью. Подобная ситуация может иметь место и в случае с тауматином в плода Thaumatococcus daniellii.
Уникальной особенностью PR-5 протеинов является набор механизмов, посредством которых они проявляют антигрибную активность. Результаты последних исследований обнаружили, по крайней мере, три таких механизма. Так, изучая биологическую активность TL-протеинов различного происхождения, Trudel и др. (1998) обнаружил, что многие из них способны обратимо связываться с водонерастворимыми (3-1,3-глюканами. Интересно, что данной активностью обладают преимущественно стресс-индуцируемые TL-протеины, тогда как конститутивно экспрессируемые плодоспецифичные TL-протеины, в том числе тауматин, а также изученные на данный момент стрессовые PR-протеины табака и томата не проявляют описанной выше активности. Во-вторых, для некоторых тауматин-подобные белков показана ингибирующая активность против а-амилазы и трипсина (Schimoler O Rourke и др., 2001). Пермеабилизация клеточной мембраны - третий и основной механизм, посредством которого TL-протеины проявляют антигрибную активность. Исследование этого механизма начато на зеаматине (Roberts и Selitrennikoff 1990), однако на сегодняшний день он лучше всего изучен на примере осмотина. Abad и др. (1996) показали, что активность осмотина не широкого спектра действия, как ожидолась ранее, а характеризуется видовой специфичностью. Так сильнее всего рост мицелия и прорастание спор инбировались у видов рода Bipolaris, Fusarium и Phytophtora, тогда как Aspergillus sp., Rhyzoctonia sp. и Macrophomina sp. проявили высокую резистентность к осмотину. Помимо видовой специфичности активность осмотина оказалась сильно зависима от стадии развития грибной инфекции. Так, на стадии прорастания спор белок не проявил активности против Aspergillus flavus, Botrytis cinerea и Fusarium graminearum. Однако в последующем, выживаемость первичных гифов в присутствии 100 мкг/мл осмотина составляла 100, 75 и 87 % соответственно. Ингибирование роста грибных клеток обусловлено тем, что молекулы осмотина встраиваясь в их мембраны вызывают нарушение градиента рН между внешней средой и содержимым клеток. Очевидно, что на активность осмотина должен оказывать сильное влияние ионный состав среды.
Анализ влияния экспрессии тауматина II на устойчивость земляники садовой к Botrytis cinerea.
Предварительные исследования по регенерации адвентивных побегов показали, что выбранные сочетания регуляторов роста обеспечивают достаточную для постановки генетических трансформаций частоту регенерации, поэтому три варианта из четырех (БАП - 5 мг/л, ИМК - 0,3 мг/л; БАП - 1 мг/л, ТДЗ - 4 мг/л, ИМК - 0,3 мг/л; ТДЗ - 5 мг/л, ИМК - 0,3 мг/л) использовались в последующей работе, чтобы оценить влияние ТДЗ на эффективность трансформации, поскольку при селективном давлении антибиотиков картина регенерации трансформантов может существенно отличаться от таковой без селективного давления.
Сортовые различия земляники садовой оказывают влияние не только на регенерационный потенциал, но также на эндогенную устойчивость к селективным агентам. Между различными сортами наблюдается существенная вариация в чувствительности к таким распространенным антибиотикам, как канамицин и гигромицин. Graham с сотрудниками (1995), изучая возможность генетического трансформирования сортов Рапсодия, Мелодия и Симфония, обнаружили что даже при селективном давлении канамицина в 50 мг/л имеет место регенерация побегов на 46 % эксплантов. Mathews с сотрудниками (1995) селекцию трансформантов из эксплантов растений сортов Тристар и Тотем проводили поэтапно увеличивая концентрацию антибиотиков от 25 до 200 и от 8 до 70 мг/л для канамицина и гигромицина соответственно. Напротив, Nehra с сотрудниками (1990а) провели успешную генетическую трансформацию сорта Redcoat при селективном давлении 50 мг/л в первом пассаже и 25 мг/л во всех последующих. Также, успешные трансформационные эксперименты проводились при селекции на среде с 25 мг/л канамицина с материалом Fragaria yesca (Mansouri и др., 1996).
