Содержание к диссертации
Введение
1. Генетические различия между человеком и высшими приматами 7
1.1. Сравнение геномных последовательностей 7
1.2. Структурные различия в геноме митохондрий 12
1.3. Цитогенетические различия 13
1.4. Различия в структуре и распределении повторяющихся элементов генома 16
1.4.1. SINE и LINE элементы 17
1.4.2. Эндогенныеретровирусы 21
1.5. Различия в структуре и уровне экспрессии кодирующих последовательностей 23
1.5.1. Случаи инактивации генов. 23
1.5.2. Дупликации генов 25
1.5.3. Полиморфизмы 29
1.5.3.1. Мононуклеотидные полиморфизмы (SNP) 30
1.5.4. Различия в структуре генов -. 31
1.5.5. Различия в статусе метилирования генов 34
1.5.6. Различия в уровне экспрессии генов 35
1.6. Сравнение свойств белков человека и шимпанзе 40
1.7. Заключение 41
2. Сравнение мРНК мозга человека и шимпанзе 43
2.1. Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе 44
2.1.1. Выделение и характеристика суммарной РНК из мозжечков человека и шимпанзе 44
2.1.2. Вычитающая гибридизация. Отбор дифференциальных клонов 45
2.1.3. Дифференциальная гибридизация. Отбор и идентификация дифференциальных транскриптов 47
2.1.4. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК дифференциальных клонов 48
2.1.5. Идентификация клонов, содержащих вставки последовательностей митохондриальных кДНК. 49
2.1.6. Анализ последовательностей кДНК немитохондриальной природы 52
2.1.7. Анализ гена KIAA0537 52
2.2. Структурно-функциональный анализ гена транстиретина 53
2.2.1. Сравнение последовательностей мРНК транстиретина человека и шимпанзе 54
2.2.2. Сравнительный анализ уровня транскрипции гена транстиретина в отделах мозга человека и шимпанзе 57
2.2.3. Тканеспецифичность транскрипции гена транстиретина в разных отделах эмбрионального мозга человека 60
2.2.4. Сравнительный анализ областей регуляции гена транстиретина в геномах мыши, человека и шимпанзе 62
2.2.5. Попытки экспериментальной идентификации регуляторних последовательностей 5'-прилегающей области гена транстиретина человека 67
2.2.6. Попытки идентификации последовательностей гена TTR человека, связывающихся с белками ядерных экстрактов 71
2.2.7. Анализ связывания последовательностей гипотетических энхансеров гена TTR человека и шимпанзе с белками ядерных экстрактов клеточных линий HepG2 и Z310 74
3. Экспериментальная часть 77
Оборудование 77
Реактивы и ферменты 78
Среды, буферы, растворы 79
Ткани 81
Штаммы, культуры, плазмиды 83
Клеточные линии 83
Ядерные экстракты 83
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР 83
Методы 86
Выделение РНК из тканей гуанидин изотиоцианатным методом 86
Синтез первых цепей кДНК на матрице суммарной РНК 87
Вычитающая гибридизация кДНК 88
Дифференциальный скрининг вычтенных библиотек 88
Дифференциальная гибридизация 89
Определение первичной структуры ДНК. 90
RT-PCR 90
Определение активности энхансеров 5'-прилегающего участка гена транстиретина человека 91
Связывание меченых фрагментов с белками ядерного экстракта 93
Метод двумерного торможения в геле (Треугольник) 94
Программное обеспечение 96
Выводы 97
- Структурные различия в геноме митохондрий
- Сравнение свойств белков человека и шимпанзе
- Структурно-функциональный анализ гена транстиретина
- Попытки идентификации последовательностей гена TTR человека, связывающихся с белками ядерных экстрактов
Введение к работе
Среди множества нерешенных проблем эволюции одной из важнейших является определение молекулярно-генетических причин видообразования. В частности, чрезвычайно большой интерес вызывает вопрос, какие молекулярные изменения в структуре генома привели к дивергенции линий, ведущих к современному человеку и шимпанзе. Известно значительное сходство в морфологии и анатомии различных систем и органов человека и шимпанзе, в том числе и мозга. Показано также, что геномы этих двух видов совпадают на 98%, а кодирующие области генома более чем на 99%. При этом общие морфологические и функциональные различия между этими двумя видами очень велики. Это приводит к гипотезе о том, что в основе фенотипических различий лежит сравнительно небольшое число изменений в регуляции экспрессии генов. Однако в настоящее время ни одно из этих различий не обнаружено.
