Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Экспрессия генов теплового шока: общие аспекты 8
1.2. Классификация и функции БТШ 10
1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ 19
1.4. Изменения в аппарате транскрипции и трансляции при ТШ 27
1.5. Функции БТШ в апоптозе 30
1.6. Структура и эволюция генов ТШ 32
1.7. БТШ в адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания 40
1.8. БТШ в медицине и экологии 47
2. Материалы и методы 51
2.1. Материалы 51
2.1.1 Линии и виды Drosophila 51
2.1.2. Штаммы Е. coli 51
2.1.3. Клоны hsp70 D. melanogaster 51
2.1.4. Ферменты рестрикции 51
2.1.5. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов транскрипции с элементами ТШ 52
2.1.7. Антитела 52
2.2. Методы 52
2.2.1. Условия содержания дрозофил 52
2.2.2. Условия теплового шока 52
2.2.3. Определение базальной и индуцибельной термоустойчивости 52
2.2.4. Включение метионина -3iS в белки 52
2.2.5. Подсчёт общего включения метионина- S в белки 53
2.2.6. Диск-электрофорез белков с ДЦС-Na (по Лэммли) 53
2.2.7. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу 54
2.2.8. Иммуноблоттинг 54
2.2.9. Иммунопреципитация 55
2.2.10. Очистка белков методом препаративного электрофореза 55
2.2.11. Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных карт 56
2.2.12. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ 56
2.2.13. Включение радиоактивной метки в ДНК 57
2.2.14. Выделение геномной ДНК 57
2.2.15. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 57
2.2.16. Электрофорез ДНК 58 2.2Д7. Перенос и гибридизация по Саузерну 58
2.2.18. Определение числа копий гена по Саузерну 58
2.2.19. Выделение тотальной РНК 59
2.2.20. Электрофорез РНК 59
2.2.21. Нозерн-гибридизация 60
2.2.22. Получение геномных фаговых библиотек 60
2.2.23. Скрининг фаговых геномных библиотек 60
2.2.24. Выделение ДНК бактериофага А, 61
2.2.25. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов 61
2.2.26. Выделение фрагментов ДНК 62
2.2.27. Клонирование фрагментов ДНК 62
2.2.28. Трансформация компетентных клеток 62
2.2.29. Выделение плазмидной ДНК 62
2.2.30. Секвенирование ДНК 63
3. Результаты 64
3.1. Определение базальной термоустойчивости у видов и линий группы virilis ,64
3.2. Определение индуцированной термоустойчивости у видов и линий группы virilis 66
3.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов D, virilis и D. lummei 61
3.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у D. virilis и D. lummei 69
3.5. Накопление БТШ70 при тепловом шоке 70
3.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ70 73
3.7. Исследование ДНК-связывающей активности HSF 73
3.8. Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза 74
3.9. Идентификация белков по молекулярным массам пептидов 77
3.10. Рестрикционный и Саузерн-анализ генов hsp70 D. virilis 80
3.11. Определение числа копий гена hsp70 у разных линий D, virilis и D. lummei 86
3.12. Определение структуры кластера генов hsp70 D. virilis и Д. lummei на основе рекомбинантных фагов X 90
3.13. Определение нуклеотидной последовательности генов hsp70 и прилежащих участков D, lummei и D. virilis 95
Обсуждение результатов 96
Выводы 106
Список литературы 107
- Классификация и функции БТШ
- Очистка белков методом препаративного электрофореза
- Получение геномных фаговых библиотек
- Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза
Введение к работе
Для современной биологии значительный интерес представляют молекулярные механизмы адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Среди прочих факторов окружающей среды наибольшее воздействие на организм оказывают изменения температуры. Изменения температурного режима являются также наиболее удобным экспериментальным воздействием для изучения механизмов адаптации. Повышение температуры на 5 - 15С выше физиологической (тепловой шок, ТШ) вызывает у всех изученных организмов (от Е. соН до человека) активацию группы генов, названных генами теплового шока. Белки теплового шока (сокращённо БТШ или HSP - heat shock proteins) при воздействии различных стрессовых факторов выполняют в клетке защитные функции, препятствуя денатурации и агрегации белков. Считается, что основную защитную функцию выполняет семейство белков массой 70 кДа (БТШ70 или HSP70). Работы, позволившие сделать такой вывод, проводились в основном на клеточном уровне. Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма остается спорным. С этой точки зрения представляет интерес эволюция генов, кодирующих белки семейства БТШ70, их структура и характер экспрессии у близкородственных организмов, резко различающихся по климатическим условиям среды обитания и характеризующихся разным уровнем естественной термальной адаптации. Удобной модельной системой для изучения структуры и эволюции генов ТШ являются различные виды Drosophila. Ранее гены ТШ были подробно исследованы у D. melanogaster. Для настоящей работы были выбраны несколько видов Drosophila, относящихся к филаде virilis, с мало изученной системой ответа на ТШ. Данные виды обитают в различных климатических поясах и, соответственно, должны отличаться по приспособляемости к воздействию высоких температур. Сравнивали пары видов, контрастных по уровню термальной адаптации: D. virilis — D. lummei и D, novamexicana - D. texana. Данные пары видов способны скрещиваться в лабораторных условиях с получением частично фертильного потомства. D. virilis является предковым видом всей группы видов virilis, у которых хорошо изучены кариотип и филогенетические отношения. Время дивергенции видов D. virilis - D. lummei составляет ~ 4 — 5 млн. лет. Это позволяет с высокой уверенностью утверждать, что изменения в структуре и характере экспрессии генов ТШ у данных
видов связаны с формированием термальной адаптации, а не обусловлены случайными изменениями в ходе эволюционной дивергенции. Группа viritis является одной из наиболее древних групп подрода Drosophila, что позволяет изучить возможные этапы эволюции генов hsp 70 путём изучения их структуры и сравнения со структурой генов других видов (D. mehnogaster). Целью данной работы являлось изучение структуры генов hsp70, характера их экспрессии и значимости в формировании естественной термальной адаптации у близкородственных организмов на примере видов филады virilis и некоторых других представителей рода Drosophila. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Сравнить термоустойчивость видов D. virilis, D. lummei, D. texana и D. novamexicana, а также реципрокных гибридов D. virilis x D. lummei.
Изучить динамику экспрессии генов hsp70, особенности её регуляции на разных уровнях реализации генетической информации и уровень накопления БТШ70 у видов группы virilis, контрастных по температурным условиям среды обитания.
Клонировать гены hsp70 D. virilis и D. lummei, определить их нуклеотидную последовательность, определить общую структуру кластера и число копий генов hsp70 D. virilis и D. lummei.
На основании сравнения структуры генов hsp70 и паттерна БТШ70 D. virilis и D. lummei с данными, полученными для других видов Dipiera, определить общее направление эволюции генов hsp70 в данной группе и их участие в термальной адаптации.
Классификация и функции БТШ
Методом электрофоретического разделения радиоактивно меченых белков было установлено, что в клетке синтезируется несколько фракций БТШ с различными молекулярными массами [5, б]. Выяснилось, что фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Таким образом общепринятой стала классификация, основанная на молекулярной массе БТШ. Основные группы представлены белками массой 10 - 30 (низкомолекулярные БТШ или shsp), 40 (БТШ40, называемые J-белками по своим структурно-функциональным особенностям), 70 (БТШ70), 82 - 90 (БТШ90) и 100 - 110 (БТШ100) кДа (для обзора см. работы [2, 5, 6]). Каждая группа может включать до нескольких десятков гомологов, обладающих сходными структурно-функциональными свойствами. У некоторых организмов может отсутствовать одна из групп (например, у Drosophila не обнаружены БТШ 100), и тогда их функции выполняют БТШ другой группы. Давно было известно, что БТШ определяют способность клеток адаптироваться к действию высокой температуры (до определенного предела), а также других повреждающих факторов. В экспериментах по действию повышенной температуры на клетки выяснилось, что предварительный умеренный ТШ позволяет клеткам в дальнейшем переносить более жёсткое тепловое воздействие, без предварительного шока являющееся летальным. Этот феномен получил название индуцируемой термоустойчивости [20].
