Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Количественная оценка содержания хромофоров в биотканях методами отражательной и флуоресцентной спектроскопии 15
1.1. Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектрам диффузного отражения 15
1.1.1. Эффективная оптическая плотность рассеивающей среды 15
1.1.1.1. Среда с однородным распределением хромофоров 17
1.1.1.2. Тонкий поглощающий слой, помещенный в рассеивающую среду 21
1.1.2. Феноменологическая модель кожи для анализа спектров диффузного отражения 24
1.2. Количественная оценка содержания хромофоров в кожной ткани по спектральным распределениям степени поляризации диффузно отраженного излучения 27
1.2.1. Феноменологическая модель релаксации линейной поляризации света, распространяющегося в неупорядоченной многократно рассеивающей среде 27
1.2.2. Влияние поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией 35
1.2.2.1. Феноменологическое описание 35
1.2.2.2. Модельные эксперименты 39
1.2.3. In vivo поляризационная отражательная спектроскопия кожи человека 50
1.3. Количественная оценка содержания хромофоров в биоткани по спектрам ее автофлуоресценции 55
1.3.1. Эффективная оптическая плотность тонкого поглощающего слоя, помещенного в рассеивающую среду ...55
1.3.2. Феноменологическая модель для анализа спектров АФ кожной ткани 59
1.4. Сравнительный анализ оценки хромофорного состава биоткани с использованием разных спектроскопических методов 62
1.5. Выводы 65
Глава 2, Поляризационная визуализация биотканей 67
2.1. Разностная поляризационная спектроскопия биологических тканей 69
2.1.1. Феноменологическая модель формирования разностного поляризационного спектра обратно рассеянного биотканями света ...69
2.1.2. Модельные измерения в условиях in vitro 71
2.1.3. In vivo разностная поляризационная отражательная спектроскопия кожи человека 76
2.2. Влияние анизотропии кожной ткани на состояние поляризации рассеянного света с исходной линейной поляризацией 82
2.2.1. Методика определения оптической анизотропии в рассеивающих средах 83
2.2.2. Измерения поляризационных характеристик прошедшего света 89
2.2.2.1. Модельные измерения 89
2.2.2.2. Измерения на образцах кожной ткани in vitro 94
2.2.3. Измерения поляризационных характеристик обратно рассеянного света 99
2.2.3.1. Модельные измерения 99
2.3. Выводы 103
Глава 3. Исследование биотканей комбинированным методом отражательной и флуоресцентной спектроскопии 106
3.1. Коррекция проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ биоткани 106
3.1.1. Метод коррекции АФ кожной ткани 108
3.1.2. Модельные измерения в условиях in vitro 110
3.2. Комбинированный метод отражательной и флуоресцентно спектроскопии как метод исследования многослойных биологических структур ... 112
3.2.1. Многоволновый метод диагностики биотканей 1І2
3.2.2. Модельные исследования флуоресценции многослойной рассеивающей среды 118
3.2.2.1. Модельная среда 119
3.2.2.2. Результаты экспериментов 120
3.2.3. Корреляционное уравнение для модели многослойной среды 125
3.2.3.1. Влияние толщины «эпителиального» слоя фантома... 125
3.2.3.2. Влияние содержания крови в «субэпителиальном» слое фантома 128
3.2.3.3. Влияние изменения биохимического состава фантома 129
3.2.3.4. Корреляционное выражение для дифференциации патологических изменений цервикальной ткани 131
3.3. Выводы 132
Заключение 133
Библиографический список использованной литературы 138
- Влияние поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией
- Феноменологическая модель формирования разностного поляризационного спектра обратно рассеянного биотканями света
- Комбинированный метод отражательной и флуоресцентно спектроскопии как метод исследования многослойных биологических структур
- Корреляционное выражение для дифференциации патологических изменений цервикальной ткани
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение оптические методы исследования, диагностики и визуализации состояния биотканей ш vivo. К наиболее распространенным оптическим методам диагностики биотканей можно отнести методы отражательной и флуоресцентной спектроскопии, которые успешно используются в диагностических целях в различных областях медицины. Диффузно отраженное биотканью излучение и автофлуоресценция (АФ) биоткани несут информацию о поглощающих и излучающих свойствах среды, особенностях структуры биоткани.