На современном этапе развития молекулярной генетики, когда полные последовательности геномов различных организмов становятся доступными для анализа, наиболее актуальной становится проблема сравнения организмов на уровне транскриптома, т.е. анализ экспрессирующихся последовательностей. Данные, полученные в ходе определения структуры геномов человека и шимпанзе, позволяют делать выводы о структурных различиях в генетическом материале этих видов, однако до настоящего момента очень мало известно о различиях в экспрессии отдельных генов между этими двумя близкородственными видами.
До недавнего времени, из-за отсутствия адекватных методов, не проводилось систематического поиска генов, дифференциально экспрессирующихся у человека и шимпанзе. Появившиеся в последние годы методы крупномасштабного сравнительного анализа геномов и транскриптов позволяют подойти к решению этого вопроса. Целью данной работы является полногеномный поиск и идентификация генов, отличающихся по структуре и уровню экспрессии в мозге человека и шимпанзе. Настоящая работа состояла из двух частей: первая - поиск и идентификация транскриптов, экспрессия или структура которых различается в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе. Вторая часть работы была посвящена структурному анализу обнаруженных дифференциальных генов и функциональному анализу одного из них - гена транстиретина.
Объектом данного исследования является мозг, так как мозг - это та структура, где различия в спектрах и уровне транскрипции различных генов наиболее значимы.
Структурные различия в геноме митохондрий
Митохондрии - это органеллы, присутствующие практически во всех типах клеток эукариотических организмов. Основная функция митохондрий - обеспечение клеток энергией. Митохондрии являются единственными органеллами животной клетки, обладающими собственным автономным генетическим аппаратом. Генетический материал митохондрий передается только по материнской линии, что отличает цитоплазматическое наследование от менделевского наследования (аутосомного ядерного). Общая структурная организация митохондриального генома человека и высших приматов идентична [20]. В кольцевой молекуле ДНК длиной около 16,5 т.п.о. закодированы 12S и 16S рРНК, 22 тРНК и 13 генов, большая часть закодированных белков является элементами системы электрон-транспортной цепи митохондрий [21]. Уровень дивергенции митохондриальных геномов человека и шимпанзе составляет в среднем, 8,9 %, что значительно (приблизительно в 10 раз) превышает уровень дивергенции ядерных геномов этих видов [20, 22]. Уровень дивергенции кодирующих участков митохондриальных геномов человека и гориллы еще выше и составляет около 10,5% [23]. Дивергенция митохондриальных последовательностей шимпанзе и гориллы составляет около 10%, т.е. по этому параметру человек и шимпанзе эволюционно ближе друг к другу, чем каждый из них к горилле. Митохондриальная D-петля (участок размером около 1100 п.о., ответственный за репликацию митохондриального генома) - наиболее вариабельная область митохондриального генома и уровень ее дивергенции между человеком и шимпанзе составляет 13.9% [20]. Сравнительный анализ последовательностей D-петли митохондриального генома гориллы, шимпанзе и человека, показал, что уровень полиморфизма у гориллы выше, чем у шимпанзе, а у шимпанзе выше, чем у человека [23, 24]. Различия в уровнях полиморфизма митохондриальных последовательностей внутри видов человека и высших приматов могут отражать разнообразные факторы, такие как различия в структуре миграций мужских и женских особей этих видов, подразделения популяций, более поздний эффект основателя в человеческой популяции, различия в эффективных размерах популяций, межвидовое селективное давление [25].
По сравнению с другими видами приматов для генома человека характерно необычно низкое соотношение дивергенции последовательностей митохондриальных генов по сравнению с генами, закодированными в ядерном геноме (т.н. d/H соотношение) [24]. Причинами более высокой дивергенции митохондриальных геномов человека и высших приматов по сравнению с ядерными, могут быть особенности репликации геномной ДНК митохондрий, большая подверженность мутациям за счет свободных радикалов [26], а также особенности наследования и распределения в клетках генетического материала митохондрий [27]. 1.3. Цитогенетические различия В процессе эволюции происходит активная перестройка хромосомного набора посредством инверсий, транслокаций, робертсоновских перестроек (слияние хромосом или их разделение) и других типов хромосомных мутаций. Чем дальше друг от друга отстоят организмы, тем сильнее отличаются их хромосомные наборы. Общая структура хромосом человека и высших приматов является сходной [28]. Однако кариотип человека отличается от кариотипов высших приматов на одну пару хромосом - у человека 2п = 46, в то время как у других высших приматов - 2n = 48. Человеческая хромосома 2 образована в результате теломерного объединения двух предковых хромосом, представляющих современные хромосомы 12 и 13 у шимпанзе и хромосомы 13 и 14 у гориллы [29-31]. Образование хромосомы 2 человека является хорошей иллюстрацией явления, названного в литературе робертсоновским слиянием. Следует отметить, что хромосома 2 человека не является точной копией двух хромосом высших приматов. Основные различия наблюдаются в распределении повторяющихся элементов различных типов внутри хромосом. Описаны и другие различия в структуре хромосом человека и высших приматов. К ним относятся прицентромерные инверсии хромосом 1 и 18 у человека [32], инверсии в хромосомах гориллы, гомологичных хромосомам 5 и 17 человека [33], различное распределение по хромосомам у человека и высших приматов а-сателлитов [34, 35], прицентромерные инверсии у шимпанзе в хромосомах, гомологичных человеческим 4, 9 и 12, причем инверсии на хромосомах, гомологичных хромосоме 9 человека показаны для шимпанзе и гориллы [36]. В общей сложности 9 хромосом человека, 1, 4, 5, 9, 12, 15, 16, 17 и 18 несут прицентромерные инверсии, отличающие их от гомологичных хромосом шимпанзе. Имеются примеры протяженного (более 62 т.