Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Экология вируса Карши и его географическое распространение 11
1.2. Биологические свойства вируса Карши 12
1.2.1. Патогенные свойства вируса 13
1.2.2. Роль вируса Карши в патологии человека 14
1.3. Иммунохимические характеристики вируса 14
1.4. Таксономическое положение вируса Карши 15
1.5. Молекулярно-биологические характеристики флавивирусов 19
1.5.1. Структура генома флавивирусов 21
1.5.2. Вирусные белки 22
1.5.3. Репродуктивный цикл флавивирусов 30
1.6. Филогенетические взаимоотношения представителей рода Flavivirus 32
1.7. Проблемы классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита 41
2. Материалы и методы 46
2.1. Исследуемые штаммы 46
2.2. Использованные олигонуклеотидные праймеры 47
2.3. Выделение вирусной РНК 50
2.4. Реакция обратной транскрипции 51
2.5. Проведение полимеразной цепной реакции 52
2.6. Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК 52
2.7. Электрофорез ДНК 54
2.8. Подготовка ДНК для секвенирования 54
2.9. Секвенирование ДНК 55
2.10. Построение алайментов и филогенетический анализ 55
2.11. Клонирование ПЦР-фрагментов 60
3. Результаты исследований и их обсуждение 62
3.1. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 Uz) 62
3.2. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома штамма LEIV-7192 Tur 65
3.3. Анализ структуры полноразмерного генома вируса Карши 68
3.3.1. Особенности организации белков вируса Карши 70
3.3.2. 5'-нетранслируемая область генома 78
3.4. Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других представителей рода Flavivirus 80
3.5. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР для детекции вируса Карши 91
Заключение 98
- Биологические свойства вируса Карши
- Филогенетические взаимоотношения представителей рода Flavivirus
- Электрофорез ДНК
- Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других представителей рода Flavivirus
Введение к работе
Около ста лет назад Вальтер Рид описал патогенный для человека вирус жёлтой лихорадки, ставший типовым представителем рода Flavivirus семейства Flaviviridae. С тех пор были идентифицированы более 80 представителей этого рода, большинство из которых переносят комары или клещи. Представители этой группы вызывают опасные заболевания для человека и животных. Вирус Денге {Denge virus), вирус Западного Нила (WNV), вирус японского (JEV) и клещевого энцефалитов (TBEV) являются возбудителями тяжёлых заболеваний человека, нередко заканчивающихся летальным исходом [18].
Вопросы дифференциации и классификации вирусов рода Flavivirus и входящих в него вирусов комплекса клещевого энцефалита (ККЭ) являются важнейшими и имеют не только теоретический интерес, но и практическое значение, так как с ними связаны возможности усовершенствования диагностики и профилактики заболеваний, вызываемых этими вирусами. До настоящего времени эволюционные и генетические взаимоотношения между флавивирусами ясны не в полной мере, вследствие чего их таксономическое положение и классификация нуждаются в дальнейшем осмыслении и уточнении.
Актуальность проблемы
Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов рода Flavivirus, объединённых в антигенный комплекс клещевого энцефалита. За последние 30-40 лет в России и ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанный с вирусами данной антигенной группы. Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванными этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо
5 исчерпывающе представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.
Современная классификация вирусов, входящих в антигенный комплекс клещевого энцефалита, далека от совершенной. По-прежнему ведутся дискуссии о величине различий в таксономических рангах внутри данной группы. Изучение иммунохимических свойств вирусных антигенов с помощью современных методов позволило более точно определить таксономическое положение вирусов в пределах семейства и рода. Для детализации этого положения необходимо учитывать иммунологические и генетические свойства вируса, однако молекулярно-генетическое изучение генома вируса даёт наиболее адекватное представление.
В результате комплексного обследования, которое провели сотрудники Института вирусологии имени Д.И. Ивановского во главе с академиком Д.К. Львовым, в конце прошлого столетия на территории СССР была определена локализация природных очагов различных арбовирусных инфекций, в том числе для ранее неизвестных флавивирусов [10]. Так, в 1972 г., из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в окрестностях Каршинской степи Узбекистана, был выделен инфекционный агент, позднее идентифицированный как новый вирус Карши (KSIV или Karshi virus), отнесённый к роду Flavivirus [73].
Вирус Карши является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает лихорадочное заболевание. Описаны случаи заболевания лихорадкой Карши людей в Казахстане. Больным, инфицированным вирусом Карши через укус клеща, был поставлен диагноз острое респираторное заболевание. Последующие исследования иммунологических свойств антигена позволили идентифицировать вирус Карши как возбудителя [5]. Этиология заболевания изначально была определена не верно, вследствие того, что диагностика и патология этого вируса для человека исследована не достаточно. Для дальнейшего изучения экологии вируса и его роли в патологии человека большое значение имеет мониторинг с помощью специфичной детекции его геномной РНК.
Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению представителей рода Flavivirus, по-прежнему отсутствуют данные о точном систематическом положении и структурных особенностях многих из них. Так, исследования вируса Карши, основанные только на биологических и иммунологических свойствах этого вируса, в течение 10 лет не приводили к точному установлению его положения внутри рода Flavivirus. С совершенствованием иммунохимических методов диагностики и появлением первых данных о первичной структуре небольшого участка гена NS5 вируса Карши, его отнесли к ККЭ [20].
Оставался нерешённым вопрос и о таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия данных о структуре его полного генома. Определение же таксономического положения малоизвестного вируса представляет собой непростую задачу, так как классификация, установленная Международным комитетом по таксономии вирусов, не является завершённой, и многие её положения развиваются исследователями.
Для исчерпывающей характеристики штаммов вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность их геномов. К началу настоящих исследований данные о структуре полноразмерного генома вируса Карши отсутствовали.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось определение первичной структуры полного генома вариантов вируса Карши (штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг), молекулярно-генетическая характеристика его генома и определение систематического положения этого вируса среди представителей рода Flavivirus.
7 Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши, выделенного в Узбекистане.
Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-7192 Tur вируса Карши, изолированного в Туркмении.
Провести молекулярно-генетический анализ структуры полноразмерного генома, возможных структурных и неструктурных белков исследуемых штаммов вируса Карши, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными вирусами антигенного комплекса клещевого энцефалита.
Провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е, NS5 и полноразмерныхных геномов изолятов вируса Карши среди представителей рода Flavivirus.
Установить точное таксономическое положение штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита, опираясь на данные о первичной структуре их полноразмерных геномов.
Разработать лабораторный вариант метода ОТ-ПЦР для избирательного выявления геномной РНК вируса Карши с использованием данных о нуклеотидных последовательностях известных штаммов.
Научная новизна и практическая значимость
1. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, штамм вируса Карши LEIV-2247 Uz (10653 и.о.), выделенный в Узбекистане. Последовательность генома этого штамма является первой полноразмерной последовательностью генома вируса Карши, и может быть использована в качестве эталонной для данного
8 вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.
Определена полная первичная структура генома штамма LEIV-7192 Тиг (10768 и.о.), изолированного в Туркмении и ранее отнесённого по иммунохимическим свойствам к вирусу Карши.
Показано, что геном вируса Карши кодирует полипротеин, который впоследствии нарезается на 11 белков, так же как у остальных вирусов ККЭ. Предсказаны вероятные сайты Л^-гликозилирования, а также проанализированы функциональные сайты структурных белков.
В результате молекулярно-генетического анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей белка Е нами были предсказаны нейротропные свойства исследуемых штаммов вируса Карши.
На основе определённой нуклеотидной последовательности была предсказана вторичная структура 5'-концевого нетранслируемого региона.
Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши с флавивирусами, для которых известны полноразмерные последовательности генома и гена NS5, позволяет нам утверждать, что вирус Карши равноудалён от всех представителей ККЭ и образует отдельный кластер внутри данной группы вирусов, к которому, по-видимому, принадлежит и вирус Royal Farm.
,На основании анализа полной нуклеотидной последовательности генома установлено, что изученные штаммы LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг соответствуют разным генотипам одного вируса (значение дивергенции 5,5 %).
8. Создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР, позволяющий специфично детектировать геномную РНК вируса Карши (на участке гена NS5) от других представителей комплекса клещевого энцефалита.
9 Основные положения, выносимые на защиту
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса Карши штаммов LEIV-2247 Uz (10653 н.о.) и LEIV-7192 Тиг (10768 и.о.).
Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши позволяет использовать их в качестве эталонных представителей двух различных генотипов этой генетической линий. Сравнительный генетический анализ этих штаммов по нуклеотидным последовательностям полных геномов показал, что они различаются друг от друга на уровне, характерном для разных субтипов вируса Tick-borne encephalitis.
Предсказаны сайты протеолитического расщепления полипротеина вируса Карши на 11 белков и проанализированы их важные функциональные сайты, в том числе iV-гликозилирования. Показано, что гликопротеин оболочки вириона вируса Карши наиболее похож на белок Е вирусов, вызывающих энцефалиты, кроме того, в позиции 76 находится Thr, что ранее описано для нейротропных вирусов.
В ходе сравнительного анализа предсказанной вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого региона вируса Карши была показана его наибольшая степень гомологии с аналогичным участком вируса Powassan. Большая шпилечная структура 5'-нетранслируемой области имеет делецию протяжённостью 6 н.о.
Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши среди флавивирусов с известными полноразмерными последовательностями генома, а также генов Е и NS5 свидетельствует о том, что вирус Карши образует отдельный кластер внутри антигенного ККЭ, к которому, по-видимому, принадлежит вирус Royal Farm.
Сравнение результатов филогенетического анализа по нуклеотидным последовательностям генов Е, NS5 и по полным последовательностям
10 геномов вирусов, принадлежащих к комплексу клещевого энцефалита, показало, что эти данные хорошо коррелируют между собой. Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании любого из этих генов для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса Карши в пределах антигенного ККЭ. 7. Создан вариант метода ОТ-ПЦР для выявления вируса Карши, позволяющий специфично детектировать варианты этого вируса от других представителей комплекса клещевого энцефалита. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса Карши двух основных генетических линий, известных к настоящему времени.