Исследования спектрального состава диффузно отраженного света и АФ биоткани позволяют качественно оценить ее морфо-функциональное состояние и выявить наличие патологии. Однако, помимо качественной оценки морфо-функционального состояния биоткани необходимо выяснить причины возникновения ее патологических изменений, для чего необходимо получение информации о количественных изменениях, происходящих в структуре и биохимическом составе биоткани. Большинство исследуемых методами отражательной и флуоресцентной спектроскопии биотканей представляет собой сложные по структуре многокомпонентные многофункциональные среды, поэтому количественная оценка по спектрам диффузного отражения и АФ содержания в биотканях биохимических компонентов является достаточно сложной задачей, прежде всего из-за ограниченности измеряемых параметров (коэффициента диффузного отражения и интенсивности АФ). В связи с этим разработка спектральных методов анализа структуры биоткани и оценки содержания в ней биохимических компонентов представляет определенный интерес.
Спектр диффузного отражения биоткани позволяет определить спектральный состав «эффективной оптической плотности» исследуемого объекта - параметра, который является источником получения количественной информации о поглощающих свойствах биоткани. Рассеяние света в биоткани приводит к тому, что характер спектра «эффективной оптической плотности» часто отличается от спектра поглощения компонентов биоткани, что приводит к ошибке в количественной оценке содержания в ней хромофоров. Поэтому важной является задача выяснения условий, при которых различия между данными спектрами минимальны.
Так как спектральный состав диффузно отраженного света и АФ биоткани определяется одними и теми же поглощающими и рассеивающими свойства среды, то комбинированное использование результатов измерений спектров диффузного отражения и АФ биоткани в значительной мере расширяет возможности диагностики биоткани и получения информации о структуре биоткани и количественном содержании в ней биохимических компонентов. Поэтому перспективным методом исследования биотканей является комбинированный метод отражательной и флуоресцентной спектроскопии, который в настоящее время недостаточно развит.
Если источником АФ биоткани являются флуорофоры, расположенные в глубине среды, то спектральный состав измеряемой АФ биоткани искажается по сравнению с истинным спектром флуоресценции из-за рассеяния и частичного поглощения выходящего из среды излучения (эффект внутреннего фильтра). Так как для получения дополнительной информации о причинах возникновения патологических изменений биоткани необходимо знать, содержание каких флуорофоров изменилось в результате возникновения патологии, то такую информацию может дать истинный спектр АФ биоткани, который может быть получен из наблюдаемого путем коррекции проявления эффекта внутреннего фильтра в спектре АФ биоткани. В связи с этим представляет интерес разработка метода коррекции АФ биоткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения.
Патологические изменения в биотканях, связанные с изменениями в ее структуре или биохимическом составе, проявляются в спектральных изменениях АФ биоткани в тех или иных спектральных диапазонах. Для диагностики происходящих в биоткани морфо-функциональных изменений перспективно использование многоволнового метода флуоресцентного анализа, основанного на сравнении интенсивности АФ нормальной и патологической биоткани, измеренной на нескольких длинах волн. Выбор соответствующих длин волн, на которых максимально проявляются различия в АФ нормальной и патологической биотканей, очень важен не только с точки зрения флуоресцентной диагностики биоткани, но и с точки зрения ее приборного воплощения.
Одним из путей решения данной задачи являются исследования флуоресценции и диффузного отражения света искусственно созданных структур (фантомов), которые по своей структуре и биохимическому составу подобны реальным биологическим объектам. Такие исследования позволяют сформулировать так называемое «корреляционное выражение», включающее в себя комбинации измеренных на выбранных длинах волн интенсивностей АФ и- коэффициентов диффузного отражения объекта, которое дает возможность оценивать состояние биоткани.
Одним из преимуществ оптических методов исследования биологических сред является возможность получения информации о среде путем анализа поляризационных характеристик рассеянного средой излучения. В биомедицинских приложениях использование поляризованного излучения в основном связано с детектированием обратно рассеянного света. Особенности формирования поляризационных характеристик обратно рассеянного света с начальной линейной поляризацией приводят к эффекту остаточной поляризации, степень которой зависит от рассеивающих свойств среды. Однако практически не исследовано влияние поглощающих свойств среды на спектральное распределение степени остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью поляризованного излучения. Такие исследования представляют интерес, поскольку могут явиться основой нового поляризационного метода оценки количественного содержания хромофоров в биоткани.
