Содержание к диссертации
Введение 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Структурно-функциональная организация генома ВИЧ-1. 11
Глава 2, Подтипы ВИЧ-1: классификация, происхождение и распространение. 23
Глава 3. Особенности генетической изменчивости ВИЧ-1. 43
Глава 4. Развитие эпидемии ВИЧ-инфекции в России. 57
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Материалы и методы. 67
Бактериальные штаммы. 67
Питательные среды. 67
Определение концентрации жизнеспособных клеток Escherichia colL 67
Приготовление компетентных клеток Escherichia colt и трансформация
их препаратами плазмидной ДНК. 67
1.5. Выделение плазмидной ДНК. 68
1.5.1. Препаративное выделение плазмидной ДНК. 68
1.5.2, Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК. 69
Гидролиз ДНК с использованием специфических эндонуклеаз. 69
Получение рекомбинантных молекул in vitro, 70
Подготовка вектора pUCIS для лигирования. 70
Подготовка амплифицированных фрагментов для лигирования. 70 1.7.3. Лигирование фрагментов ДНК. 71
1.8. Иммуноферментный анализ (ИФА). 71
Анализ наличия антител к ВИЧ-1. 71
ИФА сывороток и плазмы крови с применением ВИЧ-1-субтип-специфических пептидов. 72
Сенсибилизация планшетов. 72
Ход иммунофермеитного анализа. 72
Регистрация и интерпретация результатов. 73
1.9. Выделение и лизирование лимфоцитов крови. 73
1.9.1. Выделение лимфоцитов методом центрифугирования в
градиенте плотности фиколла. 73
1.9.2. Выделение и лидирование лимфоцитов, полученных из цельной
крови («быстрый» метод отмывки лимфоцитов). 74
1.9.3. Выделение лимфоцитов методом «быстрой отмывки» с
предварительной концентрацией клеток. 75
1.10. Забор крови и получение образцов плазмы крови для
исследований методом ПЦР. 75
1Л1. Выделение РНК ВИЧ-1. 75
Рестрикция ДНК pUCIS Нра 11 (Msp 1). 76
Электрофоретический анализ препаратов ДНК в агарозном геле. 76
Метод сравнительной оценки электрофоретнческой
подвижности гетеродуплексов. 77
1.14.1. Состав олигонуклеотидных праймеров для амплификации
фрагментов гена env. 77
ПЦР-анализ ДНК лимфоцитов для гена env. 78
ПЦР-анализ РНК плазмы крови. 78
Условия амплификации для гена env. 79
Состав олигонуклеотидных праймеров для амплификации
фрагментов гена gag. 79
ПЦР-анализ ДНК лимфоцитов для гена gag. 80
Условия амплификации для гена gag. 80
Гибридизация ДНК-фрагментов области env. 80
Гибридизация ДНК-фрагментов области gag. 81
1.14.10. Электрофорез ДНК (область env) в полиакриламидном
геле и интерпретация результатов. 81
1.14.11. Электрофорез ДНК (область gag) в полиакриламидном
геле и интерпретация результатов. 82
1.15. Метод RFLP для выявления подтипов gagA и gagB ВИЧ-1 у лиц,
практикующих употребление психоактивных препаратов внутривенно,
и gaga среди мужчин, практикующих половые контакты с мужчинами. 82
1.15.1. Состав олигонуклеотидных праймеров для амплификации
фрагментов гена gag. 83
Состав реакционных смесей и условия проведения ПЦР. 84
Анализ результатов гидролиза амплифицированных фрагментов области gag методом электрофореза в полиакриламидном геле
и интерпретация результатов. 84
Определение нуклеотидной последовательности (секвешфованне) ВИЧ-1. 85
Статистические методы. 86 РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 2. Изучение вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России на
первом этапе развития эпидемии (1987 - конец 1995 гг.). 87
Глава 3. Генетический анализ новых вариантов ВИЧ-1, выделенных на
территории Российской Федерации от лиц, заразившихся до 1996 года. 91
Характеристика варианта ВИЧ-1 подтипа Н, выделенного в России. 91
Рекомбинантная форма CRF0l_AE, выделенная в России. 94
Характеристика варианта вируса подтипа G, выделенного на территории России и отличного от варианта, вызвавшего
нозокомиальную вспышку на юге Российской Федерации. 97