Биологические свойства вируса Карши
При подкожном заражении белых мышей вирус проявляет себя как слабопатогенный (2,07 lg ЛД50/мл) и как среднепатогенный при внутримозговой инъекции (5,97 lg ЛД50/мл). Оптимальное накопление вирусоспецифического антигена наблюдалось в клеточной линии СПЭВ через 24-48 часов. При этом максимальное накопление вируса Карши в культуральной среде СПЭВ наблюдалось через 40 часов после заражения. В первично-трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона под агаром вирус образует четкие бляшки с ровными краями диаметром 1,5- 2,0 мм на 7-е сутки. Вирус Карши способен вызывать хроническую инфекцию клеток головного мозга сосунков хомячка, то есть обладает цитопролиферативной активностью. [8]. Температура окружающей среды является одним из факторов, влияющих на скорость развития инфекционного процесса. Так при размножении вируса Карши в клеще-переносчике при 22 С вирусные частицы обнаруживались в клетках и просвете кишечника на 7-15 сутки после заражения, а при 37 С - через 24 часа после заражения [2]. Вирус чувствителен к воздействию эфира и дезоксихолата натрия, что указывает на наличие в его составе липидной оболочки. А так же он обладает способностью агглютинировать эритроциты гуся в зоне рН от 6,0 до 7,0 при оптимальном значении рН 6,6 Вирус Карши является пантропным с наиболее выраженным поражением центральной нервной системы млекопитающих животных. Распространяется вирус в организме животных гематогенным путём. Наиболее чувствительными животными являются белые мыши. Инфекция у них протекает с более четко выраженным поражением ЦНС. При внутрицеребральном заражении белых мышей заболевание начинается на 3-й день и заканчивается на 4-5 день летальным исходом. В инфицированном организме вирус вызывает менингоэнцефалит, гиперемию мозговых оболочек, перицеллюлярный и периваскулярный отёки. Наиболее выраженные изменения происходят в области аммонова рога и менее выраженные - в коре. В лёгких происходит расстройство кровообращения и появляются небольшие инфильтраты, а также циркуляторные расстройства в периферических органах. При периферическом введении вируса клинические проявления у белых мышей происходят на 4-й день, а на 5-6 животные погибают. Сирийские хомячки, при внутримозговом и периферическом заражении вирусом Карши, заболевают на 14 день. Заболевание продолжается порядка 14 дней и заканчивается выздоровлением. Так же был проведён анализ поражений, вызванных вирусом, у зелёных мартышек, физиологически близких человеку.
При этом клинически выраженной картины заболевания не наблюдалось. Во всех случаях экспериментального заражения вирусом Карши животных был установлен менингоэнцефалит с выраженными изменениями в области аммонова рога. В течение болезни из крови и внутренних органов животных выделяли вирус [12]. Инкубационный период при первичном заражении вновь выделенным штаммом вируса сосунков белых мышей составлял 7 дней, а к 6 пассажу сокращался до 4-5 дней, причём титр вируса в суспенции мозга этих мышей достигал 7 lg ЛД5о/0,02 мл [13]. 1.2.2. Роль вируса Карши в патологии человека Вирус Карши является слабопатогенным для человека, но способен вызывать острое лихорадочное заболевание с сыпью под названием лихорадка Карши. Описаны случаи заболевания лихорадкой Карши людей в Казахстане. Больным, инфицированным вирусом Карши через укус клеща, был поставлен диагноз острое респираторное заболевание. Последующие исследования иммунологических свойств антигена позволили идентифицировать вирус Карши как возбудителя [5]. По данным казахских исследователей в сыворотке 2,1% населения (из 188 обследованных) присутствуют антитела к данному вирусу [6]. При исследовании 113 сывороток больных с остролихорадочными заболеваниями в сезон активности кровососущих насекомых у 7 обнаружены антитела к вирусу Карши [5]. Есть сведения о заболевании человека после укуса клеща, вызванном вирусом Карши, которое было подтверждено нарастанием титра антител в крови [6]. На основании этого был сделан вывод о патогенности вируса для человека. 1.3. Иммунохимические характеристики вируса Карши На основании серологических реакций (реакции нейтрализации, реакции связывания комплемента, диффузионной преципитации в агаре) вирус Карши был идентифицирован как ранее неизвестный представитель рода Flavivirus. Первые работы, посвященные классификации, демонстрировали одностороннюю антигенную связь с вирусом Западного Нила. Были высказаны предположения, что вируса Карши и вируса Западного Нила являются близкими, а отличия в их антигенной активности связаны лишь с их территориальной изоляцией [73]. В последующих работах были высказаны предположения об общих антигенных детерминантах вируса Карши и вируса желтой лихорадки наряду с такими вирусами как Tyuleniy, Uganda S, Sokuluk [1]. Подобная точка зрения на принадлежность вируса к той или иной группе семейства Flaviviridae существовала более 10 лет. Дальнейшие исследования Calisher et al. (1989) показали, что новый флавивирус Карши всё же относится к комплексу клещевого энцефалита. Спустя год вышла работа, полностью опровергающая данное положение. Такой вывод был сделан на основании применения моноклональных антител к вирусам этого комплекса в реакциях торможения гемагглютинации и связывания комплемента [42]. В последствии в ряде работ подтверждалось принадлежность вируса Карши к комплексу клещевого энцефалита. Используя методы ИФА и иммуноблота, была выявлена наиболее близкая серологическая связь с вирусом Powassan, хотя вирус Карши реагировал и с представителями антигенного комплекса японского энцефалита [8]. Как видно, исследование иммунохимических свойств вируса Карши позволило отнести его к роду Flavivirus и предположить о его антигенном сходстве с вирусами ККЭ. Хотя вопрос о точном таксономическом положении этого вируса внутри рода оставался открытым до работы Кіто [58]. 1.4. Таксономическое положение вируса Карши Род Flavivirus включает в себя приблизительно 80 видов, большинство из которых переносятся членистоногими. Представители этого рода наряду с вирусами родов Pestivirus и Hepacivirus объединены в семейство Flaviviridae [37,113].