п.о.) межхромосомного обмена с участием альфа-сателлитной ДНК, с образованием паралогичных локусов на нескольких хромосомах человека и высших приматов, содержащих альфа-сателлитные и не альфа-сателлитные последовательности. Распространение этих последовательностей в геноме происходило как до дивергенции предковых линий человека и высших приматов, так и после нее [37]. Примат-специфическое семейство протяженных (более 10 т.п.о.) повторяющихся элементов chAB4 содержит около 50 последовательностей, локализованных в кластерах на 8 различных человеческих хромосомах. Сходная с человеком картина распределения этих элементов в геноме показана для шимпанзе. Однако у других представителей приматов присутствуют только единичные копии данного семейства. Обнаружение специфических для человека элементов семейства chAB4 с высокой степенью идентичности может свидетельствовать о продолжающемся распространении данных последовательностей в геноме человека после расхождения предковых линий человека и шимпанзе [38]. Описан случай X-Y транспозиции, специфичной для гоминид, с последующей инверсией в Yp посредством LINE-LINE рекомбинации [39]. Показано также, что 32-х нуклеотидные AT богатые субтерминальные сателлиты расположенные вблизи теломер у шимпанзе и гориллы отсутствуют у человека [40]. Другим примером человек-специфического изменения хромосомного материала является дупликация фрагмента размером более 15 т.п.о. хромосомы 6 человека, содержащего последовательности минисателлитов «lambda MS29» с образованием паралогичного локуса на хромосоме 16 [41]. Наблюдается достаточно четкая тенденция вовлеченности в хромосомные перестройки повторяющихся последовательностей, таких как а-сателлиты и минисателлиты.
Примеры амплификации последовательностей генов и псевдогенов будут рассмотрены в соответствующем разделе. Теоретическая модель, описывающая взаимосвязь хромосомных перестроек и видообразования, была предложена на основе анализа распределения значений дивергенции последовательностей по хромосомам человека и шимпанзе [42]. На основании критерия нейтральности Кимуры (соотношение Ka/Ks) [15], авторы анализируют распределение последовательностей, подверженных позитивной селекции, для которых Ka/Ks l по гомологичным хромосомам человека и шимпанзе. Для генов перестроенных хромосом человека и шимпанзе по сравнению с коллинеарными на основании статистически достоверных результатов было обнаружено более чем двукратное превышение значений Ka/Ks. При этом наблюдается тенденция возрастания значения Ka/Ks при приближении к участкам перестроек. На основании полученных данных авторы делают вывод, что в участках хромосом, содержащих хромосомные перестройки скорость молекулярной эволюции кодирующих последовательностей выше, чем в неперестроенных участках. Таким образом, в областях хромосомных перестроек аккумулируются молекулярные изменения, приводящие в конечном итоге к возникновению новых видов. Они рассматривают классическую модель взаимосвязи видообразования и хромосомных перестроек, заключающуюся в том, что возникающие хромосомные перестройки являются барьером для потока генов [43]. Авторы указывают на значительный ее недостаток, заключающийся в том, что значительные хромосомные перестройки имеют очень мало шансов быть закрепленными в популяции т.к. будут элиминироваться из-за частичной стерильности особей с такими перестройками. С другой стороны, незначительные хромосомные изменения, способные закрепиться в популяции, не могут стать существенным барьером для потока генов, необходимым для эффективной изоляции и последующего видообразования. Авторами предлагается другой механизм влияния хромосомных перестроек на механизмы видообразования. Согласно ему хромосомные перестройки являются сильным генетическим барьером, поскольку уменьшают рекомбинацию в гетерокариотипах
Сравнение свойств белков человека и шимпанзе
Сравнение свойств белков человека и высших приматов является более важной задачей, чем сравнение транскриптов, поскольку позволяет идентифицировать реально существующие фенотипические различия между видами, не зависящие от сложных механизмов регуляции генной экспрессии на посттранскрипционном и трансляционном уровнях. Однако проводить такие сравнения гораздо сложнее, чем сравнения профилей экспрессии генов или геномных последовательностей поскольку в настоящее время отсутствуют методы крупномасштабного сравнения протеомов, кроме того таким экспериментам присущи все сложности, характерные для сравнения транскриптомов. Поэтому в настоящее время известно очень мало работ, посвященных сравнению протеомов человека и высших приматов [1, 142]. Проведенный сравнительный анализ белков из плазмы крови человека и высших приматов [142] позволил подтвердить различия в количестве изоформ гаптоглобина между человеком и высшими приматами, обнаруженные ранее на уровне дупликации генов [114] (см. раздел 1.5.2.), а