Рекомбинант gagD/envG ВИЧ-1 в России. 99
Рекомбинантые формы ВИЧ-1, образованные вирусами подтипов AuG. 103
Вариант вируса подтипа С, выделенный в России. 105 Глава 4. Генетическая характеристика вариантов ВИЧ-1,
выделенных на втором этапе развития эпидемии ВИЧ-инфекции
на территории Российской Федерации. 107
4.1. Генетическая характеристика вариантов ВИЧ-1, циркулирующих
среди лиц, употребляющих психоактивные препараты внутривенно. 107
4.2. Изучение распространения ВИЧ-инфекции среди лиц,
употребляющих психоактивные препараты внутривенно, и их
половых партнеров в регионах европейской части России в 1996 -1998 гг. 121
Глава 5. Результаты молекул ярно-эпидемиологического мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции в разных регионах России среди лиц, употребляющих психоактивные препараты внутривенно, на втором
этапе развития эпидемии.
5.1. Серологический и генетический анализ вариантов ВИЧ-1,
циркулирующих среди лиц, употребляющих психоактивные
препараты внутривенно, и их половых партнеров в разных регионах
России в 1999-2003 гг. 121
5.2 Генетическая изменчивость вариантов ВИЧ-J, распространенных среди лиц, практикующих внутривенное введение психоактивных
препаратов, и их половых партнеров. 133
Глава 6. Распространение ВИЧ-1 на территории России среди лиц, не принимавших психоактивные препараты внутривенно,
іа втором этапе развития эпидемии в России. 138
Изучение вариантов ВИЧ-1, обнаруживаемых в России среди тфицированных половым путем в 1999-2002 гг. 138
Изучение аминокислотной изменчивости петли V3gpl20 при
смене пути передачи ВИЧ-1 подтипа А. 141
Глава 7. Разработка алгоритма молекулярно-эпидемиологического
мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции в России. 144
7.1. Изучение возможности применения метода сравнительной
оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов (ИМА)
для генотипирования вариантов ВИЧ-1 по генам gag uenv в России в
период 1995-2002 годов. 144
7.2. Алгоритм молекулярно-эпидемиологического мониторинга эпидемии
ВИЧ-инфекции в Российской Федерации. 149
ОБСУЖДЕНИЕ 152
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 180
ВЫВОДЫ 182
ЛИТЕРАТУРА 184
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток
ВИЧ-1 (HIV-I) - вирус иммунодефицита человека 1-го типа (human immunodeficiency
virus type 1)
ВИО (SIV) - вирус иммунодефицита обезьян (simian immunodeficiency virus)
ОТ (RT) - обратная транскриптаза (reverse transcriptase)
п.н. - пары нуклеотидов
ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетрауксусная кислота
CRF (circulating recombinant form) - циркулирующая рекомбинантная форма
dNTPs - дезокситрифосфаты
НМА (heteroduplex mobility assay) - метод сравнительной оценки электрофоретической
подвижности гетеро дуплексов
MSM (men who have sex with men) - мужчины, практикующие половые контакты с
мужчинами
PBIA (peptide binding immunoassay) — твердофазный ИФА с использованием
синтетических пептидов
RFLP (restriction fragment length polymorphism) - метод полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов
URF (unique recombinant form) - уникальная рекомбинантная форма
IDU (intravenous drug users) - потребители инъецирующих наркопрепаратов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), неизбежно приводит к развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) - тяжелого заболевания иммунной системы человека, которое сопровождается развитием оппортунистических инфекций и неопластических образований и заканчивается летальным исходом. ВИЧ-инфекция на сегодняшний день является одним из наиболее социально значимых заболеваний и, продолжая быстро распространяться, оказывает негативное влияние на мировую экономику. Более того, в некоторых странах юга Африки эпидемия ВИЧ-инфекции приобрела масштаб национальной катастрофы.
