Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
Регуляция активности клеточных генов при инфекции альфавирусами 5
Общая характеристика альфавирусов 5
Изменение активности клеточных генов при инфекции вирусом
Венесуэльского энцефалита лошадей 11
Противовоспалительные гены 11
Регуляция клеточных генов при инфекции синдбис вирусом 14
Цитокины 14
Cmpecc-акпгивируемые белки 18
Семейство клеточных генов Bcl-2 20
Заключение 30
Экспериментальная часть 32
Оборудование 32
Материалы 32
Реактивы 32
Ферментативные препараты 33
Штаммы вирусов 33
Штаммы бактерий 33
Линии клеток 33
Питательные среды 33
Методы 34
Клетки и вирусы 34
Синтез кДНК 34
Вычитание кДНК 35
Конструирование библиотек и скрининг 38
Радиоактивное мечение фрагментов ДНК 39
RT-PCR 39
Секвенирование и анализ последовательностей 41
Нозерн блот-гибридизация 41
Олигонуклеотидные праймеры 42
Результаты и их обсуждение 43
Клетки, инфицированные ВЭЛ и ВКЭ 43
Конструирование и анализ дифференциальных библиотек 43
RT-PCR анализ 46
Супрессия мРНК гетеро генноядерного рибонуклеопротеина Н при инфекции ВЭЛ 46
Индукция мРНК спермидин/спермин N -ацетилтрансферазы при инфекции ВЭЛ 52
Индуцируемая мРНК SSAT - продукт альтернативного сплайсинга 54
Нозерн блот анализ уровня транскрипции альтернативно сплайсированной мРНК SSAT 56
Альтернативно сплайсированная мРНК SSAT полиаденилируется 58
Механизмы регуляции экспрессии спермидин/спермин ацетилтрансферазы
Регуляция экспрессии спермидин/спермин n'-ацетилтрансферазы при инфекции альфа- и флавивирусами
Механизм апоптоза в клетках с индуцированной экспрессией спермидин/спермин n'-ацетилтрансферазы
Регуляция экспрессии гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина н
Выводы
- Общая характеристика альфавирусов
- Семейство клеточных генов Bcl-2
- Ферментативные препараты
- Индукция мРНК спермидин/спермин N -ацетилтрансферазы при инфекции ВЭЛ
Введение к работе
В последнее время значительные усилия исследователей были направлены на выяснение механизмов взаимодействия вируса с хозяином в ходе вирусной инфекции. Тем не менее, до полной и исчерпывающей картины процессов, протекающих при взаимодействии вирусного и клеточного геномов, еще далеко. Недостаток информации об ответе клетки-хозяина на внедрение вируса препятствует развитию эффективных антивирусных стратегий, что делает необходимым поиск клеточных генов, на экспрессию которых воздействует вирусная инфекция. Тем не менее, до настоящего времени не предпринималось попыток анализа изменений экспрессии генов на уровне полного генома хозяина, и лишь небольшое количество клеточных генов, индуцируемых или супрессируемых в результате вирусной инфекции, идентифицировано к настоящему времени. Недавно был разработан высоко чувствительный и воспроизводимый метод вычитания кДНК, основанный на супрессирующей вычитающей гибридизации. Этот метод позволяет анализировать различия в экспрессии генов между двумя близкородственными клеточными системами на уровне полных геномов. В настоящей работе эта методика была применена для исследования клеточного ответа на инфекцию вирусами Венесуэльского энцефалита лошадей (ВЭЛ, род Alphavirus, семейство Togaviridae) и клещевого энцефалита (ВКЭ, род Flavivirus, семейство Flaviviridae) в двух типах клеточных линий эмбриональной почки человека. Штаммы вирусов и клеточные линии выбирались с целью идентификации дифференциально регулируемых генов и сравнения их экспрессии в клетках, продуцирующих высокие и низкие титры вирусных частиц; а также в клетках, подвергающихся литическому и персистентному типам инфекций.
