Содержание к диссертации
Введение
II. Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации . 8
III. Дифференциальное окрашивание хромосом. 21
1. Q-дифферєнцкальное окрашивание (Q - бэндинг). 21
2. С-бэндинг. Гетерочроматин . 36
3. G-бэндинг 48
4. R- и Т- окрашивание. 51
5. Окрашивание серебром - ЯОР (К(Ж)-бэндинг. 52
6. Метод N-дифференциального окрашивания хромосом. 53
7. Cd- и Kt- окрашивание. 54
8. Высокоразрешающий бэндинг. 56
9. Нуклеазный бэндинг. 57
10. Выявление сестринских хроматидиых обменов. 60
11. F-бэндинг 62
12. Ну-бэндинг. 63
13. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными для AT и ГЦ пар оснований. 64
14. Итоговые замечания по рассмотрению дифференциального окрашивания хромосом. 66
15. Молекулярные механизмы дифференциального окрашивания и природа бэидов. 70
IV. Другие методы хромосомного анализа. 81
1. Методы гибридизации in situ. 81
2. Микродиссскция хромосом и их отдельных участков. 87
3. Методы анализа изображении для цито генетического анализа и физического картирования .
V. Некоторые проблемы, решаемые с помощью хромосомного анализа
1. Видообразование и хромосомный анализ.
2. Исследование хромосом растений с помощью методов дифференциального окрашивания.
3. Исследования хромосом растений, проводимые в Лаборатории функциональной морфологии хромосом института Молекулярной биологии им. В,А.Энгельгардта РАН.
VI. Заключение.
VII. Выводы.
VIII. Библиография.
- Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации
- С-бэндинг. Гетерочроматин
- Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными для AT и ГЦ пар оснований.
- Методы анализа изображении для цито генетического анализа и физического картирования
Введение к работе
Хромосомный анализ - мощный инструмент генетики и молекулярной биологии, направленный на изучение генома. Его история насчитывает свыше ста лет - с тех пор, как В. Флемминг в 1879 году впервые наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки аксолотля. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества самых разнообразных объектов как животного, так и растительного происхождения. Достигнутые успехи определялись в первую очередь совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Первостепенное значение имело развитие техники микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Естественно, что в течение всего этого времени неоднократно предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа и определения его места в биологии и медицине (С.Г.Навашшг, 1916, 1921; Левицкий, 1931; White, 1978; Дарлингтон, Л а Кур, 1980; Восток, Сампер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995).
Хромосомный анализ является органической частью геномного анализа. Впервые термин «геном» был предложен в 1920 году Г. Винклсром (Winkler, 1920) для обозначения гаплоидного набора хромосом данного вида. Естественно, что на этом этапе понятия хромосомного и геномного анализа практически совпадали. По мере развития генетики и молекулярной биологии понятие геномного анализа претерпевало значительные изменения. Геномный анализ включает в себя много разделов в зависимости от методов исследования. Так в цитогенетике растений традиционно под геномным анализом подразумевалось исследование филогенетического родства видов и определение геномного состава полиплоидов в пределах родственных систематических групп на основе анализа конъюгации хромосом в мейозе гибридов (Rosenberg, 1909), Па современном этапе термин «геномный анализ» используется в более широком смысле, он также подразумевает, в первую очередь, выявление первичной структуры генома, т.е. определение последовательностей всех составляющих его нуклеотидов; включает в себя установление происхождения видов и оценку генетического родства геномов, на основании анализа различных классов уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК, структуры хромосом и сравнительного генетического картирования, структуры генов и спейсерпых последовательностей (Friebc, Gill, 1996).
Последние достижения в геномном анализе неразрывно связаны с использованием и развитием методов молекулярной биологии: различные варианты амплификации ДНК (RFLP, PCR и др.) и цитологических подходов (дифференциальное окрашивание хромосом и гибридизация in situ, сравнение структуры геномов с легко изменяющимися (полиморфными) участками). Понятно, что ни один из вышеперечисленных методов не является всеобъемлющим и безошибочным. Эффективность методов определяется степенью, в которой они решают поставленные задачи, в частности характеризуют прямо или опосредованно сходство ДНК между видами. Несмотря на все эти достижения хромосомный анализ остается крайне важной, а в отношении некоторых объектов основной частью геномного анализа.