ВИЧ-1 отличается высоким многообразием генетических вариантов. На сегодняшний день в группе «М», объединяющей подавляющее большинство изолятов ВИЧ-1, распространенных по всему миру, выявлено 11 подтипов, 15 циркулирующих рекомбинантных форм и большое разнообразие уникальных рекомбинантов этого вируса, географическое распространение которых, тем не менее, неоднородно. В Центральной и Южной Африке доминируют вирусы подтипов А и С, в странах Западной Европы и Америки, в Австралии и Японии преобладает ВИЧ-1 подтипа В, а в странах Юго-Восточной Азии наибольшее распространение получила рекомбинантная форма CRF01_AE. Изучение распространения подтипов ВИЧ-1, генетический анализ новых вариантов вируса имеют большое значение, во-первых, для понимания закономерностей развития эпидемии ВИЧ-инфекции, во-вторых, для выявления новых источников заражения и ведущих путей передачи инфекционного агента при проведении эпидемиологических расследований, в-третьих, для прогнозирования дальнейшего развития эпидемии, в-четвертых, для разработки новых и контроля качества уже имеющихся средств диагностики, профилактики и лечения ВИЧ-инфекции.
ВИЧ-1 обнаруживается в разных группах риска и передается посредством разных путей передачи. При этом в Африке и странах азиатского континента вирус передается преимущественно половым путем, в то время как в странах Европы и Северной Америки важную роль в эпидемическом процессе играет парентеральный путь передачи вируса.
В настоящее время отсутствуют меры специфической профилактики ВИЧ-инфекции, что определяется, в частности, высокой вариабельностью генома ВИЧ-1, которая позволяет ему уходить от специфического иммунного ответа. В связи с этим, изучение закономерностей генетической изменчивости ВИЧ-1 в отдельных государствах и регионах, в различных группах риска, при разных путях передачи инфекционного агента, а также у одного пациента в процессе развития инфекционного процесса является одним из актуальных направлений молекулярной вирусологии.
Изучение вариантов ВИЧ-1 в Российской Федерации представляет особый интерес. Это связано с тем, что эпидемия ВИЧ-инфекции в странах Восточной Европы и, прежде всего, в России началась значительно позднее, чем в других государствах. Это обстоятельство позволило приступить к изучению эпидемического процесса с первого случая ВИЧ-инфекции в России, зафиксированного в 1987 г. [Покровский и др., 1987], в отличие от стран Запада, где возбудитель был выявлен уже после начала крупномасштабных эпидемий. В период с 1987 по 1996 гг. распространение ВИЧ-1 происходило относительно медленно, и на 1 января 1996 г., по данным Федерального научно-методического Центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом, на территории России было зарегистрировано 1062 случая ВИЧ-инфекции. Основным путем распространения ВИЧ-инфекции в этот период являлись половые контакты, причем вирус, как правило, проникал на территорию России из зарубежных стран, либо распространялся иностранными гражданами, обучавшимися в СССР. Однако с конца 1995 г., когда вирус попал в среду лиц, практикующих внутривенное введение психоактивных препаратов, число ежегодно регистрируемых случаев ВИЧ-инфекции начало резко расти. Уже в октябре 1999 года в стране было зарегистрировано 21572 ВИЧ-инфицированных, причем 20500 зараженных были выявлены в 1996-1999 гг., а внутривенное введение психоактивных препаратов отмечалось как главный фактор риска заражения у 91% ВИЧ-инфицированных с известным фактором риска заражения. В настоящее время число случаев ВИЧ-инфекции на территории России уже превысило 293 тысячи, и лица, практикующие внутривенное введение наркотических препаратов, составляют основную группу риска.