Общая характеристика альфавирусов
Род Alphavirus в настоящее время включает в себя 26 признанных видов, каждый из которых, в свою очередь, подразделяется на многочисленные географические варианты и штаммы. Отнесение вида к роду Alphavirus основано на серологических кросс-реакциях с одним или более из уже охарактеризованных видов. На основе данных по первичным структурам РНК и серологической кросс-реактивности альфавирусы разделяются на три большие группы: вируса Венесуэльского энцефалита лошадей (группа ВЭЛ), вируса Semliki forest (группа СФВ) и вируса Синдбис (группа СВ). Два обычно изучаемые в лабораториях вируса - СВ и СФВ, считаются авирулентными для человека. Их лабораторные штаммы не вызывают заболеваний в ходе лабораторного инфицирования, за исключением хорошо известного случая энцефалита Semliki forest со смертельным исходом у работника лаборатории (Willems et al., 1979). Тем не менее, природные варианты этих вирусов вызывают заболевания у людей. Альфавирусы имеют икосаэдрический нуклеокапсид, заключенный в плотно прилегающую оболочку, гликопротеиновые компоненты которой образуют икосаэдрическую решетку. Вирион имеет строго упорядоченную структуру, и вариабельность составляет не более 0,5-0,8 нм в любой части частицы (Harrison et al., 1992). Альфавирусный нуклеокапсид содержит одноцепочечный плюс-РНК геном размером около 11,7 нт, связанный с многочисленными копиями одного капсидного белка массой около 30 кДа. РНК внутри нуклеокапсида чувствительна к деградации РНК-азами, а индивидуальные субъединицы капсидного белка взаимодействуют друг с другом, формируя пента- или гексамеры. Диаметр нуклеокапсида СВ составляет 41 нм по данным рассеяния рентгеновских лучей интактными вирусными частицами (Stubbs et al., 1991), 40,4 нм при определении методом дифракции рентгеновских лучей кристаллами нуклеокапсида (Harrison et al., 1992) и 34-38 нм при определении методом электронной микроскопии после выделения нуклеокапсида из вирионов (Coombs and Brown, 1987). Выделенные нуклеокапсиды стабильны и имеют коэффициент седиментации 140S. Так как высокая концентрация соли (более 1 М) вызывает распад капсида (Coombs and Brown, 1989), то для стабилизации капсида и, вероятно, для его сборки важны электростатические взаимодействия, что, в свою очередь, предполагает наличие связывания между высокоосновным N-концевым доменом капсидного белка и вирусной РНК. Оболочка вириона состоит из липидного бислоя, в который погружены многочисленные копии двух кодируемых вирусом гликопротеинов.
Липидный бислой состоит из липидов, происходящих из плазматической мембраны клетки-хозяина, и его состав близок к составу клеточной плазматической мембраны. В случае СВ он имеет толщину 4,8 нм и радиус 23,3 нм . Вследствие сильной изогнутости бислоя внешний слой имеет площадь на 40% больше, чем внутренний слой. Два гликопротеина, Е1 и Е2, имеют молекулярную массу около 50 кДа и заякорены в мембране С-концевой областью. Белок Е2 СВ состоит из 423 аминокислот и содержит плазматический домен из 33 аминокислот, следующий за мембранным доменом. Белок Е1 имеет длину 439 аминокислот и цитоплазматический домен длиной только 2 аминокислоты. Белки Е1 и Е2 гликозилированы, но число и положение гликозидных цепей не вполне консервативны среди альфавирусов. Белок Е1 обычно несет одну-две гликозидных цепи, а Е2 - две или три. У СВ и СФВ белки Е1 и Е2 также содержат ковалентно связанные остатки пальмитиновой кислоты внутри или около мембранного домена (Schlesinger М., 1986). Один из них связан с Е1, и от четырех до шести связанны с Е2. Белки Е2 и Е1 образуют стабильный гетеродимер, который не разрушается при обработке вируса слабыми детергентами. Три гетеродимера Е2-Е1 взаимодействуют с образованием выступа на поверхности вируса (Rice and Strauss, 1982). При слиянии вирусной оболочки с клеточной мембраной в процессе вирусной инфекции гетеродимеры Е1-Е2 распадаются, приводя к образованию мономеров E2 и гомотримеров El (Wahlberg et al., 1992). Гликопротеины вируса образуют икосаэдрическую решетку с триангуляционным числом Т=4 (Paredes et al., 1993). Схема организации и экспрессии генома альфавирусов типа СВ показаны на рис. 1. Геномная РНК вируса Синдбис имеет длину 11 703 нт без учета 5 -концевой Cap-структуры и 3 -концевой поли(А) области. Она подразделяется на две большие части: неструктурный домен, кодирующий неструктурные или репликазные белки, составляющий две трети РНК от 5 -конца, и структурный домен, кодирующий три структурных белка вируса, и составляющий 3 -концевую треть РНК. Неструктурные белки транслируются с геномной РНК в виде одного или двух полипротеинов. Эти полипротеины расщепляются и образуют неструктурные белки nsPl, nsP2, nsP3 и nsP4, а также некоторое количество промежуточных продуктов расщепления, которые обладают важными функциями, отличными от функций конечных продуктов расщепления. У большинства альфавирусов с известной нуклеотидной последовательностью терминирующий ко дон (UGA) следует за nsP3, и продуцируются два полипротеина - Р123 и Р1234. В то же время, у некоторых альфавирусов этот кодон заменен смысловым кодоном, и продуцируется только полипептид Р1234. Структурный домен транслируется в виде полипротеина с субгеномной мРНК (26S РНК, 4103 нт. у СВ). 26S РНК также кепирована и полиаденилирована. Структурный полипротеин процессируется и образует белки оболочки (Е1 и Е2), капсидный белок и два небольших полипептида ЕЗ и 6К. Промежуточная между неструктурным и структурным доменами область вирусного генома содержит последовательность, кодирующую С-конец неструктурного полипротеина, промотор для транскрипции субгеномной мРНК, участок начала транскрипции и 5 -нетранслируемую лидирующую последовательность 26S РНК. Кроме того, имеется нетранслируемые участки на 5 -конце (5 -NTR, 59 нт. для СВ) и З -конце генома (З -NTR, 322 нт. для СВ). 06aNTR содержат сигналы, важные для репликации РНК- В ходе репликации РНК синтезируется минус-копия геномной РНК, являющаяся точным комплементом, за исключением не спаренного G на З -конце (Wengler and Gross, 1982). Эта полноразмерная минус-цепь служит матрицей не только для синтеза дополнительной геномной РНК, но и для транскрипции субгеномной РНК. Альфавирусы реплицируются как в членистоногих, так и в позвоночных животных, приводя к персистентной пожизненной инфекции у членистоногих и к острой, кратковременной инфекции у позвоночных.