также подтвердить полученные в результате независимо проведенного сравнения транскрипции генов в мозжечке человека и экспрессии гена транстиретина в мозге человека и шимпанзе [143]. Транстиретин осуществляет связывание и транспорт тироидных гормонов (в частности, тироксина) и ретинола из плазмы крови в мозг [144, 145]. Тироидные гормоны являются важнейшими регуляторами дифференцировки и функционирования мозга [146-149]. Только для транстиретина показана экспрессия не только в печени, но и в мозге, а также присутствие в цереброспинальной жидкости [144, 145, 150, 151]. Многие мутации этого гена приводят к возникновению амилоидных болезней человека [152]. Также показано увеличение экспрессии TTR в мозге при формировании некоторых поведенческих реакций у мышей [153]. Показано, что концентрация транстиретина приблизительно в два раза выше в плазме крови и цереброспинальной жидкости шимпанзе по сравнению с человеком [142]. Интересно отметить, что уровень свободных тироидных гормонов в плазме крови шимпанзе выше, чем у человека [142]. Данный факт заслуживает пристального внимания, учитывая существенную роль тироидных гормонов в процессах развития и функционирования мозга и требует дальнейшего исследования. 1.7. Заключение Генетические изменения, происходящие в процессе видообразования, до настоящего времени остаются наименее исследованной областью молекулярной генетики.
По оценкам, проведенным при сравнении экспрессии генов различных видов и подвидов, при видообразовании происходят изменения в сотнях генов. Они могут касаться как структуры, так и функций генома. Из представленного обзора видно, что в настоящее время накоплены данные о различиях между геномами человека и шимпанзе, затрагивающие все уровни организации генетического материала, а также описаны некоторые различия на уровне протеомов. Однако представленные данные не позволяют нарисовать целостную законченную картину функционирования генетических факторов, обусловивших дивергенцию предковых линий, ведущих к современным видам человека и шимпанзе, поскольку, несмотря на значительный прогресс в этой области, достигнутый в последнее время, из-за значительного недостатка данных не удается выявить ключевые различия на молекулярном уровне, лежащие в основе столь значительных фенотипических различий между человеком и высшими приматами. Анализ различий структуры геномов человека и шимпанзе показывает, что большинство известных в настоящее время причин, вызвавших эти различия, можно отнести к двум основным группам: (1) последствия инсерций ретроэлементов (в подавляющем большинстве случаев инсерций Alu повторов), вызывающие рекомбинационные изменения структуры генов; (2) точечные мутации, приводящие к изменению силы промоторов и как следствие, различиям в уровне экспрессии отдельных генов, потере/появлению новых экзонов и интронов, появлению полиморфных по аминокислотной последовательности белков, в том числе более коротких/длинных изоформ существующих белков, а также, альтернативным вариантам посттрансляционной модификации белков. Следует отметить, что эти наблюдения носят предварительный и незаконченный характер, но появляющиеся новые систематические методы анализа геномов, транскриптомов и протеомов большого количества более простых модельных организмов позволяют обнаружить новые закономерности и законы видообразования, которые возможно будет проверять и подтверждать на таких сложных в работе объектах как человек и шимпанзе, и к уже описанным генетическим факторам, обусловливающим фенотипические различия между человеком и высшими приматами, прибавятся новые, еще не известные. В настоящее время для сравнения уровней экспрессии генов в двух или нескольких биологических образцах наиболее часто используются методы гибридизации микрочипов (microarray), дифференциального дисплея, SAGE (serial analysis of gene expression) и метод вычитающей гибридизации. Каждому из этих методов присущи свои достоинства и недостатки (для обзора см. [154]). Метод дифференциального дисплея позволяет одновременно анализировать сразу несколько сравниваемых образцов, оценивая различия по размеру и интенсивности отдельных кДНК после разделения на электрофорезе. Однако при межвидовом сравнении велико количество мРНК, различающихся по структуре, в том числе и имеющих разную длину, поэтому их сравнение весьма затруднено. Метод гибридизации с микрочипами позволяет проводить одновременное сравнение нескольких тысяч экспрессирующихся последовательностей в двух образцах [155]. Однако для использования этого метода при межвидовом сравнении существуют ограничения, связанные с неизвестными различиями в структуре генов сравниваемых организмов, поэтому использование микрочипов, сконструированных на основе последовательностей генов одного организма, для анализа уровня экспрессии другого организма может искажать получаемую картину различий (см. раздел 1.5. Обзора литературы). Использование метода SAGE для межвидового сравнения также ограничено поскольку затруднена идентификация секвенированных тэгов в случае, если не известна геномная последовательность организма для которого проводится сравнение. Метод вычитающей гибридизации позволяет обходить некоторые из проблем, возникающих при анализе микрочипов, однако сам имеет ряд недостатков, таких как достаточно высокий уровень фалыппозитивных фрагментов в вычтенных библиотеках, что требует проведения дополнительных этапов по идентификации истинно дифференциальных последовательностей, а также значительную трудоемкость.