Ряд экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что индуцируемая термотолерантность развивается за счёт накопления БТШ (для обзора см. [5]). Искусственное повышение уровня синтеза БТШ70 за счёт конститутивной экспрессии генов hsp70 в составе трансфецированных в клетки плазмид также сопровождается формированием терморезистентного фенотипа [2]. Напротив, ингибирование синтеза БТШ или направленный мутагенез отдельных генов семейства БТШ70 приводят к снижению термоустойчивости клеток [21]. Мутантные особи с нарушением ответа на ТШ (ts-летали) погибают при температуре, которая для нормальных особей не является смертельной [6, 22]. При подавлении синтеза белков во время ТШ не происходит восстановления нормальной активности генов [4]. Механизм защитного действия БТШ основан на их способности препятствовать денатурации и агрегации белков [23,24]. При тепловом шоке и многих других видах стресса клеточные белки подвергаются денатурации. При этом гидрофобные области белковых молекул, в норме обращенные внутрь их структуры, экспонируются в гидрофильную среду цитоплазмы. Затем белки «слипаются» друг с другом гидрофобными участками, образуя нерастворимые агрегаты. Это приводит к нарушению функций большинства клеточных систем и гибели клетки. Было показано, что БТШ70 неспецифически взаимодействуют с гидрофобными участками денатурированных белков, способствуя восстановлению их нормальной вторичной и третичной структуры. Диссоциация БТШ70 и белкового субстрата требует гидролиза АТФ, который осуществляется с участием БТШ40. Продукт реакции - АДФ - вновь обменивается на АТФ с участием белков-кофакторов (см. ниже).
Помимо БТШ70 в защите белков от денатурации и восстановлении их нативной структуры участвуют также низкомолекулярные БТШ, БТШбОиБТШЮО. БТШ, в особенности БТШ70, способны не только предохранять от агрегации денатурированные белки, но и связываться с вновь синтезированными белками, обеспечивая правильное сворачивание полипептидной цепи, а также формирование четвертичных структур и транспорт белков а различные органеллы клетки. Белки, способные к неспецифическому взаимодействию с широким спектром клеточных полипептидов и поддержанию их конформации, получили общее название -шапероны (от французского chaperone — «спутница, компаньонка»). Такая функция присуща не всем БТШ. В их число входят белки, сами по себе не влияющие на конформацию других полипептидов, но модулирующие функцию шаперонов и тоже индуцируемые стрессом. К ним относятся, например, БТШ10 и БТШ40. Ниже приведены данные по структуре и функциям наиболее важных БТШ. В группу низкомолекулярных БТШ относят а-А- и а-В-кристаллины, и БТШ массой 17-27 кДа, имеющие с ними 40% гомологию. Общим структурным мотивом для всего этого семейства является а-кристаллиновый домен длиной 80 -100 аминокислотных остатков, расположенный в
С-концевой области. Низкомолекулярные БТШ способны образовывать в цитоплазме олигомеры, а также крупные гранулы массой 150 - 800 кДа за счет взаимодействия fJ-складчатых структур а-кристаллинового домена. Подобные комплексы диссоциируют при повышении температуры, и малые БТШ в виде гомодимеров взаимодействуют с денатурированными белками, образуя с ними массивные комплексы. Сами по себе малые БТШ не способны гидролизовать АТФ, и, по-видимому, участвуют в ренатурации повреждённых белков, предохраняя их от агрегации и передавая БТШ70 [25,26]. БТШ40 относится к группе так называемых J-белков по их гомологии с белком DnaJ Е. coli [27]. В настоящее время у человека найдено несколько десятков представителей семейства J-белков [28]. Их объединяет наличие так называемого J домена, необходимого для их функционирования. БТШ40 стимулирует АТФ-азную активность БТШ70 посредством взаимодействия J-домена с АТФ-азным доменом БТШ70 [29]. БТШ70 является наиболее хорошо изученным из всех стрессовых белков. По данным рентгеноструктурного анализа, молекула БТШ70 состоит из N-концевого консервативного домена длиной около 450 а. о. и С-концевого вариабельного домена длиной около 200 а. о. N-концевой домен представляет собой АТФ-азу, а С-концевой - субстрат-связывающий участок [30]. Он представлен двумя а-спиралями, узнающими гидрофобные области денатурированных белков. Эта структура напоминает пептидсвязывающий участок МНС II и связывает белки-субстраты сходным образом [ЗІ]. Высокое сродство к АТФ позволяет легко очищать БТШ70 хроматографией на АТФ-сефарозе, что широко используется в лабораторной практике [32]. Взаимодействие шаперонов семейства БТШ70 с субстратом впервые было подробно изучено на бактериальном гомологе DnaK. На первой стадии DnaK взаимодействует с белком-субстратом, находясь в АТФ-связанной форме. На второй стадии с DnaK связывается белок DnaJ, стимулирующий гидролиз АТФ и стабилизирующий комплекс DnaK-субстрат. Сродство DnaK к продукту реакции АДФ - выше, чем к АТФ, поэтому для диссоциации АДФ требуется фактор обмена нуклеотидов. У Е. coli им является белок, называемый GrpE. После диссоциации комплекса DnaK-АДФ происходит высвобождение субстрата и присоединение новой молекулы АТФ. Как правило, фолдинг белков с участием DnaK. и БТШ70 требует нескольких циклов присоединения - диссоциации с гидролизом АТФ. Некоторые белки приобретают с участием DnaK или БТШ70 только промежуточную конформацию и для приобретения конечной структуры должны провзаимодействовать с БТШ60 (см. ниже) [35]. Цикл реакций БТШ70 в эукариотических клетках имеет некоторые специфические особенности. Гидролиз АТФ также требует участия J-белка, а диссоциация АДФ стимулируется белками Hip (HSP70-interacting protein) и рбО или Hop (HSC70/HSP90-organising protein).