Традиционно хромосомный анализ начинается с установления числа хромосом и определение их размеров и морфологии (цснтромерный индекс, наличие и положение вторичных перетяжек). Впоследствии эти подходы были дополнены хромосомным бэндиигом и гибридизацией in situ для анализа не только митотических, но и мейотических хромосом. Помимо этого методы геномного анализа включают в себя анализ мейотической коныогации хромосом в гибридах, микроспектрофотометрию окрашенных по Фельгену препаратов, проточную цитометрию, сравнительное картирование ядерного, пластидного и митохондриалыгого геномов, микродиссекцшо и микроклонирование, системы компьютерного анализа изображения.
Представляет интерес соотношение понятий хромосомный анализ и кариология. В строгом смысле кариология - это наука о ядре, т.е. понятие более широкое, чем хромосомный анализ. Однако некоторыми авторами (White, 1978; Воронцов, 1980) эти понятия практически отождествляются. Хромосомный анализ - составная часть кариологического анализа - проводится с помощью арсенала различных методов. По мерс появления новых методов расширяются возможности и эффективность хромосомного анализа.
Хромосомный анализ начал формироваться давно. На каждом этапе создания новых технологий, используемых в нем, хромосомный анализ определялся по-разному. Поначалу он представлял собой описание морфологии хромосом для целей ботаники, зоологии и медицины, В дальнейшем он расширился за счет появления новых методов анализа и увеличения числа исследуемых объектов.
В настоящее время хромосомный анализ - это не просто описание кариотипа, а изучение хромосом с помощью комплекса методов, позволяющих получать разностороннюю информацию об изучаемом объекте. Наиболее интенсивно развиваются исследования в тех областях, где они могут быстро приносить практическую пользу (медицинская цитогенетика, включая пренатальную диагностику наследственных заболеваний, селекция новых сортов растений и пород животных).
В то же время, последнее десятилетие ознаменовалось стремительным прорывом в развитии науки, связанным с расшифровкой генома человека и ряда других видов животных, растений и микроорганизмов. Таким образом, созданные ранее классификации хромосомного анализа по ряду объективных причин не могли охватить достижений молекулярной биологии последних лет. С другой стороны, прогресс в определении первичной структуры генома лег в основу создания принципиально новых методов и подходов к юучению хромосом. В связи с перечисленными фактами, назрела насущная необходимость пересмотра истории хромосомного анализа в свете современных представлений и определения его места в биологической науке сегодняшнего дня. Это и послужило целью диссертационной работы. Цель работы заключается в рассмотрении истории хромосомного анализа с учетом достигнутого прогресса в исследованиях геномов, выделении отдельных периодов его развития и определении наиболее перспективных направлений, конкретно в решении следующих задач:
- описании ключевых этапов развития хромосомного анализа за весь период его существования;
рассмотрении основных методов исследования хромосом, характеристики наиболее широко используемых их модификаций, описании истории создания и области применения;
- определении места и роли хромосомного анализа в геномную эру;
выделении основных этапов развития хромосомного анализа.