Поэтому для оценки токсичности различных антибиотиков и определения их ингибирующей концентрации для сорта Фейерверк в нашей лаборатории раннее проводились эксперименты по регенерации адвентивных побегов из листовых эксплантов на среде регенерации в присутствии селективных агентов (канамицина и гигромицина) в различных концентрациях (данные не приводятся) (Firsov и Dolgov, 1999). Канамицин ингибировал морфогенез уже при 25 мг/л, тогда как полностью рост нетрансгенной ткани прекращался при 50 мг/л. Гигромицин оказался более жестким селективным агентом и ингибировал регенерацию при 5 мг/л, а каллусогенез полностью прекращался при 10 мг/л. Селективные агенты различались не только по ингибирующему рост уровню, но и по реакции исходной ткани эксплантов. На селективных средах с канамицином исходная ткань эксплантов оставалась зеленой и живой в течении 2-3-х пассажей, тогда как на средах с гигромицином ткань отмирала и бурела к концу первого пассажа.
Для проведения генетических трансформаций использовались начальные уровни антибиотиков 50 и 10 мг/л для канамицина и гигромицина соответственно. Во втором и последующих пассажах концентрации снижались вдвое. Более высокое селективное давление в течение первого пассажа было выбрано в связи с тем, что за этот период формируются первичные каллусные группы в местах поранения, состоящие из предположительно трансгенных клеток. Однако в последующем для облегчения регенерации адвентивных побегов из клеток каллусных групп селективное давление снижалось вдвое. Подобная стратегия селекции применялась в работах Nehra и др., (1990а, 1990b). Высокое селективное давление поддерживалось только в течение первых двух пассажей.
С целью изучения тканевой специфичности экспрессии гетерологичных последовательностей в растениях земляники садовой под контролем 35S промотора, использовались векторные конструкции рВ1121 и p35SGUSint, несущие репортерный ген (3-глюкуронидазы. Дополнительно, трансформации данными конструкциями позволят сравнить, во-первых, эффективность селекции на двух различных антибиотиках канамицине и гигромицине Б, во-вторых, оценить влияние модифицированного интрона PIV2 из картофельного гена ST-LS1 на уровень и стабильность гетерологичной экспрессии.
Ранее опубликованные работы по генетической трансформации земляники садовой проводились с использованием в основном гена неомицин фосфотрансферазы nptll в качестве селективного маркера, нежели гигромицин фосфотрансферазы hpt. В единственном сообщении Mathews и др. (1995) не проводится сравнение эффективности этих двух селективных маркеров. Что касается трансформации земляники садовой интрон- содержащими генами, нам известна единственная работа (Graham и др., 1995), в которой исследователи получили трансгенные растения земляники садовой с геном /3-глюкуронидазы с картофельным интроном PIV2 в своем составе. Но в работе не были получены растения с безинтронным геном uidA, а также не анализировалось влияние интрона на детектируемую GUS активность.
Агробактериальная трансформация с использованием бинарного вектора рВ1121. С вектором рВ1121 поставлено три успешных трансформации, причем в двух случаях селекция и регенерация трансформантов велась на среде с сочетанием регуляторов роста БАЛ - 4 мг/л, ТДЗ 1 мг/л, ИМК - 0,3 мг/л (трансформации Ф-6-1 и Ф-6-Ш), а третья трансформация (Ф-6-II) уже без добавки ТДЗ: БАЛ - 5 мг/л, ИМК - 0,3 мг/л. pBIl 21 в качестве селективного растительного маркера содержит nptll, поэтому селекция трансформантов проводилась в присутствии канамицина. При подсчете частоты трансформации оказалось, что присутствие лишь 1 мг/л тидиазурона повышало частоту регенерации трансгенных побегов в среднем в три раза. В тоже время в экпериментах по регенерации без селективного давления такой уровень ТДЗ оказывал несущественное влияние, повышая частоту регенерации адвентивных побегов с 49,7 до 61,3 %. Очевидно, он крайне эффективен на самой ранней стадии регенерации - делении первичной трансгенной клетки, устойчивой к селективному маркеру.
Интродукция в землянику садовую гена редечного дефензина rs-afp2
Анализ влияния экспрессии тауматина II на устойчивость земляники садовой к Botrytis cinerea. Антигрибная активность тауматина изучалась путем постановки биотестов двумя различными методами. В первую очередь оценивалась антигрибная активность коммерчески доступного препарата тауматина II. Для этого использовалась суспензия спор Botrytis cinerea плотностью 104-105 спор/мл, причем сравнение опытного и контрольного вариантов проводились непосредственно в камерах Горяева. Частота и степень прорастания подсчитывались через 20 часов инкубации. Результаты биотеста показывают, что присутствие 100 мкг/мл белка в суспензии существенно ингибирует степень прорастания спор и изменяет морфологию формирующихся гифов (Рис 15 А, Б). Однако в тоже время частота прорастания спор снижалась лишь незначительно (Таблица 11).