Основываясь на традиционных методах вирусной классификации (наличие одноцепочечной инфекционной РНК, изометрического нуклеокапсида, липопротеиновой оболочки, количество оболочечных пептидов), флавивирусы прежде относили к семейству Togaviridae, которое включало 4 рода Alphavirus, Flavivirus, Rubivirus и Pestivirus. Тем не менее, в последствии, в ходе изучения вирусного генома, структуры вириона и репликационного цикла стало очевидно, что эти вирусы представляют отдельную эволюционную группу, и позднее 1985 году они были охарактеризованы как отдельное вирусное семейство Flaviviridae [113]. Поэтому в ранних работах, посвященных характеристике вируса Карши, его относили к роду Flavivirus семейства Togaviridae. Многие представители рода Flavivirus патогенны для человека и являются причиной ряда тяжёлых заболеваний, включая энцефалиты и геморрагические лихорадки. Особо опасными являются Denge virus, Japanese encephalitis virus, Yellow fiver virus, Tick-borne encephalitis virus. К сожалению, этот список не ограничивается перечисленными видами. Разнообразие вирусов внутри рода иллюстрирует таблица 1. Хотя Международный комитет по таксономии вирусов формально не признаёт дальнейшего деления вирусов по подгруппам внутри рода, однако, многие исследователи считают дифференциацию на такие единицы, как комплекс, тип, подтип необходимым [20]. Знания об экологии вирусов и их жизненного цикла позволяют внутри флавивирусов выделять группы (табл. 1): первая группа - это вирусы, переносимые комарами (47% mosquito borne), вторая - клещами (27% tick borne) и, наконец, третья - это вирусы, для которых не известны переносчики (26% по known vectors). Вирус Карши относят к группе вирусов, переносимых клещами.
Филогенетические взаимоотношения представителей рода Flavivirus
Применение в вирусологии методов молекулярной биологии, биохимии, биофизики и математического анализа внесло существенные коррективы в разработку и усовершенствование классификации вирусов. Ранее разделение вирусов на те или иные таксономические единицы проводилось с учётом морфологии и серологических исследований, что было не всегда корректно. Сравнительная характеристика вирусных РНК-геномов, их фрагментов, вирусоспецифических белков и отдельных антигенных детерминант позволила по-новому оценить генетическую вариабельность и филогенетические взаимоотношения циркулирующих в природе вирусов. В ряде случаев изучение молекулярной структуры и строения вирусов вносит существенные изменения в общепринятую классификацию. Молекулярно- биологические методы позволяют идентифицировать вирусы на уровне штаммов по их нуклеотидным и аминокислотным последовательностям. А филогенетические деревья могут быть использованы как для создания систематики данного вида, рода, семейства и т.д., так и в рассуждениях о возможном ходе эволюции в рассматриваемых категориях таксономии вирусов. Для молекулярно-генетического анализа и определения родственных связей среди вирусов рода Flavivirus ряд исследователей используют деление на генетические кластеры, ветви и, наконец, виды. G. Kino et al. (1998) выделяют кластеры, учитывая взаимоотношения организма носителя и переносчика, при этом вероятность ветвления составляет более 95 %. В ветви они объединили группы вирусов, гомология нуклеотидных последовательностей которых составляла 69 % и выше. Этот количественный критерий (69 %) был предложен в ходе анализа гомологии нуклеотидных последовательностей без 2-х стандартных отклонений среди четырёх серотипов вируса Denge, так как вирусы комплекса Denge без сомнения выделяются среди флавивирусов не только по серологической диагностике, но и по анализу нуклеотидных последовательностей [21]. Виды были определены как класс вирусов, имеющих степень гомологии свыше 84%. Этот параметр межвидовых различий был определён по двум штаммам вируса yellow fever (изоляты Asibi и TN96), которые на протяжении 69 лет разделяли и относили к двум различным генотипам [58]. Следует учесть, что результаты исследования ряда штаммов вирусов Denge, Japanese encephalitis, Saint Louis encephalitis и yellow fever, выделенных во всех известных эндемичных ареалах их распространения, показали, что вирус yellow fever являлся самым гетерогенным видом из всех (максимальное значение дивергенции среди штаммов составляет 14 %). Для деления вируса Japanese encephalitis на генотипы используют значение генетического расстояния равное 12 % [28].