Развитие хромосомного анализа, возможность периодизации
Различными авторами предпринимались попытки рассмотрения истории хромосомного анализа (White, 1978; Дарлингтон, Ла Кур, 1980; Босток , Самнер, 1981; Прокофьева-Бельговская, 1986; Hsu 1992, 1995). Наиболее полную классификацию этапов его развития предложил известный австралийский цитогенетик и эволюционист М. Дж. Уайт в 1978 году (White, 1978). Он выделил шесть этапов развития кариологии: альфа-кариология - определение числа и размеров хромосом; бэта-кариология - детализация признаков кариотипа: определение относительной длины плеч хромосом, положения центромеры, выявление половых хромосом и пр.; гамма-кариология - идентификация специфических районов хромосом с использованием методов дифференциальной окраски; дельта-кариология - определение локализации сателлитной ДНК, ядрышкообразуюших районов (рДНК), локусов, содержащих гены 53-рибосомной РНК; эпсилон- и зета-кариологии - выявление активно работающих участков на хромосомах типа «ламповых щеток» и политенпых хромосомах, что позволяет получить детальные карты строения и функционирования хромосом. Классификация Уайта получила широкую известность в нашей стране благодаря ее пропаганде в работах Н.Н. Воронцова (Воронцов, 1980; 1986). Необходимо отметить, что эта классификация достаточно условна, поскольку она исторически не выдержана, и ряд направлений хромосомного анализа, выделенных им в качестве самостоятельных, развивался параллельно. Так исторически эпсилон- и зета-кариологии начали активно развиваться раньше дельта-кариологии, возникающей и активно развивающейся на наших глазах. Если быть точными, то Уайт описывает не этапы развития кариологии, а разделы хромосомного анализа. А конкретнее - вышеперечисленные этапы развития кариологии представляют собой детализацию наших знаний о хромосомах и кариотипс в целом. Поэтому классификация Уайта выглядит несколько однобокой. Она основана скорее на методических подходах изучения хромосом, и при этом в нее по историческим причинам не входят новейшие методы.
Однако она позволяет судить по крайней мере о некоторых важных этапах развития учения о хромосомах. Новейшая, молекулярная, кариология зарождается лишь сейчас; ее задачи - изучение молекулярной организации и функционирования хромосом. Современный хромосомный анализ - понятие достаточно условное. Так при исследовании хромосом человека анализ позволяет судить о множестве черт и особенностей хромосом: содержании в них ДНК, рисунке их окрашивания, наличии перестроек вплоть до выявления генных кластеров и индивидуальных генов. В то же время для многих организмов, в том числе для водорослей, мхов, грибов, лишайников большой проблемой является само определение числа хромосом. На самом примитивном уровне остается пока и изучение хромосом многих простейших, грибов, некоторых групп беспозвоночных и многих групп высших растений (Bennett, 1998). Между тем, по классификации Уайта, этот этап можно отнести к альфа - кариологии, которая зародилась еще в конце 19 века. С 1831 года, т.е. с .момента открытия английским ботаником Робертом Броуном клеточного ядра, началось активное изучение как его химического состава, так и функционального значения отдельных структур и компонентов. Уже в 1868 году Мишер выделил ДНК, а несколько позднее Коссель открыл гистопы. Параллельно шло развитие генетики (работы не были связаны с наблюдением хромосом). Несмотря па то, что в 1865 году была опубликована фундаментальная работа Грегора Менделя, в которой он сформулировал законы наследственности, свое официальное начало генетика ведет с 1900 года после переоткрытия законов Менделя тремя исследователями: Гуго Де Фризом, Карлом Корренсом и Эрихом Чермаком, В конце 70-х гг. XIX века поведение хромосом изучалось многими исследователями, но наиболее значительный вклад в эту область знания внесли Э. Страсбургер и В. Флемминг. В 1880 году Флемминг наблюдал продольное расщепление хромосом при делении клетки, а двумя годами позже он предложил термин «митоз». В принципе этот период развития хромосомного анализа ознаменовался установлением самого факта существования хромосом и их описания. В 1903 - 1904 гг. В. Сэттон и Т. Бовери (Sutton, 1903; Boveri, 1904) показали, что именно хромосомы являются материальными носителями мснделевских факторов