Такой характер действия тауматина на споры серой плесени очень схож с антигрибной активностью осмотина (Abad и др., 1996). Показано, что осмотин даже при высокой концентрации (100 мкг/мл) не влияет на сам процесс прорастания и не вызывает лизиса спор Botrytis cinerea. Однако в последующем только 75 % уже проросших спор выживали и формировали нормальный мицелий. Очевидно, что осмотин, а также тауматин и, по- видимому, ряд прочих тауматин-подобных белков могут проявлять активность против фитопатогенов лишь на определенных стадиях развития гриба.
Помимо снижения степени прорастания, отмечено также, что тауматин изменял морфологию формирующихся гифов, они становились изогнутыми и утолщались к верхушке, образуя небольшой шарик (Рис 15 А, Б). Полученные нами данные отчасти подтверждают гипотезу о механизме действия тауматин-подобных белков на грибные клетки (Roberts и Selitrennikoff, 1990). Roberts и Selitrennikoff (1990), изучая биологическую активность зеаматина показали, что белок оказывает ингибирующий эффект на споры Candida albicans и Neurospora crassa лишь в присутствии сублетальной концентрации никкомицина Z, который подавляет синтез хитина в грибных клетках. Подобный синергизм дал основания предположить, что зеаматин оказывает действие на плазматические мембраны, пермеабилизуя их. Очевидно, что присутствие клеточной стенки должно нивелировать действие зеаматина, в тоже время нарушение ее структуры посредством таких ингибиторов как никкомицин Z, наоборот усилит антигрибную активность.
Для изучения влияния тауматина на устойчивость тканей трансгенных растений земляники садовой использовалась методика G.Peng и J.C. Sutton (1991) с некоторыми изменениями (см. более подробное описание в главе «Объекты и методы исследования»). В отличие от стандартной методики, инкубация инокулированных листьев проводилась на увлажненных фильтрах. В методике G.Peng и J.C. Sutton (1991) листья инкубировались на агаризованной среде с добавками параквата и хлорамфеникола. Как оказалось инфекция развивается достаточно быстро и на фильтрах. Более того, по методике G.Peng и J.C. Sutton (1991) степень развития инфекции оценивается только эффективностью спороношения, тогда как модифицированная нами методика позволяет также сравнивать трансгенные линии по некрозу листовых дисков.
Основываясь на результатах ПЦР-анализа и Western-блоттинга, из полученных трансгенных линий земляники были выбраны три клона с уровнем экспрессии тауматина не менее 0,2 мкг на мг суммарного белка, а именно Ф-40-1-2, Ф-40-1-5 и Ф-40-1-7, а также один клон без экспрессии (Ф- 40-1-8). В качестве отрицательного контроля использовались листья с растений дикого типа, линии без экспрессии тауматина (Ф-40-1-8) и трансгенной линии Ф-6-1-2, полученной с использованием векторной конструкции рВ1121.
Предварительные эксперименты показали, что на результаты анализов сильное влияние оказывают не только возраст растительной ткани и состояние инокулюма Botrytis cinerea, а также условия, в которых инкубируются зараженные листовые диски. В роли ключевого фактора в данном случае выступает влажность камеры и фильтровальных подложек. Этот фактор оказывал влияние не столько на характер инфекции, сколько на скорость колонизации листовых дисков. Визуальная оценка развития патогена проводилась через определенные промежутки времени, по этой причине влажность оказывала решающее влияние на результаты сравнения. Внесенное изменение в методику G.Peng и J.C. Sutton (1991), а именно способ по парного сравнения, позволило нивелировать влияние влажности. В этом случае трансгенные линии с экспрессией тауматина сравнивались с одним из отрицательных контролей в пределах одной камеры на общей фильтровальной подложке (в чашке Петри). Например, одну пару составляли Ф-40-1-5 и Ф-6-1-2, причем последний клон в роли отрицательного контроля. Визуальная оценка некроза, проводимая на шестой день после инокуляции, дала следующие результаты: средняя площадь поражения составляла 27,5±12,9 % для Ф-6-1-2, тогда как на дисках клона Ф-40-1-5 некрозные зоны еще не сформировались (Рис 15 В, Г, Д).