Эта ситуация воспроизводится и в культуре клеток: альфавирусы вызывают персистентную инфекцию в клетках москитов, при которой клетки выживают и продолжают продуцировать вирус на низком уровне, однако в клетках позвоночных заражение приводит к цитолитической инфекции. Персистентную инфекцию в клетках москитов значительно труднее изучать ввиду неспособности вируса ингибировать синтез белков хозяина и низкого уровня синтеза вирусных продуктов. В инфицированных клетках позвоночных, напротив, синтез белков хозяина ингибирован, и вирусные продукты продуцируются в больших количествах. Репликация альфавирусов в клетках москитов чувствительна к ингибиторам транскрипции, таким как актиномицин D, и репликация протекает на очень низком уровне в безъядерных клетках (Erwin and Brown, 1983), указывая на то, что функционирующее ядро необходимо для инфекции. В противоположность этому, в клетках позвоночных нормальный уровень репликации может быть достигнут даже в присутствии актиномицина D или а-аманитина, и вирусная репликация проходит почти нормально в безъядерных клетках. Дополнительно следует отметить, что многочисленные мутации вирусного генома оказывают различное влияние на репликацию вируса в различных клеточных линиях, что объясняется взаимодействиями с клеточными белками (Niesters and Strauss, 1990; Kuhn et al., 1992). Перед рассмотрением тонких механизмов взаимодействия вируса и клетки-хозяина необходимо упомянуть об общих закономерностях роста альфавирусов в клеточной культуре, т.к. большая часть из описанных ниже экспериментов проводилась с использованием культур клеток. Кривая роста СВ в клетках цыпленка при 30С показана на рис. 2А. В этом эксперименте клеточная среда менялась каждый час, и измерялось количество вируса, освобождаемое в клеточную среду в течение этого часа. Так как при созреваний вирус отпочковывается через клеточную плазматическую мембрану, он освобождается в культуральную жидкость и не накапливается во внутриклеточных пространствах.
Семейство клеточных генов Bcl-2
В следующем разделе кратко описаны механизмы, лежащие в основе устойчивости клеток нервной системы к альфавирусной инфекции, и пути регуляции генов семейства Вс1-2. Ген Вс1-2 является протоонкогеном, и был первоначально идентифицирован как ген мембранного белка с повышенной экспрессией при фолликулярных лимфомах, несущих хромосомную транслокацию t(14;18) (Cleary et al., 1986). В то же время, повышенная экспрессия Вс1-2 замедляет или блокирует апоптоз, индуцированный многочисленными и часто не связанными между собой физиологическими и патологическими стимулами (Reed, 1994). У позвоночных альфавирусная инфекция обычно приводит к смерти клетки, за исключением нейронов, в которых может установиться персистентная инфекция (Levine et al., 1991; Levine and Griffin, 1992). Хорошо известно, что смерть клеток при заражении альфавирусами наступает вследствие индукции апоптоза, который характеризуется фрагментацией ДНК и морфологическими изменениями клетки (Levine et al., 1993). Клетки ВНК (клетки почки новорожденного хомяка), клетки N18 (клетки нейробластомы мыши) и клетки АТ-3 (аденокарциномы простаты крысы) в ходе инфекции СВ обнаруживают симптомы апоптоза. В то же время, если клетки АТ-3 трансфицировать конструкцией, экспрессирующей ген Вс1-2, то дикий тип СВ больше не индуцирует апоптоз, и вместо этого устанавливается персистентный тип инфекции (Levine et al., 1993). Экспрессия клеточного онкогена Вс1-2, таким образом, защищает клетки от апоптоза еще не до конца изученным способом. Одним из этапов развития нейронов является приобретение ими способности экспрессировать Вс1-2, и, вероятно, зависимость нейровирулентности альфавирусов от возраста клетки может объясняться защищенностью зрелых нейронов от апоптоза. В то же время мутантные штаммы СВ, содержащие гистидин в розиции 55 в домене Е2 (гликопротеиновый домен, необходимый для связывания с клеточной мембраной), могут преодолевать противоапоптическое действие Bcl-2 (Ubol et al., 1994). На рост мутантных штаммов с заменой Н-55 в клетках АТ-3, экспрессирующих Вс1-2, присутствие продукта этого гена не влияет, и они подвергаются апоптозу. Штаммы СВ с заменой Н-55 в большей степени нейровирулентны для взрослых мышей, что подтверждает модель, по которой Вс1-2 защищает нейроны только от менее вирулентных линий вируса.