Тем не менее, вычитающая гибридизация является одним из наиболее эффективных методов для межвидового сравнения, позволяя в отличие, например, от метода с использованием микрочипов, проводить сравнения гомологичных последовательностей, не идентичных между собой на 100%, и получать информацию не только об уровнях экспрессии уже известных последовательностей, но также находить дифференциально экспрессирующиеся последовательности с неизвестной ранее структурой. Эти особенности метода делают его предпочтительным в настоящем исследовании, позволяя идентифицировать дифференциальные кДНК мозга человека и шимпанзе. Для проведения сравнительно анализа уровней транскрипции генов в мозжечках человека и шимпанзе был выбран метод вычитающей гибридизации в модификации супрессивной вычитающей гибридизации, ранее разработанный в Лаборатории, и показавший высокую эффективность как при сравнении уровней экспрессии генов внутри одного организма, так и при сравнении геномных последовательностей разных видов бактерий [156]. 2.1. Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе 2.1.1. Выделение и характеристика суммарной РНК из мозжечков человека и шимпанзе. Для сравнения мРНК был использованы мозжечки человека и шимпанзе. Выбор мозжечков в качестве объекта исследования обоснован тем, что мозжечок является морфологически обособленным отделом головного мозга, и это позволяет целиком отделить его от остального мозга. При использовании в работе целого мозжечка достигается морфологическая и генетическая идентичность сравниваемых образцов. Кроме того, в литературе имеются данные о непропорциональном изменении размеров мозжечка среди других отделов мозга человека по сравнению с высшими приматами и особом характере экспрессии генов в мозжечке по сравнению с другими отделами головного мозга [133, 157, 158].
Структурно-функциональный анализ гена транстиретина
Транстиретин (TTR) (другое название - преальбумин) осуществляет связывание и транспорт тироидных гормонов (в частности, тироксина) и ретинола из плазмы крови в мозг [144, 145]. Только для транстиретина показана экспрессия не только в печени, но и в мозге, а также присутствие в цереброспинальной жидкости [144, 145, 150, 151]. Многие мутации этого гена приводят к возникновению амилоидных болезней человека [152]. Также показано увеличение экспрессии TTR в мозге при формировании некоторых поведенческих реакций у мышей [153]. Поскольку тироидные гормоны являются важнейшими регуляторами дифференцировки и функционирования мозга [146-149], то элементы системы регуляции транспорта и биосинтеза тироидных гормонов с высокой вероятностью могут быть объектом эволюционно значимых изменений. Транстиретин с этой точки зрения заслуживает особого внимания, поскольку из трех известных белков-переносчиков тироидных гормонов только он синтезируется в головном мозге [151]. Очевидно, что разница в концентрации мРНК TTR может иметь весьма существенное значение для развития и функционирования мозга. Именно поэтому дальнейшая работа была посвящена анализу различий в структуре и транскрипции этого гена у человека и шимпанзе и сравнительному анализу уровня транскрипции транстиретина в разных отделах мозга человека. 2.2.1. Сравнение последовательностей мРНК транстиретина человека и шимпанзе. Ген транстиретина человека локализован на хромосоме 18 в локусе ql2.1, имеет длину около 6,9 т.п.о. и содержит четыре экзона, которым соответствует мРНК длиной 615 н.о. (рис. 7). Функциональный белок состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых включает 127 а.о. [162]. Рисунок 7. Схема гена транстиретина человека и шимпанзе. Серыми прямоугольниками обозначены экзоны. Объемной стрелкой - промотор. Белыми прямоугольниками обозначены положения гипотетических энхансеров Enhf, и Enhcp. Горизонтальными отрезками со стрелками над ними - положение амплифицированных ПЦР фрагментов TEN 1EN3 и олигонуклеотидных праймеров. Стрелками над экзонами- праймеры для RT-PCR. В ходе работы была определена полная последовательность кДНК гена транстиретина шимпанзе. Сравнение последовательностей кДНК TTR человека и шимпанзе показало довольно высокий (-3%) уровень их дивергенции. Было обнаружено 11 нуклеотидных замен, 8 из которых расположены в кодирующей части гена транстиретина, и одна делеция (рис. 8). При этом три замены в кодирующей части гена приводят к заменам аминокислот в белке. Замены Arg34Lys и Asp39Glu являются синонимическими, и выявлены в белках некоторых других позвоночных животных [144]. Замена Asnl24Ile является несинонимичной, и не была описана ранее.
