Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 7
Актуальность проблемы 7
Цели и задачи работы 8
Научная новизна 8
Практическая значимость работы 9
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Основные подходы и методы изучения транскриптома 10
Анализ нуклеотидной сложности мРНК 10
Нозерн-блот-гибридизация и создание клонотеккДНК 11
Компьютерные методы исследования 12
Широкомасштабные методы исследования экспрессии генов 14
Метод дифференциального дисплея мРНК 14
Серийный анализ экспрессии генов 15
Тотальный анализ экспрессии генов 16
Метод микрочипов 17
1.2. Особенности структурной организации и функционирования эукариотических
мРНК 19
Структурная организация молекулы мРНК 19
5'-НТО и ее роль в регуляции трансляции мРНК 20
AUG-кодоны в 5'-НТО 22
Короткие рамки считывания 22
Вторичные структуры 23
Нуклеотидные мотивы, участвующие в регуляции трансляции мРНК 24
1.2.3. Роль З'-НТО мРНК в регуляции экспрессии генов 26
Регуляция трансляционной активности транскриптов 26
Механизмы, контролирующие локализацию мРНК в клетке 28
Регуляция стабильности транскриптов 30
1.2.4. Особенности структурно-функциональной организации мозгоспецифических
мРНК 32
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
2.1. Клонирование фрагментов кДНК НтоЬЗ в ДНК фага М13 34
2.1.1. Бактериальные штаммы и векторы для клонирования 34
Среды и растворы 34
Выделение рекомбинантной плазмиды ДНК pUC19 со вставкой НтоЬЗ 34
Получение однонитевой формы бактериофага М13 35
Выделение репликативной формы бактериофага Ml3 36
Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК эндонуклеазами Hindlll и EcoRI 36
Фракционирование ДНК в агарозном геле 36
Элюция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 36
Обработка препаратов фаговой ДНК бактериальной щелочной фосфатазой 37
2.1.10. Получение рекомбинантных молекул фага МІ 3 37
Получение компетентных клеток и высокоэффективная трансформация 38
Определение первичной структуры последовательности НтоЬЗ 38
Электрофоретическое фракционирование продуктов секвенирования ДНК 39
Локализация последовательностей Hfbl и НтоЬЗ на хромосомах 39
Олигонуклеотидные праймеры, используемые в реакции ПЦР 39
Полимеразная цепная реакция 42
Анализ продуктов ПЦР 42
RH-картирование 42
Скрининг космидных клонотек 43
Получение препаратов космидной ДНК 43
Рестриктазное картирование ДНК геномных клонов 44
Рестрикция ДНК космидных клонов 44
Перенос ДНК из агарозных гелей на нейлоновые фильтры "Hybond N+" 44
Получение 32Р-меченого фрагмента ДНК (random-мечение) 45
Гибридизация продуктов рестрикции с меченым зондом 45
2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК фрагмента вставки
клона 11-7 (Ghfb) 46
Клонирование Pstl-фрагмента геномного клона 11-7 в плазмиду pBluescript II SK+ 46
Подготовка образцов для секвенирования 46
Автоматическое секвенирование 47
Выделение тотальной РНК 47
Получение поли(А+)мРНК на олиго(аТ) целлюлозе 48
Нозерн-гибридизация 49
2.12.1. Получение 32Р-меченых зондов 49
2.12.2. Электрофоретическое фракционирование РНК в денатурирующем агарозном
геле 49
2.13.0Т-ПЦР 50
Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой 1 50
Синтез одноцепочечной ДНК 50
Условия амплификации 50
Электрофоретическое фракционирование продуктов ОТ-ПЦР 51
Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР 51
Блот- гибридизация продуктов ОТ-ПЦР 51
2.15.1. Получение 32Р-меченого ПЦР-зонда 51
2.16. Реакция удлинения праймера (Primer extension) 52
Получение Р-меченого маркера и олигонуклеотидных праймеров 52
Гибридизация меченых праймеров с поли(А)+ фракцией мРНК 52
Реакция удлинения праймера 53
Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции 53
2.17. Полу количественный анализ 53
Получение РНК и кДНКиз тканей человека и крыс 53
Полимеразная цепная реакция 54
Компьютерная обработка результатов 54
2.18. Программное обеспечение 56
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 57
Определение первичной структуры последовательности НтоЬЗ 57