При инфекции вирусными штаммами с заменой Q-55 клеток АТ-3, экспрессирующих Вс1-2, продукция вирусных частиц снижена до 10%, и апоптоз не индуцируется. Механизм, посредством которого Вс1-2 ингибирует репликацию Q-55-штаммов, неизвестен. Белок Вах, принадлежащий семейству Вс1-2, при повышенной экспрессии может вызывать апоптоз во многих типах клеток, и особенно важен для процесса клеточной смерти при развитии нейронов (Deckwerth et al., 1996; White et al., 1998). Недавно было показано, что некоторые клеточные гены могут влиять на исход инфекции СВ в клеточных культурах. В частности, гены Ьах и bak, которые ускоряют смерть клетки, также ускоряют индуцированный вирусом апоптоз (Levine et al., 1994; Grandgirard et al., 1998). В то же время, сообщалось, что повышенная экспрессия Вах защищает некоторые типы клеток нейронного происхождения от апоптоза (Zhou et al., 1998). Для детального выяснения роли Вах в инфицировании нейронов СВ у мышей, белки Вах и Вс1-2 сравнили по их способности влиять на исход инфекции. Вектор на основе вируса Синдбис, несущий составной белок гемагглютинина (НА) и человеческого Вах (SV-HA-Bax) или человеческий Вс1-2 (SV-Bcl-2) вводили в мозг 2-дневных мышей линии CD-I. В этой системе СВ служил как апоптическим стимулом, так и нейронспецифическим экспрессирующим вектором (Cheng et al., 1996; Levine et al., 1996). Подтверждая предыдущие наблюдения на клеточных культурах и у мышей (Levine et al., 1993; Ubol et al., 1994; Cheng et al., 1996; Levine et al., 1996), показали, что при экспрессии Bcl-2 с помощью вектора СВ, при инфекции выживает более половины (58,8%) мышей. Вах оказался еще более мощным протектором, чем Вс1-2, так как 80,3% мышей выжили после инфекции конструкцией SV-HA-Bax. Подобные результаты были получены и с мышиным Вах, не содержащим N-концевого гемагглютинина (Lewis et al., 1999). Это наблюдение указывет на то, что многочисленные члены семейства Вс1-2 не всегда могут быть однозначно отнесены либо к проапоптическому, либо антиапоптическому типу. Делеция N-концевой части белка Вс1-2 подавляет его антиапоптическую активность и превращает его в мощный проапоптический белок (Hunter et al., 1996; Cheng et al., 1997; Clem et al., 1998). Аналогично, инфекция мышей CB-вектором, содержащим Вах с делецией 33 N-концевых аминокислот приводила к ускорению их гибели по сравнению с мышами, инфицированными контрольным СВ-вектором. В то же время трансфекции клеток ВНК конструкцией, экспрессирующей Вах, укороченный Вах не отличался от полноразмерного по способности напралять клетки к апоптозу. Был сделан вывод, что N-концевая последовательность Вах необходима для его антиапоптической активности, но не для проапоптической. (Lewis et al., 1999). Как упоминалось выше, по мере старения мыши становятся более устойчивыми к индуцированному СВ апоптозу. Подобный эффект имеет место и в стареющей культуре нейронов (Levine et al., 1993; Lewis et al., 1996). Для определения роли Вах в ходе инфекции, дефицитные по Вах мыши были инфицированы СВ в возрасте одной недели, когда в обычных условиях мыши устойчивы к этому вирусу. В отличие от 100% выживаемости мышей дикого типа (Ьах+/+) и 83% выживаемости гетерозиготных мышей (Ьах+/ ), только 16% дефицитных по box мышей выжили после инфекции. Эти данные указывают на то, что Вах является фактором выживания в нейронах мышей. Если отсутствие Вах представляет собой единственный фактор, придающий Ьах А мышам подверженность вирусной инфекции, тогда инфицирование дефицитных по box мышей конструкцией SV-HA-Bax должно существенно увеличить выживаемость, что и было продемонстрировано (Lewis et al., 1999). В этой же работе с использованием тех же векторов на основе СВ сравнили способность Вах ингибировать или ускорять клеточную смерть при инфекции клеточных культур, происходящих из двух различных источников: нейронов гиппокампуса и нейронов дорзальных корневых ганглий (DRG).