Связывание БТШ70 с АТФ и субстратом стимулируется белком Нар (HSP70- and HSC70-associating protein) [36]. Как уже говорилось выше, установлено, что помимо «классических» генов, кодирующих БТШ70, которые при нормальных условиях либо не экспрессируются вообще (у Drosophila), либо экспрессируются с низкой интенсивностью (у млекопитающих), в геномах эукариот существуют гены, имеющие с ними 70 - 75% гомологию, конститутивно экспрессирующиеся также и при нормальных условиях. Эти гены получили название родственных или когнатных генов (БТІШОк или HSC70 в английской аббревиатуре) [3]. Уровень экспрессии некоторых из них увеличивается при ТШ (например, гены hsp-І и hsp-б С. elegans), другие экспрессируются в определённых тканях на разных стадиях развития (ген hsc70t Mus musculus) [37]. В настоящее время в геноме человека локализовано не менее 12 генов семейства БТШ70 [28]. В геноме D. melanogaster имеются 5 — 6 копий гена (в зависимости от линии), кодирующего стресс-индуцибельный БТШ70, один ген стресс-индуцибельного белка БТШ68, и 7 когнатных генов, чьи продукты выполняют различные функции. Семейство генов БТШ70 дрожжей Saccharomyces cerevisiae включает не менее 12 гомологов, которые могут экспрессироваться конститутивно, или их экспрессия может индуцироваться стрессом. Они делятся на группыSsa (4 гомологаSsal -4), Ssb (Ssb] и 2),SscJ, Ssdl,Ssql,EcmlO,Kar2 и Cerl. Продукты генов групп Ssa7 Ssb и Ssd локализуются в цитозоле, SscJ, SsqJ и ЕстІО — в митохондриях, Каг2 и Cerl - в эндоплазматическом ретикулуме [38, 39]. У
Очистка белков методом препаративного электрофореза
Осуществляли на антителах 7FB и 7.10.3. Антитела сорбировали на сефарозу со связанным А-белком в буфере следующего состава: 0Д% NP-40, ЮмМ HEPES рН 7,4, 0.14М NaCl, 5мМ ЭДТА. После сорбции антител сефарозу дважды промывали буфером того же состава. Навеску из 10 мг мух, подвергнутых ТШ (38,5С в течение получаса с последующим восстановительным периодом 2,5 ч), лизировали в 100 мкл буфера состава 0,5% NP-40, ЮмМ HEPES рН 7,4, 0,14М NaCl, 5мМ ЭДТА на льду в течение получаса, периодически перемешивая. Лизат центрифугировали при 14000 g 10 минут, супернатант наносили на сефарозу с адсорбированными антителами и инкубировали при + 4С в течение 2 часов. Отмывали сефарозу один раз в течение 15 минут буфером 0,5% NP-40, ЮмМ HEPES рН 7,4, 0,14М NaCl, 5мМ ЭДТА и два раза по 15 минут буфером 0,2% NP-40, ЮмМ HEPES рН 7,4, 0Д4М NaCl, 5мМ ЭДТА. После отмывки сефарозу осаждали центрифугированием при 500 g в течение 1 минуты, отбрасывали супернатант, и связавшиеся с антителами белки элюировали буфером по О Фарреллу при + 4С в течение 15 минут при интенсивном перемешивании для двумерного электрофореза. Белки, элюированные с сефарозы после иммунопреципитации, разделяли методом двумерного электрофореза по О Фарреллу [219]. Гель окрашивали Кумасси G-250, фотографировали для документации и вырезали область, содержащую требуемый для анализа белок. Кусочек геля помещали в пробирку объёмом 0,5 мл, измельчали и отмывали от красителя раствором 40% метанола и 10% уксусной кислоты. Затем гель последовательно обрабатывали 50% ацетонитрилом с добавлением 0,1 М бикарбоната аммония и 100% ацетонитрилом, после чего высушивали в аппарате SpeedVac. В пробирку с гелем, обработанным, как описано выше, добавляли 50 мкл раствора трипсина по инструкции Ciphergen Biosystems.