Нозерн-гибридизация ДНК клонов Н1Ы и НтоЬЗ 57
Хромосомная локализация последовательностей Hfbl и НтоЬЗ 57
Рестриктазное картирование ДНК геномного клона И-7, включающего последовательность Hfbl 60
Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК геномного клона 11-7 60
Физическое картирование Ghfb в геноме человека 65
In silico анализ последовательности Ghfb 67
Выявление протяженной З'-НТО у транскрипта гена комплексина 2 67
Анализ in silico мРНК комплексина 2 70
ЗЛО. Экзон-интронная организация гена комплексина 2 человека 74
З.И. Выявление двух вариантов транскриптов гена комплексина 2 с помощью
ОТ-ПЦР 74
Исследование in silico промоторных областей гена CPLX2 человека 77
Определение точек инициации транскрипции гена CPLX2 77
Эволюционный консерватизм транскриптов гена комплексина 2. In silico идентификация транскриптов комплексина 2 мыши и крысы 80
Выявление транскриптов гена комплексина 2 в тканях человека и крысы 81
Рестриктазное картирование вставки клона 21-8, включающей последовательность НтоЬЗ 85
Поиск последовательностей, гомологичных НтоЬЗ 85
Выявление протяженной З'-НТО у транскрипта гена МАР1В 87
3.19. Поиск регуляторных участков в З'-НТО транскриптов CPLX2 и МАР1В 89
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104
ВЫВОДЫ 106
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
НТО - нетранслируемые области мРНК
ОРС - открытая рамка считывания
ОТ - обратная транскрипция
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
УФ - ультрафиолет
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CPLX2 - ген комплексина 2 человека
AMV - (avian myeloblastosis virus) - вирус миелобластоза птиц
cR - сантиРэй
DEPC - диэтилпирокарбонат
elF (initiation factors of eukaryotes) - эукариотические факторы инициации
EST (expressed sequence tags) - 5' и 3'-концевые фрагменты экспрессирующихся
последовательностей
GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
Hfbl - клон № 1 из кДНК библиотеки лобной коры головного мозга человека (human
forebrain)
НтоЬЗ - клон № 3 из кДНК библиотеки продолговатого мозга человека (human medulla
oblongata)
m7G - (7 метилгуаншат) - метилированный гуанозин на 5'-конце мРНК эукариот
MAP IB (microtubule-associatedprotein lb) - белок IB, ассоциированный с
микротрубочками
Met-tRNA - тРНК, несущая метионин
SDS - додецилсульфат натрия
SSC - стандартный солевой раствор
TEMED - ї^,]Ч,М,М-тетраметшізтилендиамин
uAUG (upstream AUG) - дополнительный стартовый ко дон, расположенный в 5'-
нетранслируемой области
uORF (upstream open reading frame) - дополнительная рамка считывания, расположенная
выше стартового кодона
Введение к работе
Изучение структурно-функциональных свойств генов и особенностей регуляции их экспрессии относится к числу наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. К настоящему моменту определены полные нуклеотидные последовательности геномов нескольких сотен различных биологических объектов, включая человека. В связи с этим чрезвычайно важную роль стали играть компьютерные методы хранения и анализа информации. Секвенирование геномных последовательностей, а также множества клонов кДНК из тканеспецифических клонотек привело к созданию банков данных накопленной информации, открывших широкую возможность для изучения структурно-функциональной организации транскрибируемых генов. Постоянно расширяющиеся базы данных позволяют осуществлять быстрый сравнительный анализ вновь появляющихся последовательностей и существенно облегчать формулировку предположений относительно их функциональной роли на основе сравнительного структурного анализа [5]. Компьютерные методы анализа информации, накопленной в базах данных секвенированных генов и экспрессирующихся последовательностей, открыли возможность выявления огромного числа неизвестных ранее генов, позволили уточнить экзон-интронную структуру, наличие альтернативных продуктов транскрипции, определить тканеспецифичность экспрессии многих уже описанных генов.