наследственности. С этого времени начался новый этап изучения хромосом. В последующие годы хромосомы были обнаружены и описаны у множества других объектов. Достигнутые успехи определялись совершенствованием оборудования и методик приготовления хромосомных препаратов. Важнейшее значение имело развитие методов микроскопирования и усовершенствование самих микроскопов. Среди важнейших этапов развития микроскопических методов Дарлингтон и Ла Кур (Дарлингтон, Ла Кур, 1980) выделяют создание: И водоиммерсионных объективов (1850г.) Ш осветителя для микроскопа (1873г., Э. Лббе - ведущий конструктор фирмы Карл Цейсе) И масляной иммерсии и масляноиммерсионного объектива (1878г., Э. Аббе) И апохроматического объектива (1886г.) Таким образом к началу 20 века было завершено создание светооптического микроскопа, позволяющего достигнуть разрешения до 0.2 мкм. Последующие сто лет стали веком совершенствования микроскопической техники, в частности были созданы: объективы с широким полем зрения; фазово-контрастная (Mickel, 1941; Burch, Stock, 1942) и электронная микроскопия; создание и развитие флуоресцентной микроскопии; использование электронной микроскопии для исследования политенных хромосом. создание и активное использование компьютерных систем анализа изображения;
С-бэндинг. Гетерочроматин
Успехи в разработке и использовании Q - метода явились мощным стимулом к поиску, созданию и использованию новых методов дифференциальной окраски хромосом. Как было рассказано выше, в ряде работ были описаны случаи неоднородности окраски хромосом по длине. После публикации статей по Q- дифференциальному окрашиванию хромосом на проявляющееся неоднородное окрашивание хромосом стали обращать более пристальное внимание. Так 1970 году был случайно открыт метод дифференциальной окраски гетерохроматических районов хромосом при проведении экспериментов по гибридизации in situ меченной тритием сателлитпой ДНК на хромосомах мыши (Pardue, Gall, 1970). Авторы заметали, что центромерные участки хромосом окрашивались при этом красителем Гимза более интенсивно, чем другие. Позже процедура обработки была модифицирована (Arrighi, Hsu, 1971; 1974) и получила название С- окраски (С - banding от «centromeric heterochromatin», позже это стали трактовать как "constitutive" heterochromatin). Прежде, чем детально описывать историю возникновения этого метода дифференциального окрашивания, необходимо в краткой форме рассмотреть понятие о гетерохроматине. Подробно этот вопрос обсуждается в фундаментальной монографии А.А, Прокофьсвой-Бсльговской (1986). Наши знания о гетерохроматине и А.А. Прокофьева-Бельговская историю их интерпретаций можно свести до определенной степени к известной притче о двух слепых, которые ощупывая с разных сторон слона, дают заведомо противоречивое описание этого животного. Лежащий в основе корень «гетеро» означает различие в свойствах хромосом.
Такую дифференциацию хромосом Drosophila melanogaster и D. fumbris в 30-х гг. описал Хсйтц (Heitz, 1930; 1933a,b). Для обозначения отличающихся по степени окрашивания отдельных хромосом или же их участков Хейтц предложил термины «эухроматин» и «гетерохроматип». Основываясь на цитологических наблюдениях (для работы с хромосомами использовались типичные красители, в частности, реактив Шиффа в реакции Фельгена), Хейтц заключил, что эу- и гетерохроматические районы клетки по-разному участвуют в ее метаболизме. Компактные гетерохроматические районы хромосом должны отличаться от эухроматических районов меньшей физиологической активностью, т.е. являются «пассивными», в отличие от «активных» районов эухроматина (Heitz, 1929, 1932). Хейтц заключил, что подавляющая масса активно работающих, генов расположена в эухроматических частях хромосомы. Его результаты согласовались с генетическими данными, полученными X. Мёллером и Т. Пайнтером (Muller, Painter, 1932) на дрозофиле, где обнаруженные инертные районы хромосом совпали с гетерохроматическими участками, описанными Хейтцем. Уже на начальном этапе исследований гетерохроматических районов хромосом было обнаружено, что они широко распространены. Оказалось, что наибольшего развития они достигают в системах половых хромосом животных и растений. У дрозофилы из гетерохроматина почти полностью состоит Y хромосома и значительная часть X хромосомы.