Соотношение несинонимичных нуклеотидных замен, приводящих к аминокислотным заменам, к синонимичным заменам в кодирующей части мРНК, Ka/Ks=0,6, что свидетельствует о действии стабилизирующего отбора на кодирующую последовательность этого гена [15] и, следовательно, его функциональной важности в эволюции. По результатам анализа данных из GenBank из 12 обнаруженных различий между последовательностями мРНК транстиретина у человека и шимпанзе только одно встречается как полиморфизм в человеческой популяции. Для подтверждения видоспецифичности обнаруженной замены Asnl24Ile была определена структура 4 экзона гена TTR еще двух индивидуумов шимпанзе. Обнаруженная нуклеотидная замена присутствует во всех исследованных нами последовательностях (рис. 8). Идентичная структура обнаружена также при анализе последовательности соответствующего участка генома шимпанзе, депонированной на сервере Genome Browser. Таким образом, обнаруженная нуклеотидная замена, приводящая к несинонимической замене в аминокислотной последовательности белка, является видоспецифичной для шимпанзе. Образцы суммарной РНК из мозжечка человека и шимпанзе той же, что и для вычитающей гибридизации, использовали как матрицы для синтеза первых цепей кДНК методом статистической затравки. При проведении синтеза первых цепей кДНК в качестве матрицы использовали одинаковое количество суммарной РНК. Эффективность синтеза первых цепей кДНК оценивали методом RT-PCR с праймерами b-actin For/Rev по содержанию кДНК (3-актина. Проведенный анализ показал, что полученные первые цепи кДНК человека и шимпанзе содержат последовательности гена р-актина в относительно равном количестве, что может свидетельствовать о правильном соответствии количества молекул кДНК в первых цепях количеству молекул мРНК в суммарных РНК. Подобный анализ является стандартным подходом для первичной оценки целостности и относительной количественной выравненности кДНК, используемых для анализа уровня транскрипции генов. Из литературных данных известно, что транстиретин экспрессируется у человека преимущественно в печени и сосудистом сплетении мозга (морфологическое образование стенок третьего и крыши четвертого желудочков мозга, непосредственно связанное с осуществлением функций гематоэнцефалического барьера) [144, 145, 150, 151, 163]. В ходе данной работы впервые было обнаружено, что ген TTR транскрибируется также и в мозжечке (рис. 6 Б). Поскольку данные о транскрипции TTR в различных отделах мозга человека и шимпанзе отсутствуют, интересно было изучить транскрипцию TTR в разных отделах мозга. Для этого необходимо проанализировать транскрипцию TTR в тканях отделов мозга, полученных от нескольких индивидуумов. К сожалению, для шимпанзе провести такой анализ практически невозможно из-за недоступности материала, поэтому все данные о транскрипции TTR в отделах мозга шимпанзе получены только для одного индивидуума. Было проведено сравнение уровня транскрипции транстиретина в нескольких отделах головного мозга взрослого человека, а именно: мозжечке, передней коре и сосудистом сплетении. Определение уровня транскрипции TTR в отделах мозга человека и шимпанзе проводили методом RT-PCR с олигонуклеотидными праймерами, комплементарными последовательностям первого и третьего экзонов гена TTR (рис. 7), на 1-х цепях кДНК, синтезированных на основе суммарных РНК, выделенных из соответствующих тканей. Результаты определения уровней транскрипции гена TTR в отделах мозга человека и шимпанзе представлены в таблице 4. Литературные данные об уровне транскрипции р-актина в разных отделах мозга человека и, тем более, шимпанзе отсутствуют.
