Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одними из перспективных систем доставки, генетической информации в клетки млекопитающих являются вирусные векторы, которые используют для проникновения в клетку природный механизм вирусной инфекции. Наиболее изученными и эффективными вирусными векторами, обеспечивающими in vivo транзиентную экспрессию доставляемых генов, в настоящее время являются векторы на основе генома аденовируса человека типа 5 (Ад5). Данные векторы способны трансдуцировать различные типы клеток млекопитающих, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки.
В последние годы интенсивно изучается возможность создания векторных систем на основе генома аденовируса птиц CELO (Mtchou А.Ї. et al., 1999, Francois A. et. al., 2001, Glotzer J.B, et a]., 2000, Шмаров M. и соавт., 2002). Интерес исследователей к данному вирусу как векторной системе объясняется наличием свойств, позволяющих предположить ВОЗМОЖНОСТЬ разработки эффективной эукариотической векторной системы на основе генома CELO. В организме человека и млекопитающих отсутствует предшествующий применению векторов иммунитет к Ад птиц CELO, что теоретически способно обеспечить продолжительную персистенцию экспрессии генов, доставляемых векторами CELO. Особенностью вируса CELO является способность к репликации в эмбрионах кур (Laver W.G. et. al., 1971). В отличие от трудоемких и относительно низкоэффективных методик накопления Ад5 в культуре клеток, наращивание векторов в эмбрионах кур является высокоэффективным процессом. Данная технология яаляется привлекательной при получении векторов в препаративных количествах. Положительными характеристиками Ад CELO являются также большая пакующая емкость и повышенная ^физическая стабильность -
ШМъоди
вирионов по сравнению с вирионамн Ад5 (Laver W.G. et. al., 1971; Cotten M. et.al.,1993).
В настоящее время показана возможность конструирования рекомбинантных Ад CELO. Определен регион геномной ДНК вируса CELO, удаление которого не оказывает влияния на способность CELO к репликации в культуре клеток гепатомы петуха леггорна LMH (Michou A.-I. et. al, 1999). Данные векторы на основе генома CELO представляют собой аналог недефехтных по репликации векторов на основе Ад5 с делецией ЕЗ области и способны к репродукции в культуре клеток LMH и эмбрионах кур. Описаны также векторы с делецией раннего гена GAM-I. Репликация такого вектора CELO может быть комплементирована in trans экспрессией hsp40. (Gtotzer J.B. et, al., 2000). Векторы с делецией гена длинного фибера CELO (Tan Р.К. et. al., 2001) сохраняют способность к репликации в клетках линии LMH и эмбрионах кур, что позволяет предположить возможность модификаций данного гена с целью изменения транедуцирующих свойств векторов на основе генома CELO. На настоящий момент в литературе отсутствуют данные о клеточных линиях, способных комплементировать делении генов CELO, необходимых для репликации вируса. S экспериментах in vitro показана функциональная активность рекомбинантных вирусов CELO, экс пресен рующих репортерные гены, В научной литературе отсутствуют данные по результатам использования векторов CELO для доставки терапевтических генов и определения их функциональной активности как in vivo, так и in vitro.
В нашей работе мы исследовали данную новую эукариотическую векторную систему для доставки и экспрессии терапевтического гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа І (HSV-tk) in vitro, в культурах клеток опухолей, и in vivo, в модели подкожных трансплантатов меланомы В16 мышам C57BL/6.
Полученные результаты позволяют сделать заключение о перспективности развития векторной системы на основе Ад птиц CELO. На основе векторов данного типа возможно получение рекомбинантных вакцин против инфекционных заболеваний человека и животных. Векторы CELO также способны найти широкое применение в генной терапии как альтернативный или дополнительный к Ад5 вектор.
Цели н задачи исследования.
Целью дзкной работы являлось конструирование векторов на основе Ад птиц CELO и Ад5 для доставки и экспрессии in vitro и in vivo терапевтического гена HSV-tk, а также репортерного гена EGFP, исследование экспрессии и функциональной активности продуктов экспрессии в культурах клеток млекопитающих, сравнение in vitro эффективности доставки и экспрессии HSV-tk векторами на основе CELO и Ад5, а также изучение функциональной активности полученных рекомбинантных Ад CELO in vivo, на модели меланомы мышей В16. Непосредственными задачами данной работы были:
-
Получение рекомбинантных Ад CELO, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делецни 41731-43684 п.о, генома CELO под контролем промотора HCMV.
-
Исследование функциональной активности рекомбинантного Лд CELO, экспрессирующего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, в культурах клеток опухолей.
-
Получение рекомбинантных Ад на основе генома Лд5, несущих гены HSV-tk и EGFP в сайте делеции Е1 области генома Ая5 под контролем промотора HCMV.
-
Сравнение in vitro, в культурах клеток опухолей функциональной активности векторов на основе Ад CELO и Ад5, эрепрессирующих ген HSV-ik под контролем промотора HCMV.
5. Исследование in vivo, на модели подкожных трансплантатов меланомы мышей В16 функциональной активности рекомбинантного Ад CELO, экспрессиругощего ген HSV-lk под контролем промотора HCMV.
Научная новщна и практическая значимость.
В результате проведенной работы впервые получены данные о функциональной активности рекомбинантного Ад птиц CELOj экспрессируюшего терапевтический ген тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1 под контролем промотора HCMV, in vitro, в культурах клеток опухолей человека и мышей. Исследована эффективность системы HSV-tk/GCV в экспериментах in vitro с использованием вектора на основе генома CELO.
Впервые проведено ('я vitro, в культуре клеток аденокарциноми легкого человека НІ299 сравнение цитотоксического действия векторных систем на основе геномов Ад птиц CELO и Ад человека типа 5, экспрессирующих ген HSV-tk под контролем промотора HCMV.
Впервые показан противоопухолевый эффект рекомбинантного Ад CELO-TK, экспрессируюшего ген HSV-tk под контролем промотора HCMV, in vivo, на модели подкожных трансплантатов мелакомы мышей В і 6.
Полученные результаты демонстрируют возможность использования Ад птиц CELO в качестве средства доставки и экспрессии целевых генов в клетках млекопитающих как in vitro, так и in vivo, что подтверждает целесообразность дальнейшего изучения и развития векторной системы на основе генома CELO с целью применения в ветеринарии и сельском хозяйстве в качестве генно-инженерных вакцин, а также в генной терапии для создания рекомбинантных вирусов CELO, которые в перспективе могут быть использованы в терапии "и профилактике различных заболеваний человека, в том числе - онкологических.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на I и II молодежных научных конференциях "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии", ВНИИСБ (Москва, 2001г., 2002г.), на 10-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2002). Результаты работы доложены и обсуждены на расширенном заседании лаборатории генной инженерии эукаркот ВНИИ СБ.
Объем и .структура работы. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 165 библиографических ссылок. Работа иллюстрирована 22 рисунками.
Похожие диссертации на Векторная система на основе генома аденовируса птиц CELO для доставки и экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса человека типа 1