Гетерохроматические районы обнаруживаются в области ядрышкового организатора и в районе центромеры. Второй период в исследованиях гетерохроматина, по мнению А.А. Прокофьевой -Белыовской, ознаменовался установлением Хейтцем, Пайнтером, Бауэром и Бриджесом в начале 30-х годов хромосомной дифференциации лентовидных политенных хромосом в ядрах слюнных желез двукрылых насекомых (Прокофьева-Бсльговская, 1986), которые были разделены на эу- и гетерохроматип. К 70-м годам было сформулировано следующее определение: гстерохроматин представляет собой специфические участки хромосом, которые: 1) остаются гетеропикнотичными в течение интефазы; 2) генетически неактивны; 3) реплицируются асинхронно с эухроматическими частями хромосом, а именно в конце S периода. Гстерохроматин является важнейшим, неотъемлемым элементом генома эукариот, несмотря на то, что многие важные вопросы о функции и структуре остаются нерешенными. Многие ученые вообще стали применять термин «junk» (от англ. хлам, помойка) к этой части генома. Эти утверждения основывались отчасти и на анализе структуры ДНК гетерохроматиновых районов. Гстерохроматин содержит, хотя и де всегда, повторяющиеся последовательности, включая сателитную ДНК и транспозоны. О возможной структурной и функциональной значимости гетерохроматпна стали все чаще говорить многие ученые. Более детальное изучение молекулярной природы специфических гетерохроматиновых районов, в основном компонентов теломер и центромер, сделало вышеприведенное определение гетерохроматина спорным. Поэтому для лучшего понимания природы гетерохроматина недостаточно изучения гетерохроматических хромосом или районов хромосом, включающих теломеры и центромеры. Столь же важно детальное изучение молекулярных механизмов возникновения так называемых молчащих генов дрожжей и других организмов, а также мозаичного эффекта, зависящего от положения гена. Термин «молчащие гены» достаточно новый. Он был предложен в 1975 году для обозначения транскрипционной инактивации НМ участков МАТ локуса дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Позже было обнаружено, что подобная модификация гетерохроматина наблюдается ни только в данных участках, но и в теломерах; что приводит к мозаичной экспрессии соседних генов. При этом структура хроматина в теломерах почти идентична таковой в НМ локусе. Наблюдения над дрозофилой (Dorcr, Hcnikoff, 1994, 1997) привели к заключению, что структурные свойства гетерохроматина могут распространяться па другие хроматиновые районы, которые находятся в контакте с инактивиро ванным и доменами. Детали молекулярных механизмов, вовлеченных в этот процесс, пока не ясны. Недавние наблюдения показали, что определенные последовательности ДНК могут играть главную роль вэтой инактивации.
Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными для AT и ГЦ пар оснований.
Было обнаружено, что ЛТ-богатые участки, ярко флуоресцирующие после обработки либо акрихином либо акрихин-ипритом, соответствуют Ну- -бэпдам, тогда как Ну+ бэнды соответствуют Q- -бэндам (Grealhuber, 1973; 1974; 1975). Т.к. С-окрашивапие выявляет большинство участков конститутивного гстсрохроматипа, тогда как лишь некоторые из них можно обнаружить при Ну-бэпдингс, применение последней техники не нашло сколько-нибудь широкого распространения. Тем не менее, Ну-бэндинг можно использовать для выявления разных типов конститутивного гетерохроматина. 13. Флуорохромирование препаратов хромосом красителями, специфичными дли AT и ГЦ пар оснований.
Используя ЛТ- и ГЦ- специфичные флуорохромы (DAPI, хромомицин и близкий ему митрамицин, соответственно), а также параллелыгую окраску препаратов специфичным к ГЦ парам оснований не флуоресцирующим соединением {антибиотик актиномицин D), Швейцер разработал метод обратного флуоресцентного бэндипга (Schweizer, 1976) на хромосомах растений (Viciafaba, Scilla siberica, Ornithogalum) и человека. Обработка DAPI в сочетании с ГЦ-специфичным нефлуоресцирующим антибиотиком актиномицин ом D привела к появлению флуоресцентной картины, аналогичной окрашиванию акрихином, акрихин ипритом и Hoechst. В дальнейшем эти работы получили развитие. Имеющиеся сведения могут быть суммированы следующим образом.
Некоторые флуорохромы связываются специфично с AT парами оснований, такие как DAPI (4 ,6-diamidino-2-phenylmdole) и близкие ему DIPI и Hoechst 33258. АТ-специфичные флуорохромы приводят к появлению картины флуоресцентного Q - бэндинга, правда це очень точной, т.к. интенсивность флуоресценции прямо параллельна АТ-насыщснности (содержанию AT) каждого бэнда. Другие флуорохромы связываются специфически с ГЦ парами оснований, как хромомицин. Нефлуоресцирующис красители способны также демонстрировать специфический для определенных пар оснований (AT или ГЦ) бэндинг. Мстиленовый зеленый (метуї green) и дистамицин Л специфичны для ЛТ пар оснований, тогда как актиномицин D связывается преимущественно с ГЦ парами. Подобно этому специфичные к ГЦ флуорохромы (микромнцин и близкие его аналоги хромомицин и олнвомицин и 7 амоноактиномицин D) приводят к появлению картины так называемого обратного бэндинга - R -бэндинга (от англ. reverse).