Некоторый разброс данных по уровню транскрипции Р-актина в разных образцах мозжечков человека объясняется, скорее всего, эффективностью синтеза первых цепей кДНК. На основании полученных нами данных мы можем считать, что уровень транскрипции р-актина в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе практически одинаков (табл. 4). При этом во всех проанализированных образцах мозжечков он существенно ниже, чем во всех образцах передней коры. На образцах кДНК четырех индивидуумов было показано, что уровень транскрипции TTR в мозжечках человека такой же или еще более низкий, чем у индивидуума, кДНК которого была использована для вычитающей гибридизации (Человек #22). Несмотря на разницу в уровне транскрипции Р-актина между мозжечками шимпанзе и человека и существенный разброс значений уровня транскрипции Р-актина среди образцов кДНК человека мы считаем, что проводить сравнение уровней транскрипции в мозжечке человека и шимпанзе корректно, поскольку уровень транскрипции TTR во всех образцах кДНК мозжечка человека существенно ниже, чем уровень транскрипции TTR в образце кДНК шимпанзе, несмотря на относительно высокие значения транскрипции Р-актина в мозжечках человека. Поэтому исходя из полученных данных, можно сказать, что уровень экспрессии гена транстиретина в мозжечке шимпанзе 10 раз выше, чем в мозжечке человека (рис. 6 Б, табл. 4). На образцах кДНК трех индивидуумов было показано, что уровень транскрипции гена транстиретина в передней коре головного мозга человека, в 10 раз выше, чем в мозжечке. Сравнение уровней транскрипции транстиретина в передней коре головного мозга человека и шимпанзе показало, что у человека он в 10 раз выше, чем у шимпанзе. Уровень транскрипции транстиретина в сосудистом сплетении человека был, как и ожидалось, высоким (тысячи транскриптов на клетку). Важно отметить, что приблизительно в то же время, когда нами был охарактеризован ген транстиретина, как дифференциально транскрибирующийся в мозжечках человека и шимпанзе, в работе группы А. Варки [142] было показано, что содержание белка транстиретина в цереброспинальной жидкости у шимпанзе выше, чем у человека.
Попытки идентификации последовательностей гена TTR человека, связывающихся с белками ядерных экстрактов
Одним из экспериментальных подходов, позволяющем судить о вовлеченности последовательности в функциональные ДНК-белковые взаимодействия в клетке, в том числе и в регуляцию транскрипции гена, является способность регуляторных последовательностей ДНК связываться с белками ядерных экстрактов in vitro. Растворимая фракция ядерного экстракта содержит белки, в нормальных физиологических условиях находящиеся в ядре клетки, в том числе разнообразные регуляторные факторы, участвующие в регуляции транскрипции. Для идентификации участков фрагмента 5 -прилегающей области гена транстиретина человека (7 т.п.о.), взаимодействующих с транскрипционными факторами, был применен новый метод, разработанный в Лаборатории. Фрагменты TEN1EN3 (рис. 7) амплифицировали, используя в качестве матрицы геномную ДНК. Амплифицированные фрагменты размером около 2,5 т.п.о. гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Sau3A I, Sph I, Alu I, Hae III. Эти эндонуклеазы были выбраны поскольку при гидролизе ими фрагментов TEN1EN3 образуются фрагменты ДНК размером от 100 до 600 п.о. Такой размер является оптимальным для последующего связывания фрагментов ДНК с белками ядерных экстрактов. К рестриктным фрагментам были лигированы олигонуклеотидные адаптеры "Ad27" (табл. 7). Полученный лигат амплифицировали ПЦР с праймером "Ad27", радиоактивно метили и инкубировали с ядерными белковыми экстрактами из клеток линий HepG2 и Z310. Образовавшиеся комплексы и не связавшиеся фрагменты ДНК разделяли на двумерном ПААГ электрофорезе, вырезали участок геля, содержащий фрагменты ДНК, связавшиеся с белками (рис. 16). Фрагменты ДНК элюировали из геля, амплифицировали, полученные амплификаты клонировали, определяли первичную структуру вставок ДНК из случайно отобранных клонов и картировали полученные последовательности на физической карте генома человека (рис. 17). Было проанализировано 18 фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерного экстракта из клеточной линии Z310 (рис. 17 А) и 23 фрагмента ДНК, связывающихся с белками ядерного экстракта из клеточной линии HepG2 (рис. 17 Б). Значительное количество фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерных экстрактов обеих клеточных линий, было картировано внутри последовательностей повторяющихся элементов генома человека, расположенных в этой области, что, возможно, отражает участие повторяющихся элементов генома в регуляции транскрипции гена TTR.