Смесь инкубировали в термостате при 37С в течение 16 часов. Параллельно такой же обработке подвергали контрольный гель, не содержащий белка. Построение пептидных карт и микросиквенирование пептидов были выполнены компанией Ciphergen Biosystems (wvyw.ciphergen.com). Идентификацию белка проводили по базам данных: http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe http://www.matrixscience. com/cgi/ind ex. pl?page=. ./home.html http://www.expasv.ch/tools/peptident.hlml http://www.narrador.embl-heidelberg.de/CroupPages/PageLink/peptidesearchpage.htmt http://prospector.ucsf.edU/ucsfhtml4.0/msfit.htm Навеску из мух замораживали в жидком азоте, растирали и ресуспендировали в буфере следующего состава: 20мМ HEPES, рН 7,9, 25% глицерин, 0,04М NaCl, 1,5мМ MgCI2 0,2мМ ЭДТА, 0,5мМ PMSF, 0,5мМ ДТТ, после чего центрифугировали при 16 000 g в течение 30 мин при +4С. Пробу ДНК (пара частично комплементарных олигонуклеотидов с выступающими 5 -концами, содержащих консенсусную последовательность HSE, анилировали в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,2, с добавлением 0,1мМ NaCl. Однонитевые концы достраивались с использованием фрагмента Клёнова и а-[32Р]-дАТФ, Экстракт, содержащий 50 мкг белка, инкубировали с 0,5 нг меченого HSE при 20С в течение 15 мин.
Свободный фрагмент и комплексы HSE-HSF разделяли электрофорезом в 5% полиакриламидном геле на 1 TBS при напряжении 150 - 200 В при +4С. После электрофореза гели высушивали и экспонировали на плёнку Kodak. Использовали метод статистической гексануклеотидной затравки с большим фрагментом ДНК-полимеразы I Е. coli (фрагмента Кленова). Для проведения реакции использовали готовый набор реактивов фирмы «Amersham». На пробу брали 100 нг фрагмента ДНК и 1 — 2 мкг смеси гексануклеотидов из ДНК тимуса телёнка в 10-15 мкл воды. Фрагмент денатурировали при 100С в течение 5 минут, после чего добавляли по 1 - 2нМ «холодных» дНТФ, 10 - 15пМ дАТФ с 32Р в а-положении (производства ИМБ РАН), реакционный буфер и 4 единицы активности фрагмента Клёнова. Реакцию проводили в течение 1 часа при 37С. От невключившейся метки зонд очищали гель-фильтрацией на колонках с сефадексом G-50 производства «Amersham» по инструкции производителя. Навеску из мух (— 100 мг) растирали в жидком азоте до образования однородной массы, переносили в пробирку с 2 мл буфера НВ (0ДМ Трис-HCl рН 7,5 - 8,0, ЮмМ ЭДТА, 0,3 5М NaCl, 2% ДДС-Na, 7М мочевина) и мягко перемешивали до появления вязкости. Затем проводили экстракцию последовательно смесью фенол/хлороформ в соотношении 5/1, смесью фенол/хлороформ в соотношении 1/1 и хлороформом, отбирая водную фазу. После экстракции хлороформом ДНК осаждали изопропиловым спиртом. Осадок извлекали из пробирки стерильной стеклянной палочкой или носиком микропипетки, промывали 70% этанолом и растворяли в 100 мкл воды. Концентрацию ДНК проверяли путём электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием, визуализируя облучением в УФ и сравнивая с пробой ДНК бактериофага X известной концентрации, Реакцию проводили в условиях, рекомендованных фирмой-производителем рестриктаз, в течение 2-3 часов, с добавлением буфера, оптимизированного для данной рестриктазы. В реакцию брали 1-5 мкг ДНК,
Получение геномных фаговых библиотек
После электрофореза гель отмывали от формальдегида в 300 мл стерильной воды в течение 30 минут, уравновешивали в 10х SSC, после чего переносили на мембрану Hybond N4 в стандартных условиях. После переноса РНК фиксировали на геле ультрафиолетом. Гибридизацию проводили при 42 С 12 — 16 часов в буфере состава: 7% ДЦС-Na, 50% формамид, 5х SSPE, 5х раствор Денхардта, 5% декстрансульфат. Отмывка проводилась два раза по 20 минут при 55С в Iх SSC и 0,1% ДЦС-Na, и два раза по 20 минут при 68С в 0,1х SSC и 0,1% ДЦС-Na. После отмывки фильтр подсушивали, заворачивали в Saran Wrap и экспонировали при -70С на пленку