Усиления флуоресцентных образцов Q - бэндинга можно добиться в случае, когда хромосомы обрабатывают совместно с ЛТ - специфичным флуорохромом (DAPI) и ГЦ -специфичным нефлуоресцентным дигандом (актиномицин D). Получение очень точных картин R - бэндинга можно добиться комбинируя хромомицин и АТ-специфичный краситель метиленозый зеоеный. В основе такого противоположного окрашивания лежит способность нефлуоресцентпого красителя гасить флуоресценцию флуорохрома путем переноса энергии (этот эффект имеет место, лишь когда различные типы окрашенных молекул находятся в непосредственной близости друг от друга). Этот метод дает очень четкие картины бэндинга (Scweitzcr, 1976; 1979). Более того, автором было подмечено, что при окрашивании хромосом двумя AT - специфичными лигандамн (DAPI и дистамицином А) хорошо прокрашивались не только основные бонды, но и более мелкие (в частности это было продемонстрировать на 9,15 и Y хромосомах человека).
Флуоресцентный бэндинг широко используется при анализе хромосом животных (идентификация хромосом рыб Rivulus marmoratus с использованием хромомицина Аз и DAPI - Sola et al., 1997) и растений (идентификация хромосом лилейных Scilla autumnalis, Allium subvillosum, Allium сера и Muscari comosum с помощью DAPI и хромомицина Аз -Lozano et al., 1990; флуоресцентное окрашивание хромосом кукурузы актипомиципом D и DAPI - Khuong, Schubert, 1990). Исследован кариотип сосны Pinus elliottii (2п=2х=24) при окрашивании хромосом хромомицином Аз (ГЦ-спсцифичность) и DAPI (АТ-специфичность) [Doudrick. et al., 1995]. Успешно идентификацированы хромосомы четырех видоо кедра Cedrus (С. atlantica, С. brevifoUa, С, deodara и С. Ubani) с использованием лсхста 33258 (АТ-специфичность) и хромомицина Аз (ГЦ-спецнфичность) [Dagher-Kharrat ctal.,2001]. 14. Итоговые замечания по рассмотрению дифференциального окрашивания хромосом.
Подводя итоги рассказанному о методах дифференциального окрашивания хромосом, следует отметить, что период с конца 60-х гг. до середины 80-х характеризовался созданием многих вариантов методов дифференциального окрашивания. Параллельно Q-методу, появились новые методы изучения хромосом животных и человека, такие как: окрашивание препаратов хромосом флуорохромами, специфичными для AT или ГЦ пар оснований; С -бэндинг; G - бэндинг; R - бэндииг; N - бо «дин г; дифференциальная окраска сестринских хроматид, позволяющая выявлять сестринские хроматидныс обмены; избирательная окраска азотнокислым серебром ядрышкообразугащих районов (Ag - окраска) и др. Наиболее распространенные методы дифференциального окрашивания хромосом представлены в табл. 2. Эти методы нашли широкое применение в различных областях знаний, в том числе в прснатальной диагностике, судебной и спортивной медицине. Благодаря методам дифференциального окрашивания удалось решить многие спорные вопросы видообразования и взаимоотношения близкородственных таксонов.