Культура нейронов гиппокампуса крысы, инфицированная SV-HA-Bax, содержала на 60% больше выживших клеток, чем культура, инфицированная контрольным вирусным вектором (SV-Bax-reverse), содержащим ген Ьах в антисмысловой ориентации. В противоположность защитному от апоптоза действию на нейроны гиппокампуса, Вах ускоряет гибель нейронов DRG крысы после инфекции СВ. В то же время Вс1-2 предохраняет от апоптоза оба типа клеточных культур. Таким образом, был сделан вывод о проапоптической или антиапоптической функции Вах в зависимости от типа нервных клеток -антиапоптическое действие Вах наблюдалась в клетках гиппокампуса, а проапоптическое - в клетках DRG. Из представленных результатов следует, что Вах может функционировать как антиапоптический гомолог Вс1-2, т.е. блокировать апоптоз в некоторых типах нейронов (например, нейронах гиппокампуса). Эта антиапоптическая активность Вах может являться важным механизмом устойчивости клеток к вирусной инфекции. Логично сделать вывод, что обе эти функции Вах модулируются посредством взаимодействия с неизвестными тканеспецифическими клеточными факторами (Lewis et al., 1999). Не вдаваясь в детали структурной организации белков семейства Вс1-2, необходимо указать на структурные особенности, наиболее важные для их функционирования. Проявление многочисленных функций Вс1-2 связывают с наличием у него четырех белковых доменов (ВН1, ВН2, ВНЗ, ВН4), которые высоко гомологичны для всех членов семейства. Среди них последовательность из 30 аминокислот в N-концевой области, называемая ВН4 (Borner et al., 1994). Bcl-2 и Bcl-xL, один из представителей этого семейства, превращаются в про-апоптотические белки в результате отщепления их N-концевых частей каспазами (Cheng et al., 1997; Clem et al., 1998). Структурный анализ показал, что расщепление родственного Вс1-2 белка Bid каспазой-8 индуцирует конформационные изменения, которые могут способствовать экспозиции его домена ВНЗ (Chou et al., 1999; McDonnell et al., 1999). Домен ВНЗ консервативен у Вах, Bcl-2 и Bcl-xL и, возможно, принимает участие во включении апоптоза.
Ферментативные препараты
Изопропиловый спирт, ацетат натрия, этанол, уксусная кислота, хлорид натрия, едкий натр, цитрат натрия, борная кислота, хлорид калия, ацетат аммония, ацетат натрия - квалификации "хч" и "осч" (Россия). ЭДТА, ПЭГ 6000, глицерин, додецилсульфат натрия, ацетат натрия - фирмы Serva, Германия; бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт - фирмы Difco, США; глицерин, трис-(оксиметил)аминометан (TRIZMA base) - фирмы Sigma,CIIIA; агароза LE Molecular Biology Grade - Promega, США; бромфеноловый синий, ксиленцианол - Bio-Rad, США; дезоксирибонуклеозидтрифосфаты - Boehringer Mannheim, Германия; бычий сывороточный альбумин - New England Biolabs, США; хлорид магния, хлорид кальция - Merck, Германия. Ферментативные препараты Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I - производства Promega, США, ИБХ, Россия; Ферментас, Литва; Т4 ДНК-лигаза - Promega, США; термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus - ИБХ, Россия. New England Biolabs (США). Системы для выделения плазмидной ДНК Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, США); системы очистки продуктов PCR Wizard PCR Preps (Promega, США); система для синтеза кДНК SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech, США); система для супрессионной вычитающей гибридизации PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech, США); система для очистки ДНК из агарозы QIAEXII Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия); система для клонирования фрагментов ДНК pGEM Vector System I (Promega, США). Радиоактивно меченные дезоксинуклеотидтрифосфаты были получены из ИМБ РАН (Россия). Штаммы вирусов Ослабленный штамм ВЭЛ 230 получен из коллекции вирусных штаммов Института Вирусологии РАМН им. Ивановского. Штамм КЭ 205 получен из вирусной коллекции Государственного научно-исследовательского центра вирусологии и биотехнологии "Вектор". Штаммы бактерий Штамм Е. coli: DH-5o F /endAl hsdR17(rK-,mK+) supE44 thi-l recAl gyrA(Naf) relAl A(lacZYA-argF)ul69 (cp80dLacZAM15). Линии клеток Линия клеток 293 (АТСС CRL-1573) получена из National Institute of Health, Bethesda, США, линия клеток RH - из коллекции клеточных культур Государственного научно-исследовательского центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" . Питательные среды Клетки E.coli выращивали при 37С на среде LB (0,5% дрожжевого экстракта, 1% триптона, 1% NaCl). Твердая среда содержала 1,5% агара.