Kodak. В качестве зонда использовали фрагмент Clal/Sall гена hsp70 D. melanogaster меченый а32Р-дАТФ. Клонотеки были получены путём частичного гидролиза геномной ДНК из линий D. virilis 160 и D. lummei 200 рестриктазой Sau3A и последующим лигированием фрагментов с плечами вектора XDASH по сайтам ВатШ с использованием набора Stratagene по рекомендации производителя. Фаг выращивали на клетках Е. coli (штамм MRA"). Клетки растили на среде LB с добавлением 10 мМ MgS04. Культуру в логарифмической фазе (с оптической плотностю 0,5 - 0,6 ОЕ) концентрировали в 5 раз в среде SM (0,05М Трис-HCl рН 7,5, 0,12М NaCl, 0,08М MgS04, 0,01% желатина). Отбирали аликвоты по 50 мкл и смешивали с суспензией фаговых частиц (104 - 105 БОЕ бактериофага). Адсорбцию фага на клетках проводили в течение 15 минут при 37С, после чего суспензию инфицированных бактерий высевали на чашки
Петри, как описано в [220]. Чашки инкубировали при 37С в течение ночи. Для отбора рекомбинантных фагов с чашек снимали реплики на фильтры Hybond N , Обработку фильтров, предгибридизацию, гибридизацию и отмывку проводили, как описано в пункте «Перенос и гибридизация по Саузерну». Для гибридизации использовали зонды, указанные в разделе «Материалы». Фильтры экспонировали на рентгеновскую плёнку. Радиоавтограф сопоставляли с фаговыми бляшками на чашках Петри. Фаговые бляшки переносили уколом в пробирку с 0,5 мл среды SM. Для выделения индивидуальных фаговых клонов скрининг повторяли 3 раза, уменьшая титр фага. Л 7 Использовали методику, описанную в [220]. 10 — 10 БОЕ/мл бактериофага вносили в культуру Е. соН (штамм MRA") с оптической плотностью 0,3 ОЕ при длине волны 600 нм в среде LB с добавлением ЮмМ сульфата магния. Культуру выращивали при 37С и интенсивной аэрации до полного лизиса бактериальных клеток. После достижения лизиса добавляли хлороформ до 1%, инкубировали 15 минут при 37С и центрифугировали при + 4С при 12000g 10 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли ДНКазу до концентрации 1 мкг/мл и инкубировали 1 час при 37С. Затем добавляли NaCl до концентрации 1М, инкубировали 1 час при + 4С и центрифугировали при 12000g 10 минут.
Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли полиэтиленгликоль (М = 6000) до концентрации 10% (масса/объём) и инкубировали на льду в течение 1 часа, после чего центрифугировали при + 4СС и 12000g 15 минут. Супернатант сливали, осадок растворяли в среде SM. После растворения осадка добавляли 1 объём хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 1600g в течение 10 минут. Отбирали супернатант, добавляли ДДС-Na до концентрации 0,5%, ЭДТА до концентрации 20мМ и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и инкубировали при 65С в течение 1 часа. Затем проводили последовательную экстракцию фенолом, смесью фенол/хлороформ и хлороформом. ДНК осаждали изопропшювым спиртом, промывали 70% этанолом и растворяли в стерильной деионизованной воде. Использовали рестриктазы, указанные в разделе «Материалы». Рестриктные карты рекомбииантных клонов фага А, строили на основе анализа длин рестрикционных фрагментов, получаемых обработкой попарными комбинациями рестриктаз и каждым ферментом в отдельности. Фрагменты рестрикции разделяли электрофорезом в агарозпом геле. Длшгу фрагментов определяли по их электрофоретической подвижности, сравнивая с подвижностью фрагментов маркера. Окончательный вариант рестриктной карты получали после гибридизации с зондами к различным участкам генов hsp70 и межгенных последовательностей и получения результатов секвенирования клонированных фрагментов. Фрагменты ДНК разделяли в агарозном геле, вырезали участок геля, содержащий нужный фрагмент (длину фрагмента определяли по маркеру ДНК), под ультрафиолетовым светом (360 нм). Выделение фрагмента производили с использованием набора реактивов производства фирмы «Qiagen» по инструкции производителя.