Вероятно, для каждой группы вирусов внутри рода Flavivirus значение дивергенции, используемое при делении на генотипы и вирусы, будет оцениваться независимо. Среди 71 инфицирующего агента рода Flavivirus были выделены 3 группы: вирусы, переносимые клещами (15 вирусов), вирусы, переносимые комарами (42 вируса) и вирусы, для которых не известен переносчик (14). Более того, 68 вирусов были разделены на 14 кластеров и 3 вируса {Apoi, Cell fusion agent и Kedougou) не были ассоциированны ни с одним из них. В ряде работ были предприняты попытки отобразить на едином филогенетическом дереве всех представителей рода Flavivirus. Это позволило бы ответить на ряд вопросов, касающихся более детальной классификации некоторых вирусов, правомерности выделения некоторых штаммов в отдельный низший таксономический ранг, а так же положения новых флавивирусов в общей таксономической системе. Основным недостатком этих работ являлось то, что филогенетический анализ избранного количества вирусов проводился по различным генам. Н было проведено анализа всех известных флавивирусов по одному из генов. Как правило, исследователи представляют в своём сообщении анализ вирусов, с которыми они работали и представленными в международной базе данных Gen Bank. Наиболее полное и подробное исследование провели KunoG. et al. [58], в котором обобщили все известные к тому времени данные о таксономии и молекулярной биологии флавивирусов (рис. 6). Филограммы флавивирусов, представленные в более ранних работах, в основном были основаны на анализе нуклеотидной последовательности гена Е. Ген белка оболочки Е является менее консервативным, чем ген NS5, поэтому в пределах рода отличий в аминокислотной последовательности будет слишком много, чтобы проводить сравнения. Тогда как, сходство в аминокислотной последовательности белка Е составляет от 72,3 % до 80,4 % среди вирусов комплекса Denge, 81-94,6 % среди вирусов комплекса Japanese encephalitis и 66,3 % между yellow fever и Banzi virus. Для белка NS5 значения гомологии будут выглядеть следующим образом 75-86 %, 83-97 % и 72 %, что подтверждает более консервативную природу белка NS5. Следует отметить, что филогенетические деревья, построенные по гену NS5, прекрасно коррелируют с прежними работами [80, 81]. Представленная на рисунке 6 филограмма флавивирусов, демонстрирует, что от предполагаемого предка рода Flavivirus выходят два основных кластера: вирусы, для которых не обнаружен переносчик и вирусы, переносимые членистоногими переносчиками.Последняя ветвь подразделяется ещё на две большие группы вирусов, переносимых комарами и переносимых клещами. Что касается эволюции этих трёх основных кластеров, теоретически ни одна ветвь не могла быть центральной, так как метод филогенетического анализа был безкорневым.
Тем не менее, С.Н. Calisher полагал, что «эволюционное давление может создавать расхождение в отношениях вируса и переносчика, возможно, от общего предка» [20]. Blok и Gibbs считали, что распространение и перенос флавивирусов посредством членистоногих переносчиков, является приобретённым свойством. По одной широко распространённой теории два кластера вирусов, переносимых комарами и клещами, независимо эволюционировали от общего предка [58]. Marin с соавторами [80] ещё ранее пришёл к выводу, что группа вирусов Tyuleniy, которая после довольно раннего ответвления от кластера вирусов, переносимых членистоногими переносчиками, могла разделиться на существующие 2 кластера вирусов, переносимых клещами, и вирусов, переносимых комарами. Об этом свидетельствует тот факт, что вирусы группы Tyuleniy обладают некоторыми особенностями вирусов, переносимых комарами: отсутствие гексапептидных включений, идентичная структура сайта гликозилирования в белке Е и способность реплицироваться в культуре комариных клеток. Оказалось, что нуклеотидные последовательности вирусов, образующих эти три кластера, гомологичны на 63-65 %. Высокий процент гомологии нуклеотидных последовательностей вирусов, принадлежащих к разным кластерам, может отображать генетические и эволюционные взаимосвязи между представителями этих двух кластеров. Как показано на рисунке 7, количественное соотношение пар идентичных нуклеотидных последовательностей в ранге кластеров понизилось до 20,9 % между вирусами, не имеющими переносчика и переносимыми клещами. Тогда как этот показатель среди вирусов, не имеющих переносчика и переносимых комарами, составил 1,2%. С другой стороны, при сравнении кластеров вирусов, переносимых комарами и клещами наиболее похожих пар оказалось порядка 55,7 %. Более того, что касается взаимосвязи с переносчиком, некоторых представителей из комплекса вирусов, переносимых комарами (Saint Louis encephalitis virus, West Nile virus и yellow fever virus\ были изолированы из клещей. Группа вирусов, переносимых клещами, также не является однородной по типу переносчика, так как вирус Powassan был найден и в комарах.