В связи с вышеизложенным, представляло интерес провести ретроспективный анализ развития эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Российской Федерации, исследовать спектр подтипов ВИЧ-1, циркулирующих в стране, определить роль
различных вариантов вирусов в развитии эпидемического процесса, провести генетический анализ выделенных новых вариантов ВИЧ-1, изучить зависимость вариабельности вирусного генома от пути передачи вируса. Полученные результаты могут быть использованы для решения одной из важных задач здравоохранения -создания новых и контроля качества уже имеющихся средств диагностики, профилактики и лечения ВИЧ-инфекции на территории Российской Федерации, а также для дальнейшего прогнозирования развития эпидемии в стране в ближайшие годы.
Цель работы: С использованием комплекса молекулярно-биологических методов мониторинга эпидемии ВИЧ-инфекции, осуществить генетическую характеристику вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Российской Федерации с 1987 по 2003 гт. и выявить основные закономерности распространения подтипов вируса на разных этапах развития эпидемии.
Задачи исследования:
Определить подтипы вариантов ВИЧ-1, выделенных на территории России в 1987-2003 гт.
Провести анализ нуклеотидных последовательностей геномов новых вариантов ВИЧ-1, выделенных в разных регионах и различных группах риска.
Оценить возможности использования различных молекулярных методов (ИФА, RFLP, НМА) для изучения молекулярно-эпидемиологических особенностей эпидемии ВИЧ-инфекции в России.
Изучить генетическую изменчивость вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в различных группах риска.
5. Разработать алгоритм молекулярно-эпидемиологического мониторинга с
использованием современных молекулярно-биологических методов.
Научная новизна. В результате проведенных исследований с использованием молекулярно-биологических методов исследованы спектры генетических вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа, циркулирующих на территории Российской Федерации на разных этапах развития эпидемии ВИЧ-инфекции.
Определены генетические варианты ВИЧ-1, циркулирующие в группе лиц, использующих психоактивные препараты внутривенно, включая новую циркулирующую рекомбинантную форму CRF03_AB, по-видимому, возникшую на территории России в этой группе риска.
Выявлены и генетически охарактеризованы другие уникальные варианты ВИЧ-1, выделенные в России.
Получены приоритетные данные о степени гетерогенности ВИЧ-1 в группе лиц, использующих психоактивные препараты внутривенно. Показано, что уникальный вариант ВИЧ-1 подтипа А на сегодняшний день доминирует и определяет эпидемиологическую ситуацию в России.
С использованием молекулярных методов показано, что рост числа случаев ВИЧ-инфекции в среде лиц, использующих наркотические препараты внутривенно, привел к выходу варианта ВИЧ-1 подтипа А за пределы данной группы риска через гетеросексуальный путь передачи. Продемонстрировано отсутствие достоверных различий в аминокислотной последовательности области V3 gp!20 между вариантами вирусов, циркулирующих среди потребителей инъекционных наркопрепаратов, и лиц, заразившихся гетеросексуальным путем.
В результате исследований предложен алгоритм мониторинга вариантов ВИЧ-1 на территории России.
Практическая значимость. Получены приоритетные данные, касающиеся распространения разных вариантов ВИЧ-1 на территории Российской Федерации в разных группах риска и при разных путях передачи. Полученные результаты определяют эпидемиологическую ситуацию в стране на ближайшие годы и могут быть использовании при создании новых методов молекулярной диагностики, разработки в будущем средств специфической профилактики, а также при создании оптимальных схем терапии ВИЧ-инфекции.
Получена информация о первичной структуре 228 фрагментов генома новых вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в России в период 1987-2003 гг. Все нуклеотидные последовательности депонированы в международную базу данных GenBank [].
Разработан алгоритм мониторинга распространения вариантов ВИЧ-1 разных подтипов в разных группах риска.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В эпидемии ВИЧ-инфекции в России выделяются два этапа. Первый этап (1987-1995 гт.) характеризующийся небольшим числом случаев ВИЧ-инфекции, связан со множественными заносами генетически гетерогенных вариантов ВИЧ-1,
$
передающихся половым путем. Второй этап (1996-2003 гг.) характеризуется быстрым ростом числа случаев ВИЧ-инфекции и связан с распространением генетически гомогенных вариантов ВИЧ-1 среди лиц, употребляющих психоактивные препараты внутривенно.