В качестве вектора использовалась фагемида pBIuescript SK". Вектор обрабатывали соответствующими рестриктазами, после чего обрабатывали щелочной фосфатазой для дефосфорилирования 5 -концов, чтобы предотвратить внутримолекулярное лигирование вектора. ДНК рекомбинантных фагов также расщепляли соответствующими рестриктазами, после чего осаждали добавлением 3 объёмов 96% этанола и 0,5 М ацетата натрия и растворяли в минимальном объёме деионизованной воды. В ряде случаев проводили лигирование смеси фрагментов рестрикции, в ряде случаев фрагмент для лигирования выделяли из агарозного геля после электрофореза, как описано выше. Лигирование по совместимым липким концам проводили в буфере, рекомендованном фирмой-производителем лигазы. В реакцию брали 0,5 - 1 мкг фрагмента-вставки и ОД - 0,2 мкг вектора. Реакцию проводили в условиях, рекомендованных фирмой-производителем. Для трансформации использовали аликвоты из лигазной смеси. Трансформацию проводили по методике [220].
Анализ паттерна БТШ70 и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза
Белки разделяли методом двумерного электрофореза и детектировали методом окрашивания азотнокислым серебром, по включению радиоактивного метионина, либо с помощью иммуноблоттинга. Паттерн БТШ70 OR описан в работе [181]. Рис, 11. Иммуноблоттинг белков, выделенных после ТШ 37,5СС через 3 часа восстановления. 1а - D. virilis 9, 2а - D. lummei 200, За - $ D. virilis 9 х S D. lummei 200, 4а - D. mojavensis, гибридизация с антителами 7.10.3; 16 D. virilis 9, 26 - D. lummei 200, 36 - 5 Z). v/n7is 9 x $ D. lummei 200, 46 - D. mojavensis, гибридизация с антителами 7FB. Стрелкой указана группа белков, реагирующих с как с антителами 7.10.3, так и с антителами 7FB. Паттерн линии Т отличается от паттерна OR — обнаруживается дополнительный белок с изоэлектрической точкой, равной БТШ70, и с меньшей молекулярной массой. Данный белок не реагирует с антителами 7FB и, возможно, является аналогом БТШ68 OR. У D. mojavensis в группе БТШ70 обнаруживаются три белка с разными изоэлектрическими точками и одинаковой молекулярной массой. Один из них также не реагирует с антителами 7FB, что опять же позволяет предположить о его гомологии с БТП168 (рис. 11, 12). Характер синтеза БТШ у видов группы virilis изучался Sinibaldi и Storti [221]. Нами был проведён анализ с более высоким разрешением зоны 70 кДа в 8% полиакриламидном геле и изучен характер экспрессии БТШ при различных температурах (рис. 12 - 16).
Паттерн БТШ70 разных линий и видов внутри группы virilis имеет сходные характеристики, сильно отличаясь, однако, от паттерна D. melanogaster и D. mojavensis. У всех исследованных видов и линий группы virilis индуцибельные БТШ70 делятся на две группы, отличающиеся по молекулярной массе и изоэлектрической точке, причём каждая группа может включать несколько изоформ. Молекулярные массы белков, входящих в каждую группу, были ориентировочно определены методом электрофореза по маркеру как 70 и 72 кДа. Дополнительные изоформы БТШ70 обнаруживаются у линий 9, 160 и 101 D. virilis по сравнению с 200-й линией D. lummei, а также у D. novamexicana (линия 424) по сравнению с D. texana (линия 423), что может свидетельствовать в пользу гипотезы продолжительностью 30 мин. A:\-D. lummei 200, 2-Я virilis 9, 25С; 3-Я. lummei 200, 4 - Я. virilis 9, 40C, 1 час восстановления; 5 - Я lummei 200, 6 - Я. virilis 9,1 -D. virilis 160, 8 - D. virilis 1433, 37,5C, 1 час восстановления; 9-D. lummei 200, 10 -D. virilis 9, 11 - D. virilis 160, 12 - D. virilis 1433,40C, 3 часа восстановления; 13 - D. lummei 200, 14 - Я virilis 9, 15 - Я virilis 160, 16 - Я virilis 1433, 40,5C, 3 часа восстановления. В: 1-Я virilis 9, 2-D. lummei 200, 3-Я lummei 202, 4 - Я lummei 1102, 5 - $ Я virilis 9 x $ D. lummei 200,41 С.