Электрофорез ДНК
Электрофорез препаратов ДНК проводили при комнатной температуре в 1 % агарозном геле (агароза фирмы Promega, США) в 1 хтрис-ацетатном буфере следующего состава: 40 мМ трис-ацетат рН 8.0; 2 мМ ЭДТА. Перед нанесением пробы на гель к ней добавляли 0,1 объем буфера для нанесения, содержащего 50 % глицерина, 0,2 % бромфенолового синего и 0,25 % ксиленцианола. Для визуализации ДНК гель прокрашивали в течение 10-20 минут в растворе бромистого этидия (5 мкг/мл в трис-ацетатном буфере трис-ацетатном буфере). Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров - фрагментов ДНК известной молекулярной массы (в качестве маркеров обычно использовали ДНК фага фх 174, гидролизованную рестриктазой Нае III или разнообразные фрагменты ДНК, полученные в ходе предыдущих работ). 2.8. Подготовка ДНК для секвенирования Перед реакцией секвенирования амплифицированные фрагменты ДНК проходили очистку из агарозного геля. Зону геля, содержащую фрагмент нужной длины, вырезали и растворяли в 1 мл раствора Nal (6.6 М Nal, 16 мМ Na2S03). После растворения агарозы добавляли 10 мкл glass milk (взвесь Silicon dioxide, обработанная азотной кислотой) и 10 мкл 2 М ацетата натрия (рН 4,5). Сорбцию ДНК проводили в течение 30 мин. при 4С. Следующим этапом выделения ПЦР-фрагмента являлось промывание сорбционных частиц 80% этанолом 2-3 раза. ДНК элюировали с подсушенного осадка glass milk добавлением 25-30 мкл раствора ТЕ (Трис-ЭДТА) при 50С в течение 10 минут. После центрифугирования раствор ДНК использовался в реакции секвенирования. 2.9. Секвенирование ДНК Первичную нуклеотидную последовательность определяли по методу Сэнгера при помощи прямого секвенирования ПЦР-продукта с использованием BigDye Termination Cycle Sequencing Kit согласно инструкции изготовителя. Электрофорез ДНК осуществлялся на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 DNA sequencer а в последствии на ABI Prism 3130 genetic Analyzer (Applied Biosystem, США). 2.10. Построение алайментов и филогенетический анализ Для построения алайментов использовали алгоритмы Clustal V и Clustal W из пакета программ DNASTAR V.3.12, производства «Lasergen Inc.» (Madison, WI).
Построение филогенетических деревьев осуществляли на основе двух алгоритмов: "ближайшего соседа" или "UPGMA" в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмплингом (MEGA 3.1). Для проведения филогенетического анализа и генотипирования исследуемых штаммов вируса Карши были использованы вирусы из международной базы данных GenBank (табл. 3). Таксономические характеристики штаммов, представленных в таблице 3, выделенных в различных географических регионах мира, была установлены согласно ранее опубликованным работам [18, 20,21, 58, 69]. При построении филогенетических деревьев в качестве эталонных были использованы нуклеотидные последовательности участка гена NS5 флавивирусов, а так же нуклеотидные последовательности геномов и генов Е некоторых представителей комплекса клещевого энцефалита (ККЭ). При определении положения исследуемых штаммов на филогенетическом дереве использовалось максимальное количество анализируемых последовательностей, принадлежащих разным генотипам и видам всех известных на сегодняшний день антигенных групп флавивирусов. При установлении филогенетических взаимоотношений исследуемых штаммов в пределах антигенного комплекса нами использовались практически все известные на настоящий момент штаммы, доступные в базе данных GenBank. В качестве "outgroup" использовали последовательность штамма Ast04-2-824А вируса Западного Нила (AJ302646) первой группы. Вычисление коэффициента корреляции данных филогенетического анализа (значений дивергенции) проводили с помощью программы Microsoft Excel (Microsoft Office 2001, США). Под дивергенцией понимали значение разности 100 и степени гомологии, полученной с помощью пакета программ DNASTARV.3.12. Получение рекомбинантных плазмид. Лигирование фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации, проводили с вектором pGEM (Promega, США) в объеме 10 мкл при +4 град в течение 16 часов. Для реакции лигирования использовали 5 мкл 2хбуффера (60 мМ Tris-HCl рН 7,8; 20 мМ MgCl2; 20 мМ дитиотрейтола; 2 мМ АТФ и 10 % полиэтиленгликоля-6000), 0,5 мкл pGEM и добавляли 4,5 мкл ПНР-продукта. Реакцию проводили с 0,5 единиц лигазы фага Т4 (Promega, США). Приготовление компетентных клеток Использованный метод был описан Дугласом Ханааном [7]. В 100 мл. 2xYT бульона следующего состава (на 1 л): бактотриптон - 16 г ("Difco", США), дрожжевой экстракт - 10 г ("Difco", США), хлорид натрия - 5 г засевали 1 мл ночной культуры E.coli и выращивали до оптической плотности 0.4-0.6 о.е. при 37С. Клетки охлаждали во льду и центрифугировали при +4С в течение 5 мин. при 5 тыс. об./мин. Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл. буфера RF1 (100 мМ RbCl, 50 мМ МпСЬ, 30 мМ ацетат калия, 10 мМ СаСЬ, 15 % глицерина, рН 5.8) и инкубировали во льду (20-30 мин.). Затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин., 5 тыс. об./мин., при +4С). Осадок клеток суспендировали в 10 мл. буфера RF2 (10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ СаС12, 15% глицерина, рН6.8) и инкубировали во льду (20-30 мин.).
