Введение к работе
Актуальность темы
Bacillus thuringiensis - аэробная почвенная
грамположительная бактерия, в ходе споруляции способная образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков дельта-эндотоксинов (также называемых Cry белками). Эти белки обладают высокой специфичностью токсического действия в отношении ряда насекомых и одновременно безвредны для животных и человека, что позволило создать на их основе экологически безопасные инсектицидные препараты (около 90-95% рынка биопестицидов) и использовать как альтернативу химикатам для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства.
Коммерческий интерес к биологическому контролю над насекомыми усилил поиск новых изолятов В. thuringiensis, содержащих токсины к широкому спектру насекомых. Это привело к значительному увеличению числа имеющихся в коллекциях штаммов, зачастую повторному выделению и депонированию штаммов под другими названиями. Таким образом, назрела необходимость в поиске новых подходов к систематизации бактериальных культур.
Наиболее широко применяемый метод подвидовой классификации В. thuringiensis основан на Н-серотипировании, иммунологической реакции с бактериальными жгутиковыми антигенами, с дополнением биохимических данных. На сегодняшний день штаммы В. thuringiensis разделены на 84 сероварианта (серовара). Однако, многие штаммы внутри серовара не одинаковы по биохимическим, генетическим и токсическим свойствам. Так, некоторые серовары, например В. thuringiensis ssp. israelensis, включают штаммы с практически одинаковыми свойствами, другие - с широким спектром свойств. Например, В. thuringiensis ssp. morrisoni включает штаммы, токсичные для личинок комаров, жуков и бабочек. Кроме того, серотипирование не пригодно для неподвижных и самоагглютинирующих штаммов, а процесс агглютинации наблюдается и у некоторых штаммов В.сегеш. Помимо этого, существующая схема серотипирования не обеспечивает никакой информации о генетическом родстве штаммов.
Таким образом, существует необходимость в специфическом типировании В. thuringiensis, для анализа распространения охарактеризованных штаммов в окружающей среде и регистрации новых изолятов.
Целью данной работы являлось всестороннее изучение штаммов энтомопатогенных бактерий В. thuringiensis, входящих в коллекцию Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН, с помощью молекулярно-биологических и биохимических методов, биоанализа на насекомых, а также проведение типирования данных штаммов методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
характеризация штаммов В. thuringiensis по наличию определенных генов эндотоксинов;
характеризация белкового состава спорокристаллических смесей штаммов В. thuringiensis;
характеризация штаммов В. thuringiensis по инсектицидной активности;
типирование штаммов В. thuringiensis методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD-метод);
филогенетический анализ штаммов В. thuringiensis на основе данных RAPD-ПЦР анализа.
Научная новизна и практическая ценность работы Штаммы Bacillus thuringiensis из коллекции Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и из музея Института систематики и экологии животных СО РАН охарактеризованы по наличию определенных генов 8-эндотоксинов, инсектицидной активности, белковому составу спорокристаллических смесей. Проведен филогенетический анализ штаммов.
Из 73 исследованных штаммов Bacillus thuringiensis инсектицидной активностью обладали 28 штаммов. Они могут стать основой для создания энтомопатогенных препаратов. Выявление генов 5-эндотоксинов позволит проводить поиск инсектицидной активности штаммов уже на более узком спектре
насекомых, что значительно облегчит выявление перспективных препаратов. Атипичные, неинсектицидные Штаммы, в том числе штаммы из Долины гейзеров, Камчатка, представляют интерес для исследования их цитоцидальной активности и с целью возможного использования, в дальнейшем, в противораковой терапии.
Положения, выносимые па защиту
При исследовании штаммов бактерии Bacillus thuringiensis из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН выявлено и охарактеризовано 28 штаммов, обладающих инсекцицидной активностью.
При оценке инсектицидности бактерий В. thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только-форму, но и размер кристаллов 5-эндотоксинов.
Генетическое типирование 73 штаммов В. thuringiensis с помощью метода RAPD-фингерпринтинга выявило 37 RAPD-типов. Проведенный филогенетический анализ позволяет оценить генетическое родство штаммов как внутри, так и между подвидами.
Апробация работы и публикации
По материалам диссертации опубликовано две статьи в реферируемых научных журналах. Полученные результаты были представлены на: Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), Третьей международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2004), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), Третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), 38th annual meeting Society for Invertebrate pathology, (Anchorage, 2005), 39th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, 9th International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, (Wuhan, China, 2006), 2-om Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», (Иркутск, 2007), IV Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», (Минск, 2008).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Библиография включает 210 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 7 таблицами.