Указаны молекулярные массы в кДа. об увеличении числа копий генов hsp70 у этих линий. Разные линии D. lummei и D. virilis также отличаются друг от друга по числу изоформ в каждой группе БТШ70. Линии 1433 D. virilis и 423 D. texana имеют в каждой группе по одной изоформе (рис. 15,; 16). В целом можно сказать, что практически каждая исследованная линия D. virilis и D. lummei имеет индивидуальный паттерн БТШ70 (см. рис. 14 — 16). У гибридов D. virilis (линия 9) и D. lummei (линия 200) видны все изоформы родительских линий, причём одна из них является общей, а две другие — уникальными для каждой родительской линии. Интересно, что у всех видов группы virilis только одна группа БТШ70 с молекулярной массой 70 кДа узнаётся антителами 7FB. Белки с молекулярной массой 72 кДа реагируют только с антителами 7.10,3, то есть их серологические свойства напоминают свойства БТШ68 D. melanogaster. Паттерн конститутивных БТШ70, реагирующих с антителами 7.10.3, не отличается у всех рассматриваемых видов, что, очевидно, говорит об их более высокой эволюционной консервативности. Схемы паттерна БТШ70 исследованных видов и линий приведены нарис. 16. Кроме БТШ70, была изучена также экспрессия других семейств БТШ у видов группы virilis. У всех термоадаптированных разновидностей наблюдается интенсивное включение метионина-355 в данные группы БТШ. Это было показано на примере линий 9,101, 160,1433, Т53 и Т61 D. virilis, линии 424 D. novamexicana и D. mojavensis (см. рис. 14 и 15). У D. lummei (линии 200, 202, 207, 1102 и 1109), D. texana (линия 423) и D. melanogaster (линия OR) включение метки в низкомолекулярные БТШ и БТШ40 происходит со значительно более низкой интенсивностью. При субкритических температурах у них снижается уровень включения метионина в БТШ70. Увеличение уровня экспрессии БТШ40 и низкомолекулярных БТШ у видов, обитающих в жарком климате и подверженных действию более высоких температур, может играть значительную роль в формировании термальной адаптации (см. ниже). Двумерный электрофорез и Вестерн-блоттинг с антителами 7FB и 7.10.3 показывают наличие у всех изученных видов филады virilis белка, обладающего теми же свойствами, что и БТШ68 D, melanogaster. Этот белок, однако отличается от БТШ68 по молекулярной массе (72 кДа вместо 68 кДа у D. melanogaster) и обладает более кислым значением изоэлектрической точки (5,75 вместо 6,3 у D. melanogaster). Для того, чтобы классифицировать две группы БТШ70 видов филады virilis, был предпринят пептидный анализ белков, относящихся к обеим группам.
Для анализа использовали БТШ70 1433-й линии D. virilis, так как у этой линии обе группы представлены уникальными белками и не содержат дополнительных изоформ, как в случае большинства других линий. Белки очищали иммунопреципитацией на антителах 7.10.3, разделяли на двумерном электрофорезе и обрабатывали модифицированным трипсином. Определение молекулярных масс пептидов было выполнено компанией Ciphergen Biosystems. Белки идентифицировали, сравнивая набор пептидов, полученный обработкой трипсином, с соответствующими данными по известным белкам (см. материалы и методы). Подтвердилось, что белок с массой 70 кДа и изоэлектрической точкой 6,1 у видов филады virilis является гомологом БТШ70 D. melanogaster, а белок с массой 72 кДа и изоэлектрической точкой 5,75 гомологичен БТШ68 (см. рис. 12 и 16). Неизвестно, чем объясняются отличия по молекулярной массе и изоэлектрической точке БТШ68 D. melanogaster и его гомологов у видов филады virilis - изменением аминокислотной последовательности белка или посттрансляционными модификациями. Для ответа на данный вопрос требуется клонировать гены, кодирующие гомолог БТШ68 D. virilis.