Приготовленные таким образом клетки разделяли на аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при минус 70С до использования. Трансформация плазмидной ДНК и селекция рекомбинантных плазмид, несущих последовательности амплифицированной ДНК Непосредственно перед трансформацией клетки размораживали в бане со льдом. К суспензии компетентных клеток добавляли 0,5 мкл. В концентрации 20-100 ng лигированной смеси ДНК и выдерживали на льду (15-20 мин.). Тепловой шок проводили в водяной бане при 42С в течении 1 мин. и добавляли 1 мл 2xYT бульона. Для фенотипического выражения плазмидных маркеров суспензию клеток инкубировали в течение 1 часа при 37С, затем высевали на твердую питательную среду, содержащую антибиотик, X-gal, ИПТГ, и оставляли на ночь при температуре 37С. на утро проводили скрининг выросших колоний. Селекцию колоний, несущих необходимую плазмиду, проводили на чашках Петри, содержащих 100 мкг/мл ампициллина и по 40 мкл на чашку растворов 100 мМ ИПТГ и 2% X-gal. Плазмиды, несущие вставку ДНК, отбирали по белому цвету колоний. Для подтверждения специфичности вставки, применяли электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле. Специфичность всех отобранных клонов подтверждали методом ПЦР с олигонуклеотидами, комплементарными клонированному участку. Выделение плазмидной ДНК Выделение плазмидной ДНК проводили щелочным методом из 5 мл ночной культуры с применением набора "Wizard plus SV minipreps DNA purification system" производства "Promega", США, в соответствии с прилагаемой инструкцией.
Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других представителей рода Flavivirus
Большинство исследователей рассматривают филогенетические взаимоотношения вирусов внутри рода Flavivirus по двум наиболее консервативным белкам NS3 (протеаза / хеликаза) и NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза). Поэтому для проведения аналогичного анализа по установлению филогенетических связей вируса Карши с различными представителями рода Flavivirus были взяты 82 штамма, для которых известна первичная структура полноразмерного генома (17 вирусов) или нуклеотидная последовательность участка гена, кодирующая белок NS5, отнесённых в настоящий момент к данному роду (табл. 3). В результате анализа, было построено филогенетическое дерево, основываясь на котором можно утверждать, что вирус Карши принадлежит к антигенному комплексу клещевого энцефалита (рис. 16.). Эти данные не противоречат результатам более ранних исследований, посвященным антигенным свойствам вируса Карши [21], и филогенетическим взаимоотношениям внутри флавивирусов [58]. Из представленной на рисунке 16 филограммы следует, что изучаемые штаммы вируса Карши наиболее близки к малоизученному вирусу Royal Farm. Вероятно, вместе они образуют отдельный кластер внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита. Причём данные о полной первичной структуре генома вируса Royal Farm отсутствуют, поэтому мы не можем оценить степень его гомологии со штаммами вируса Карши. Основываясь на филогенетическом анализе участка гена NS5, можно предположить, что рассматриваемые вирусы генетически удалены друг от друга на расстояния, превышающие межштаммовые различия. Так дивергенция по этому участку между вирусом Royal Farm и Карши составила 13,6-13,9 %, а между двумя предполагаемыми штаммами LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг 3,0 %. Безусловно, окончательно это можно утверждать после анализа их полных геномов. Для облегчения дальнейшего изложения и в связи с очень противоречивыми литературными данными, существующими в вопросе таксономии вирусов ККЭ, мы ввели следующие обозначения: 1) Под генетической линией мы понимаем штаммы вирусов, значения дивергенции полноразмерных геномов которых составляет около 0,1 и более. Дивергенция определялась в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры (MEGA 3.1). В эту группу вошли Tick-borne encephalitis virus, Omsk hemorrhagic fever virus, Langat virus, Kyasanur forest disease virus, Powassan virus, Karshi virus. 2) Генетически удалённые вирусы, но находящиеся в пределах одной генетической линии, мы определяем как генотипы, которые объединяют близкие штаммы вирусов.