Антибиотики: ампициллин - конечная концентрация 100 мг/л. Для цветной селекции клонов в твердую среду LB добавляли IPTG - до 250 мг/л, X-gal - до 20 мг/л. Методы Выделение плазмидной ДНК, трансформация компетентных клеток E.coli, гель-электрофорез, приготовление стандартных буферов и другие стандартные манипуляции проводились по описанным методикам (Sambrook et al., 1989). Клетки и вирусы Выращивание клеточных культур 293 и RH, а также работы с вирусами ВЭЛ и КЭ выполнялись сотрудниками Государственного научно-исследовательского центра вирусологии и биотехнологии Вектор , Кольцово, Новосибирская обл. Выход инфекционных вирусных частиц измеряли методом вирусного цитопатического эффекта (СРЕ). Иммуноферментный анализ (EIA) проводился при помощи моноклональных антител к ВЭЛ и КЭ и анти-мышиных IgG конъюгатов с пероксидазой (Agapov et al., 1994; Protopopova et al., 1996). Суммарную клеточная РНК из инфицированных и контрольных клеток выделяли методом экстракции реагентом TriPure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) во временных точках 3, 6, 9, 12, 24 и 36 часов после инфекции. Синтез кДНК Первые цепи кДНК были синтезированы из каждого препарата тотальной РНК, используя обратную транскриптазу Superscript II (Life Technologies) and SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech). Один микрограмм тотальной РНК смешивали с 1 мкл праймера для синтеза кДНК (10 мкМ) и обработанной диэтилпирокарбонатом Н20 до конечного объема 3 мкл. Смесь инкубировали 2 мин при 60С и немедленно охлаждали на льду в течение 2-3 мин. Затем добавляли смесь, содержащую 2 мкл 5х буфера для синтеза первой цепи (250 мМ Tris-HCl рН 8,3, 375 мМ КС1, 30 мМ MgCl2), 1 мкл 20 мМ дитиотрейтола (DTT), 1 мкл рапствора dNTPs (10 мМ каждого), 1 мкл 10 мкМ олигонуклеотида SMART II, 2 мкл Н20 и 1 мкл (200 U) обратной транскриптазы Superscript II, и инкубировали при 42С в течение 1,5 часов. Реакцию останавливали замораживанием и образцы кДНК хранили при -20С. Для каждой кДНК проводили предварительную PCR амплификацию для определения количества циклов, за которое должен быть выполнен синтез второй цепи кДНК. Для препаративного синтеза второй цепи кДНК 5 мкл первой цепи смешивали с 30 мкл 10х буфера для полимеразы Advantage 2 (400 мМ Tricine-KOH рН 9,2, 150 мМ КОАс, 35 мМ Mg(OAc)2, 37,5 мг/мл BSA), 6 мкл раствора dNTPs (10 мМ каждого), 15 мкл 10 мкМ PCR праймер (см. ниже), 6 мкл смеси полимераз Advantage 2 (ДНК полимераза KlenTaq-І, ДНК полимераза Deep Vent и антитела TaqStart) (Clontech) в конечном объеме 300 мкл. PCR проводили в амплификаторе Hybaid Temperature cycler в режиме: денатурация 7 с при 95С, отжиг и элонгация 2 мин 30 с при 68С, общее количество циклов - 20. Вычитание кДНК кДНК из инфицированных и контрольных клеток вычитали по методике супрессионной вычитающей гибридизации, как описано в CLONTECH PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech). Расщепление Rsa I По 5 мкг кДНК из инфицированных и контрольных клеток расщепляли Rsa I, очищали экстракцией смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1) и растворяли до конечной концентрации 200-300 нг/мкл. Приготовление тестера Для вычитания в обоих направлениях тестерная кДНК была приготовлена для РНК из инфицированных и контрольных клеток. Были проведены три реакции лигирования адапторов для каждой их тестерных кДНК: первая аликвота лигировалась с адаптером 1, вторая аликвота-с адаптером 2R и третья -с обоими адапторами (контрольное лигирование). Один микролитр (200-300 нг) расщепленной Rsa І кДНК разбавляли 5 мкл Н20. Смесь для лигирования адаптеров готовили смешиванием 10 мкл 5х буфера для лигирования (250 мМ Tris-HCl рН 7,8, 50 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 0,25 мг/мл BSA) и 15 мкл Н20. Для лигирования смешивали 2 мкл разбавленной кДНК, 2 мкл 10 мкМ адаптора 1 или адаптера 2R, и 5 мкл смеси для лигирования. Для контрольного лигирования по 3 мкл каждой смесей для лигирования с адаптером 1 и адаптером 2R смешивали в отдельной пробирке. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,6 мкл (400 ед/мкл, содержит 3 мМ АТФ) ДНК лигазы фага Т4, и лигирование проводили при 16С в течение ночи.