Методы анализа изображении для цито генетического анализа и физического картирования
Развитие хромосологии привело к появлению новых объектов исследования и совершенствованию процедур анализа препаратов. Изучение хромосом всегда связано с приготовлением препаратов, микроскопией и проведением соответствующих измерений, которое является весьма важным этапом хромосомного анализа. Для характеристики хромосомы вычисляют три специальных параметра: относительную длину хромосомы (отношение абсолютной длины данной хромосомы к общей длине всех хромосом гаплоидного набора, %), цеитро.мериый (отношение длины более короткого плеча хромосомы к длине всей хромосомы, %) и плечевой (отношение размера более длинного плеча хромосомы к размеру более короткого, %) индексы. Показатель относительной длины хромосомы является параметром длины, а не объема или массы. Для описания формы хромосомы используют принятую во всем мире терминологию: метацентрическая хромосома (почти серединное положение центромеры), субметацснтричсская и акроцентрическая (субтерминальное положение центромеры), а также, место расположения вторичной перетяжки. Эта общепринятая класификация хромосом была предложена Л. Леваном в 1964 году (Levan, 1964),
После того, как установлено точное число хромосом и выявлены особенности хромосомного набора, приступают к получению количественных характеристик, т.е. измерению хромосом.
Существует несколько способов такого измерения. Главным требованием для этого является хромосомный препарат высокого качества, т.е. четкий, контрастный препарат, где хромосомы располагаются в одной плоскости, не перекрывая друг друга. Самый простой и наиболее быстрый способ анализа, которым пользувались ученые более ста лет, состоит в зарисовке хромосом при максимально возможном увеличении. По мерс того, как менялась цель исследования, менялась манера зарисовки. Кроме того, при разных зарисовках одного и того же объекта цель и, следовательно, наиболее значимые элементы его различны. Порой рисунок представляет собой расположение хромосом в клетке, а иногда это структура индивидуальных хромосом, И в первом случае единица зарисовки - сама клетка, во втором -индивидуальные хромосомы. Поэтому для каждого конкретного случая важно правильно подобрать способ приготовления препаратов. Это или тканевые срезы (как для первого случая) или же давленые препараты (для второго случая). Позже для исследования хромосом стали применять метод раскапывания клеточной суспензии (Макгрегор, Варли, 1986).
Параллельно совершенствованию методик приготовления препаратов, шло коренное усовершенствование микроскопа: в числе прочих появились рисовальные аппараты, сопряженные с микроскопом. Длину хромосомы или отдельных плеч можно измерить по рисунку как простыми способами (с помощью нитки, курвиметра), так и более сложными, но быстрыми (с помощью аналого-цифрового преобразователя или графопостроителя, соединенных с компьютером).
Другие способы измерения хромосом, развитые в течение последних 50 лет, основаны на предварительном фотографировании препаратов (вместо зарисовки) при максимальном увеличении (когда еще не теряется качество изображения). Далее готовят позитивный отпечаток с большим увеличением, а потом уже измеряют хромосомы, и их набор схематически представляют в виде идиограмм. Полное изложение правил описания хромосом, дифференциально окрашенных красителем Гимза или флуорохромами, отражено в рекомендациях Парижской конференции по стандартизации в цитогенстике человека, состоявшейся в 1971 году (Paris Conference, 1971). Открытие и создание техники хромосомного бэндинга в течение последних 30 лет снабдило цитогенетиков мощнейшим инструментом для идентификации как индивидуальных хромосом в целом, так и их частей, облегчив тем самым процедуру анализа генома.
Исследование хромосом - весьма трудоемкая процедура. Основные трудности связаны с непосредственным исследованием хромосом под микроскопом и на фотографиях. При оценке кариотипа большую роль играют субъективные моменты, основанные на точности глазомера исследователя. Измерение хромосом на микрофотографии значительно повышает точность идентификации, но оно весьма трудоемко. В связи с этим возникает необходимость автоматизации процедур, применяемых при анализе кариотипа.
Впервые фотометрические методы к изучению хромосом были применены в работе Касперсона с сотрудниками для идентификации хромосом человека (Caspersson et al., 1970,1971). Стимулом к проведению такой разработки стали сложности визуальной идентификации хромосом, окрашенных с помошыо Q - метода, при котором появлялось огромное количество бэидов. Первый подход, разработанный этими авторами, заключался в использовании отражающей фотометрии (Reflection photometry method) (Caspersson et al., 1970a,b,c,e,f,g). Для анализа использовали фотоотпечатки индивидуальных хромосом, окрашенных Q-методом. В результате для каждой хромосомы человека были получены кривые распределения интенсивности флуоресценции (рис. 11). Эти кривые оказались специфичными для каждой хромосомы, что к позволило провести их полную идентификацию.