Значения дивергенции, относительно которого мы можем судить о принадлежности вирусов к различным генотипам, обсуждается далее в работе. Представляет интерес уточнение филогенетического положения вируса Карши внутри группы клещевого энцефалита. С этой целью мы проанализировали максимальное количество разнообразных штаммов и вирусов, включённых в этот комплекс. Следует также учесть, что филогенетическое дерево будет наиболее приближено к реальному, если оно построено по нуклеотидным последовательностям, кодирующим полную структуру полипротеина. Было проведено филогенетическое сравнение штаммов по кодирующей части генома представителей ККЭ, известных на сегодняшний день (17 вирусов) со штаммами вируса Карши (рис. 17). Оказалось, что штамм LEIV-2247 Uz имеет максимальную степень гомологии со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sojjin-НО дальневосточного субтипа вируса ТВЕ (71,2%) и минимальную (69,8 %) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и Louping ill (штамм 369/Т2). Максимальная степень гомологии штамма LEIV-7192 Тиг была со штаммом Vasilchenko вируса ТВЕ (71,0%), а минимальная с вирусом Deer tick (69,5 %). Важно отметить, что значения гомологии вируса Карши с представителями ККЭ лежало в пределах (69,5-71,2%), это свидетельствует о том, что анализируемый вирус достаточно удалён от всех представителей своего серокомплекса и образует отдельную генетическую ветвь (рис. 17). Вопрос о принадлежности штаммов к различным генотипам одного вируса или же к разным нозоологическим единицам для многих представителей ККЭ остаётся нерешённым. Учитывая противоречия, которые возникли по вопросу классификации представителей данного комплекса (глава 1.7), трудно оценить являются ли изоляты LEW- 2247 Uz и LEIV-7192 Тиг генетическими разновидностями одного вируса Карши или же разными генетическими линиями. Для ответа на этот вопрос была проведена оценка различий между штаммами, генотипами и генетическими линиями ККЭ. Генетическое расстояние, оцененное по В последние годы большинство исследователей приходят к мнению, что западный, дальневосточный и урало-сибирский TBEV все же являются различными генотипами этого вируса. К тому же, процент дивергенции между вирусами Powassan и Deer tick, оцененный по полному геному, оказался довольно близкой величиной к разнице между выделенными изолятами вируса Карши и составил 5,2 %. Первоначально эти вирусы были охарактеризованы как независимые нозологические единицы, но не так давно их отнесли к различным генотипам одного вируса [57]. К сожалению, не для всех вирусов и штаммов рассматриваемой антигенной группы известна полная первичная структура генома. Поэтому многими исследователями для установления положения вирусов внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита использовались аминокислотные или нуклеотидные последовательности генов Е и NS5 или даже их участков. Причём последний ген NS5 является наиболее консервативным и в основном используется для определения филогенетического, а также систематического положения внутри рода или семейства. Но в ряде работ участок гена, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу (NS5) используют для определения положения нового вируса или штамма среди близкородственных представителей или членов одного антигенного комплекса.
Для изучений внутригенетических различий флавивирусов исследователи чаще всего останавливаются на поверхностном белке Е, поскольку он является главным вирусным антигеном и, вероятно, что аминокислотные отличия в его структуре должны играть главную роль в фенотипических различиях изолятов. Некоторые авторы считают [4], что ген NS5 не является удобным для филогении вирусов внутри антигенного комплекса. Основной аргумент в пользу этой версии заключается в том, что NS5 является геном неструктурного белка и не позволяет сравнивать таксономические положения вирусов на основе анализа данных по связыванию вирусных белков с антителами и на основе анализа последовательностей РНК вирусов. Наиболее удобен, как они полагают, для этих целей ген белка Е. Выбор гена белка Е для анализа может быть обусловлен и тем, что он является главным поверхностным белком, выполняющим существенные функции в жизненном цикле вируса, включая связывание с рецепторами и слияние мембран, и именно на белок Е образуются протективные антитела. Поэтому классификация штаммов, построенная по гену Е, будет сравнима с классификацией, построенной по антигенным свойствам вируса. Для того чтобы выяснить по последовательности какого гена следует оценивать филогенетические отношения, чтобы они были наиболее приближены к филогенетическому анализу по полному геному, было построено 3 дендрограммы: по нуклеотидной последовательности ОРС, по генам Е и NS5. Количество, анализируемых штаммов и вирусов, представленных в каждой дендрограмме было одинаковым и лимитировано количеством штаммов с известным полным геномом. Филогенетический анализ с использованием выровненных нуклеотидных последовательностей длиной 10377 и.о., 2709 н.о. и 1486 н.о. для полной открытой рамки считывания (ОРС), гена NS5 и Е соответственно, проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 5000-кратным ресэмплингом (MEGA 3.1). В качестве аутгруппы был взят штамм Ast04-2-824А вируса Западного Нила (WNV). На рисунке 17 представлено филогенетическое дерево для представителей комплекса клещевого энцефалита, построенное в результате анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей полипротеин.