Для проверки эффективности лигирования ДНК тестера из контрольного лигирования, несущую оба адаптера 1 и 2R, PCR амплифицировали с прайм ером PCR primer 1. Визуальное обнаружение продукта PCR в агарозном геле менее чем за 15 циклов PCR свидетельствовало о достаточно высокой эффективности лигирования. Первая гибридизация На первом этапе избыток кДНК драйвера добавляется к каждой кДНК тестера, образцы денатурируются нагреванием и отжигаются. Так как кДНК, присутствующая как в тестере, так и в драйвере, образует гибриды, то остающаяся одноцепочечной и доступная для второй гибридизации кДНК будет обогащена дифференциально экспрессированными последовательностями. Для первого этапа гибридизационные смеси, содержащие 2 мкл расщепленной Rsa I кДНК драйвера, 1 мкл кДНК тестера, лигированной с адаптером 1 или адаптером 2R, и 1 мкл 4х гибридизационного буфера (200 мМ HEPES-Na рН 8,3, 2 М NaCl, 0,8 мМ EDTA рН 8,0) инкубировали при 98С в течение 1,5 мин, а затем при 68С в течение 3 часов. Вторая гибридизация Вторая гибридизация служит для дальнейшего обогащения дифференциально экспрессирующимися последовательностями. Для ее проведения 1 мкл расщепленной Rsa I кДНК драйвера смешивали с 1мкл 2х гибридизационного буфера (см выше) и денатурировали 1,5 мин при 98С. Затем к денатурированному драйверу по очереди добавляли тестер (около 10 нг), лигированный с адаптером 1 и с адаптером 2R и инкубировали при 68С в течение ночи. После этого к реакционной смеси добавляли 200 мкл буфера для разбавления (20 мМ HEPES-Na рН 8,3, 50 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA рН 8,0) и смесь прогревали при 70С в течение 7 мин. PCR с вложенными праймерами Дифференциально экспрессирующиеся кДНК селективно амплифицировали PCR с вложенными праймерами.
Индукция мРНК спермидин/спермин N -ацетилтрансферазы при инфекции ВЭЛ
Увеличение уровня экспрессии мРНК SSAT в инфицированных клетках по сравнению с контрольными подтверждали RT-PCR с праймерами, выбранными таким образом, чтобы амплифицировать почти полную последовательность кДНК. Структура гена SSAT и положение пары праймеров (Р1 и Р2) показаны на рис. 10. RT-PCR с этой парой праймеров (рис.11А-11С) на матрице кДНК, полученной из клеток 293 и RH, показал наличие двух продуктов с длинами около 690 и 790 п.н. В контрольном эксперименте без добавления обратной транскриптазы продуктов PCR не наблюдали. Как видно из рис.11 А-11С, в ходе вирусной инфекции индуцируется только синтез мРНК, приводящей к образованию RT-PCR продукта длиной 790 п.н. Количественный анализ изображения продуктов RT-PCR был выполнен с помощью программы Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics), и показал приблизительно 10-кратное увеличение количества RT-PCR продукта длиной 790 п.н. в случае клеток 293 и 3-5-кратное увеличение для клеток RH через 6 часов после инфекции вирусом ВЭЛ (рис.11А и 1 IB). RT-PCR анализ также выявил, что этот уровень экспрессии поддерживался в клетках 293 до 32 часов после инфекции, практически до того момента, когда большая часть клеток подвергается апоптозу. В клетках RH инфекция ВЭЛ вызывала постоянное увеличение количества 790 п.н. продукта так, что оно становилось почти равным количеству короткого продукта к 36 часам после инфекции. Наблюдаемый эффект был выражен еще более ярко для клеток RH, инфицированных вирусом клещевого энцефалита (рис.11С). Через 24 часа после инфекции количество длинного продукта PCR даже превосходило количество короткого продукта. В то же время, индукция длинного продукта PCR в этом случае была сравнима с индукцией в клетках 293, инфицированных ВЭЛ (10-20 раз). Избыток длинного продукта RT-PCR, вероятно, имел место за счет уменьшения количества короткого продукта. Существует возможность, что наблюдаемый длинный транскрипт представляет собой не кодирующую мРНК, а аберрантный транскрипт, считываемый с противоположной цепи ДНК гена. Так как метод RT-PCR не может различить эти два случая, для проверки происхождения этого транскрипта были выполнены специальные эксперименты. кДНК была синтезирована с использованием каждого из SSAT-специфических праймеров (Р1 или Р2, рис. 10), т.е. при синтезе первой цепи в реакции с обратной транскриптазой в качестве затравки служил один из SSAT-специфических праймеров. В зависимости от использованного праймера первая цепь кДНК должна представлять собой преимущественно копию кодирующей или некодирующей цепей мРНК. Как показано на рис. 12А, только кДНК, синтезированная с кодирующей цепи мРНК, способна приводить к образованию как длинного, так и короткого продуктов RT-PCR.