2. Анализ клинических образцов 42 субъектов Российской Федерации показал,
что в 1987-1995 гг. в России циркулировали генетические варианты ВИЧ-1,
относящиеся к подтипам А, В, С, D, G, Н, а также циркулирующие рекомбинантные
формы ВИЧ-1 CRF01_AE, CRF02AG и рекомбинанты с генотипами gagDenvG и
gagAenvG, впервые описанные в ходе настоящего исследования.
3. На втором этапе эпидемии в среде лиц, употребляющих внутривенно
психоактивные препараты, выделено три варианта ВИЧ-1: подтипа A (IDU-A),
подтипа В (IDU-B) и рекомбинант с генотипом gagAenvB (IDU-A/B).
Рекомбинант с генотипом gagAenvB, впервые выделенный в Калининградской области и получивший наименование CRF03_AB, является результатом рекомбинации между вариантами ВИЧ-1 подтипов А и В, циркулирующими среди среди потребителей инъекционных наркотиков, и представляет собой первый описанный в литературе рекомбинант, циркулирующий в популяции одновременно с обоими «родительскими» вирусами.
Анализ клинических образцов с использованием молекулярных методов (НМА, секвенирование) из 70 субъектов Российской Федерации, собранных на втором этапе эпидемии ВИЧ-инфекции, свидетельствует о доминировании в России варианта ВИЧ-1 IDU-A.
Варианты ВИЧ-1 IDU-A, циркулирующие в России, характеризуются низкой генетической вариабельностью.
Наблюдается рост генетической гетерогенности вариантов ВИЧ-1 IDU-A в среде лиц, употребляющих внутривенно психоактивные препараты. Степень удаленности от общего консенсуса последовательностей гена env, кодирующих gpl20, наблюдаемая в разных регионах достоверно возрастает.
Варианты ВИЧ-1 IDU-A в настоящее время вышли за пределы первоначально очерченной группы риска и доминируют не только среди потребителей инъецирующих наркотиков, но и среди лиц, инфицированных гетеросексуальным путем .
Получена информация о первичной структуре фрагментов генома новых вариантов ВИЧ-1. Все нуклеотидные последовательности депонированы в международную базу данных GenBank.
Разработан алгоритм мониторинга распространения вариантов ВИЧ-1 разных подтипов в стране в целом, а также среди лиц, употребляющих психоактивные препараты внутривенно и их половых партнеров, позволяющий дифференцировать основные варианты вируса циркулирующие в этой группе риска в России и других странах со сходной эпидемиологической ситуацией.
Внедрение. Результаты исследований внедрены в практику работы Федерального научно-методического Центра МЗ СР РФ по профилактике и борьбе со СПИДом, а также лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.
Разработанный алгоритм мониторинга распространения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди потребителей инъекционных наркотиков, используется в практике работы региональных центров по профилактике и борьбе со СПИДом на территории России, а также в странах ближнего зарубежья со сходной эпидемиологической ситуацией.
Получен патент на штамм Hominis Immunodeftcit Virus ВИЧ-1/Россия ГМ-12-95 (RU1295) подгруппы Lentiviridae семейства Retroviridae для приготовления диагностических и вакцинных препаратов («Штамм Hominis Immunodeficiti Virus (HIV-1) ВИЧ-1/Россия/ГМ-12-95 (RU1295) субтипа В для диагностических и вакцинных препаратов». Патент РФ № 2121'502\ бюллетень № 316, 10 ноября 1998 r.,G01 N 33/569).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 работ, в том числе 36 -статьи (25 в отечественных изданиях и 11 за рубежом) и 22 - тезисы научных конференций (5 в отечественных изданиях и 17 за рубежом).
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