Информация о последовательностях и одновременно разработанные новые технологии анализа экспрессии генов стали мощным инструментом для исследования генов, работающих в такой сложной структуре как мозг. Отличительным и уникальным свойством этого органа является присутствие в нем наибольшего по сравнению с другими тканями числа морфологически и функционально различающихся клеточных популяций, осуществляющих разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белков - продуктов экспрессии огромного числа генов. По предварительным данным общее число генов человека составляет около 30 000, большая часть из которых функционирует в мозге [217, 198, 43, 192]. Мозг осуществляет сложные задачи, ответственные за познание, эмоции, память, интеграцию сенсорной информации и моторную координацию, вовлекающие множество областей и биохимических систем [39]. Нарушения этих функций лежат в основе многих патологических состояний.
Изучение структурной организации генов, активно экспрессирующихся в мозге, является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, определяющих его нормальное функционирование [207, 212]. В
дальнейшем это позволит исследовать роль генов, а также кодируемых ими белков в молекулярных механизмах, лежащих в основе многих заболеваний нервной системы [47].
Цели и задачи работы
Ранее для обнаружения генов, специфически экспрессирующихся в мозге человека, на основе фракции полиаденилированной мРНК различных отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе Hfbl (клон № 1 из клонотеки кДНК лобной коры головного мозга человека, human forebrain) и НтоЬЗ (клон № 3 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata) последовательности которых показали преимущественную экспрессию в головном мозге человека [1].
В целях выявления и идентификации генов, активных в тканях головного мозга человека и включающих последовательности Hfbl и НтоЬЗ, а также для исследования их структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи:
Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НтоЬЗ.
Сравнить секвенированные участки Hfbl и НтоЬЗ с последовательностями ранее изученных генов.
Охарактеризовать структурную организацию генов, включающих последовательности Hfbl (CPLX2) и НтоЬЗ (МАР1В).
Исследовать in silico промоторные области, а также 5'- и 3'- нетранслируемые области транскриптов гена CPLX2, включающих последовательность Hfbl.
Оценить уровень экспрессии транскриптов гена CPLX2 в отделах мозга человека и крысы.
Провести сравнительный анализ структурно-функциональной организации мРНК гена CPLX2 человека с транскриптами соответствующего гена мыши и крысы.
Научная новизна
В результате исследования клонированной ранее мозгоспецифической последовательности Hfbl удалось установить ее принадлежность 3'-концевой части гена комплексина 2 (CPLX2) человека. Впервые описана детальная структура гена CPLX2 человека, а также изучены особенности организации его транскриптов. Показано, что в
регуляции функционирования исследуемого гена принимают участие механизмы альтернативного сплайсинга; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативных варианта мРНК гена CPLX2. Высказаны предположения о возможных механизмах, регулирующих уровень активности гена CPLX2 и соответствующего белка в организме. Впервые исследована представленность транскриптов гена в разных отделах мозга человека и крысы. Впервые проведен сравнительный анализ нетранслируемых участков мРНК комплексина 2 между различными видами млекопитающих, показана эволюционная консервативность участка, отвественного за полиаденилирование.
Изучение клонированной последовательности НтоЬЗ позволило уточнить структурную организацию 3'-концевого участка гена MAP 1В человека, а также особенности строения З'-НТО его транскриптов. Показано, что изучаемый ген экспрессируется в мозге, почке и скелетной мышце человека. В почке и скелетной мышце также обнаружены новые варианты транскриптов гена MAPI В.
Практическая значимость работы
Результаты исследования, позволившие уточнить структуру генов CPLX2 и МАР1В, представляют большой интерес с позиции определения вклада анализируемых генов и их белковых продуктов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в том числе и при патологических состояниях.
Информация о структурной организации транскриптов генов CPLX2 и МАР1В является значимой для дальнейшего изучения особенностей транскрипции и трансляции исследуемых генов. Идентификация функциональных элементов в промоторных областях гена CPLX2, а также в 5'- и З'-НТО его транскриптов позволяет сформулировать гипотезы относительно механизмов регуляции активности данного гена и разработать подходы к экспериментальным исследованиям влияния этих областей на эффективность его экспрессии. Сведения о характере экспрессии исследуемых генов CPLX2 и МАР ЇВ в отдельных тканях могут представлять интерес с точки зрения изучения дальнейшей роли одноименных белков, а также механизмов их взаимодействия с другими белками в исследуемых тканях в норме и при патологии.