В следующих экспериментах нами было подтверждено, что накопление в ходе вирусной инфекции продукта, соответствующего длинному PCR-ампликону, является вирус-специфической особенностью. Эти эксперименты проводились с использованием кДНК, полученной на матрице суммарной РНК из клеток герминогенной опухоли человека семиномы, в качестве контроля при этом служила суммарная РНК из нормальной тестикулярной паренхимы. Общий уровень транскриптов SSAT в клетках семиномы был повышен приблизительно в 10 раз (рис. 12В) по сравнению с нормальными клетками тестикулярной паренхимы. Тем не менее, в противоположность инфицированным вирусами клеткам, не было обнаружено значительного накопления длинного продукта RT-PCR. По аналогии с предыдущими экспериментами, контроль на одинаковое содержание кДНК в тестируемых образцах осуществлялся амплификацией с праймерами к гену клатрина. ИНДУЦИРУЕМАЯ мРНК SSAT - ПРОДУКТ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА Видимый размер короткого продукта RT-PCR (около 690 п.н.) приближается к ожидаемому размеру для матрицы кДНК SSAT человека (679 п.н.). Для выяснения точной структуры обоих транскриптов полосы ДНК после RT-PCR были разделены в агарозном геле, вырезаны, элюированы из агарозы, клонированы и секвенированы. Нуклеотидная последовательность короткого продукта RT-PCR оказалась идентичной последовательности мРНК SSAT человека, кодирующей активный фермент (GenBank Accession № NM002970). В то же время, нуклеотидная последовательность длинного продукта RT-PCR содержала дополнительную вставку длиной 110 п.н., которая соответствовала по последовательности альтернативно сплайсированной мРНК, содержащей дополнительный экзон (рис. 13), и образовывала, таким образом, фрагмент RT-PCR длиной 789 п.н. Оба альтернативных экзон-интронных перехода подчинялись правилу GU/AG. Более того, анонимная человеческая мРНК с той же самой экзон/интронной структурой, что и мРНК, соответствующая ферментативно-активному белку, была обнаружена среди нуклеотидных последовательностей в GenBank (Accession № AL050290, человеческая анонимная кДНК DKFZp586G1923). В то время, как нормальный транскрипт кодирует активный белок SSAT из 171 аминокислоты, альтернативно сплайсированный транскрипт, из-за присутствия в последовательности нового экзона трех терминирующих кодонов в соответствующей рамке, может приводить только к образованию укороченного полипептида из 71 аминокислоты (рис. 13). Шестьдесят восемь N-концевых аминокислотных остатков этого гипотетического полипептида идентичны аминокислотным остаткам белка SSAT, в то же время последние три аминокислоты отличаются. Следует также добавить, что альтернативно сплайсированный транскрипт содержит и другую открытую рамку считывания, которая кодирует 96 аминокислотный полипептид протяженностью от 76-го аминокислотного остатка до С-конца белковой последовательности SSAT (рис. 13). Тем не менее, продукция этого полипептида едва ли возможна из-за отсутствия последовательности для связывания рибосом или сайтов повторного связывания рибосом рядом с ATG-кодоном.
Для подтверждения результатов, полученных методом RT-PCR, мы применили Нозерн блот-гибридизацию. Суммарную РНК, полученную через 9 часов после инфекции, и РНК из неинфицированных контрольных клеток разделяли в агарозным геле, содержащем формальдегид, и денатурированную РНК переносили на нейлоновую мембрану. Предварительные эксперименты по Нозерн-гибридизации показали, что разрешающая способность формальдегид- агарозного геля недостаточна для достоверного разделения двух альтернативных форм мРНК SSAT, различающихся только на 110 п.н. по длине (рис. 1 ID, нижний). В связи с этим был получен специфический зонд, гибридизующийся только с альтернативно сплайсированной мРНК. Для этого были синтезированы специфические праймеры к дополнительному экзону (РЗ и Р4, рис. 10), и с их помощью получен фрагмент дополнительного экзона с длинного RT-PCR продукта в качестве матрицы. Полученный фрагмент был очищен, радиоактивно # мечен и использован в качестве гибридизационного зонда (рис.1 ID, верхний). Как видно на рисунке, уровень транскрипции альтернативно сплайсированной мРНК SSAT (длина около 1,4 т.п.н.) значительно возрастает в ВЭЛ-инфицированных клетках по сравнению с неинфицированным контролем. В то же время не наблюдается существенной индукции пре-мРНК SSAT (длина около 3,5 т.п.н.). Значительный интерес представлял вопрос о том, полиаденилируется ли альтернативно сплайсированная мРНК SSAT. Для его выяснения сравнивалось количество RT-PCR продуктов, полученных при амплификации первых цепей кДНК SSAT, синтезированнных либо с помощью олиго(с1Т)-праймера, либо рассеянной затравки. Если альтернативно сплайсированная SSAT мРНК не полиаденилирована, то соответствующая полоса при RT-PCR должна быть значительно слабее при использовании в качестве матрицы кДНК, затравленной с олиго(ёТ). В противоположном случае, соотношение обоих сплайсинговых вариантов будет тем же самым вне зависимости от выбранных затравок. Как показано на рис. 12С, это соотношение интенсивности полос RT-PCR для матриц, затравленных при помощи олиго(ёТ), незначительно отличается от этого соотношения для матриц, полученных при помощи рассеянной затравки (см. рис. 11). Следовательно, альтернативно сплайсированная SSAT кДНК может быть полиаденилирована и, возможно, транспортируется из ядра в цитоплазму.