Способность связывать белки показали также фрагменты, локализованные в областях потенциальных энхансеров гена TTR (Enhh и Enhcp), предсказанных на основании анализа нуклеотидных последовательностей (рис. 11). Участок, содержащий последовательность Enhqj показал связывание с белками обеих клеточных линий. Участок гипотетического энхансера, регулирующего экспрессию гена TTR в печени (Enhh) связывался только с белками экстракта линии HepG2, причем в районе Enhh было картировано 5 перекрывающихся между собой фрагментов (рис. 17 Б). Однако, существенных различий в распределении фрагментов ДНК, связывающихся с белками ядерных экстрактов из клеточных линий HepG2 и Z310, обнаружено не было. По-видимому, это объясняется повышенной способностью связывать белки ядерных экстрактов практически всей анализируемой последовательностью 5 -прилегающей области гена TTR человека, что может свидетельствовать о ее функциональной значимости в регуляции экспрессии TTR. Для подтверждения того, что идентифицированные нами последовательности действительно связываются с белками ядерных экстрактов, было выбрано несколько фрагментов ДНК из исследуемой области гена TTR (на рис. 17 они помечены ) и с этими фрагментами ДНК проведено торможение в геле с белками ядерных экстрактов клеточных линий HepG2 и Z310. В результате для практически всех выбранных фрагментов было подтверждено связывание. 2.2.7. Анализ связывания последовательностей гипотетических энхансеров гена TTR человека и шимпанзе с белками ядерных экстрактов клеточных линий HepG2 uZ310. При сравнении нуклеотидных последовательностей гипотетических энхансеров гена TTR человека и шимпанзе в этих участках были обнаружены структурные различия, которые могли бы повлиять на характер связывания этих последовательностей с регуляторными белками. Для того чтобы оценить, приводят ли структурные различия к различиям в характере связывания последовательностей с белками ядерных экстрактов, был использован метод торможения в геле. На матрицах геномной ДНК человека и шимпанзе с праймерами HEP For/Rev, HP Е For/Rev и TEN1 For/New Pro Rev (табл. 7) были амплифицированы фрагменты ДНК, соответствующие областям гипотетического энхансера, определяющего экспрессию гена транстиретина в печени (Enhh), гипотетического энхансера, определяющего экспрессию гена транстиретина в сосудистом сплетении (Enhcp), а также области промотора гена TTR. Полученные фрагменты ДНК радиоактивно метили, очищали, связывали с белками ядерных экстрактов клеточных линий Z310 и HepG2 и использовали для торможения в геле (рис. 18). Из представленного радиоавтографа видно, что паттерн связывания с белками для каждого из анализируемых фрагментов гена TTR различен для двух клеточных линий. По-видимому, это может свидетельствовать об участии разных белков в регуляции транскрипции гена TTR в клетках печени и мозга. Из представленного радиоавтографа видно, что паттерн связывания с белками для каждого из анализируемых фрагментов гена TTR различен для двух клеточных линий. По-видимому, это может свидетельствовать об участии разных белков в регуляции транскрипции гена TTR в клетках печени и мозга. Появление полос на радиоавтографе на дорожках (Чк и Шк), соответствующих фрагментам ДНК Enhh и Enhcp, не инкубировавшихся с ядерными экстрактами, может быть объяснено способностью этих фрагментов ДНК образовывать устойчивые вторичные структуры, которые не разрушились при проведении электрофореза, т.о. эти полосы могут быть рассмотрены как артефакт.
При инкубации фрагментов ДНК Enhh и Enhcp с ядерными экстрактами эти полосы на электрофорезе исчезали и ни одна из полос на дорожках электрофореза, соответствующих фрагментам связавшимся с белками, не соответствует по подвижности артефактным полосам. Возможность образования вторичных структур фрагментам ДНК Enhh и Enhcp была подтверждена анализом in silico. Различий в связывании с белками ядерных экстрактов клеточных линий HepG2 и Z310 между фрагментами ДНК человека и шимпанзе, соответствующими промоторной области гена (Про) и гипотетическому энхансеру сосудистого сплетения (Enhcp), не обнаружено. В случае фрагмента промоторной области такой результат является ожидаемым, поскольку промоторные последовательности гена TTR человека и шимпанзе различаются крайне незначительно. Сходный характер связывания фрагментов гипотетического Enhcp человека и шимпанзе, по-видимому, свидетельствует о том, что, обнаруженные структурные различия между этими последовательностями у человека и шимпанзе (в геноме шимпанзе по сравнению с человеком находятся одна единичная нуклеотидная замена и тройная нуклеотидная замена) не повлияли на характер связывания с белками ядерных экстрактов. Фрагмент Enhh ДНК шимпанзе (область гипотетического энхансера печени) при связывании с белками экстрактов обеих клеточных линий образует зону связывания, отсутствующую у гомологичного фрагмента ДНК человека. Возможно, это связано со структурными различиями между фрагментами Enhh человека и шимпанзе (были идентифицированы две замены в геноме шимпанзе по сравнению с геномом человека). Способность фрагментов EnhcP и Enhh связывать белки ядерных экстрактов клеточных линий свидетельствует об их вовлеченности в регуляцию экспрессии гена TTR, в том числе и в качестве возможных энхансеров.