Эффективность поляризационного метода диагностики биоткани обусловлена различным вкладом рассеяния света в ее поверхностных и глубинных слоях в спектральный состав ортогонально поляризованных компонентов обратно рассеянного света. Исследования разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих обратно рассеянного биотканью света позволяют получить информацию о наличии хромофоров в ее приповерхностном слое, исключая глубинные. Такие исследования не проводились и являются актуальными, так как на их основе возможна разработка нового метода исследования приповерхностных слоев биотканей, толщины которых сравнимы с длиной деполяризации в среде зондирующего света.
Во многих биотканях, имеющих фиброзный характер, в том числе в дермальном слое кожной ткани, имеет место определенная оптическая анизотропия. Более того, оптическое двулучепреломление на микроскопическом уровне обнаружено в роговом слое кожной ткани. Флуктуации анизотропии среды не только дают вклад в рассеяние распространяющегося в ней света, но и определенным образом влияют на поляризационные свойства рассеянного излучения. Адекватная интерпретация результатов поляризационных измерений кожной ткани требует исследований влияния оптической анизотропии кожи на поляризационные характеристики рассеянного средой света.
Вышеперечисленные факты и обстоятельства позволяют сформулировать основную цель диссертационной работы и определить круг задач, не затронутых другими исследователями и решаемых в данной работе.
Цель и основные задачи работы
Основной целью диссертационной работы является развитие оптических методов диагностики и мониторинга состояния биотканей, основанных на анализе спектрального состава диффузно отраженного биотканями света и их автофлуоресценции, а также состояния поляризации обратно рассеянного биотканями линейно поляризованного света.
В рамках работы решались следующие задачи:
Исследование возможности использования спектрального состава параметра «эффективной оптической плотности» биоткани для количественной оценки содержания в ней хромофоров. Определение условий, при которых различия между спектрами поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани минимальны.
Исследование влияния поглощающих свойств биоткани на спектральную зависимость степени поляризации диффузно отраженного света с начальной линейной поляризацией и разработка на основе полученных результатов методики количественной оценки содержания в биоткани хромофоров. .Исследование спектрального состава разностного спектра ко- и кросс-поляризованной составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного излучения и разработка на основе полученных результатов методики определения структуры ее приповерхностного слоя.
Разработка поляриметрической методики определения оптической анизотропии рассеивающих сред, в том числе биотканей, и исследование на основе разработанной методики оптической анизотропии кожной ткани.
Разработка метода коррекции спектра АФ кожной ткани, основанного на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения биоткани.
6. Исследовать УФ возбужденную флуоресценцию модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани в норме и патологии, и на основе полученных результатов сформулировать корреляционное выражение, позволяющее оценивать происходящие в биоткани морфо-функциональные изменения.
Научная новизна работы
Научная новизна работы определяется комплексом впервые выполненных in vivo и in vitro исследований и впервые полученных результатов, которые сводятся к следующему:
Впервые исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании среды линейно поляризованным светом.
Разработан новый метод in vivo количественной оценки содержания в биоткани поглощающих компонентов, основанный на измерении спектральной зависимости степени остаточной поляризации диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света.
Разработан новый метод in vivo оценки толщины эпидермиса кожной ткани, основанный на измерении разностного спектра интенсивностей ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного кожей линейно поляризованного света.
На основе разработанной поляриметрической методики впервые выявлена оптическая анизотропия кожной ткани на макроскопическом уровне.
Разработан новый метод получения истинного спектра АФ кожной ткани путем коррекции проявления в наблюдаемом спектре эффекта внутреннего фильтра, основанной на комбинированном использовании результатов измерений спектров АФ и диффузного отражения кожи.
6. Сформулировано новое корреляционное выражение для оценки морфо-функциональных изменений в цервикальной ткани, включающее в себя комбинации интенсивностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения биоткани, измеренных на определенных длинах волн.
Практическая значимость
Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, существенно расширяют представления о комбинированном методе флуоресцентной и отражательной спектроскопии in vivo биотканей, что в свою очередь может иметь значение для целого ряда применений. Полученные результаты найдут практическое применение в биологии и медицине, в частности, в результате выполнения работы разработан комплекс методик для оценки морфо-функционального состояния биотканей человека, позволяющий в условиях in vivo получать объективную информацию о степени выраженности патологических и функциональных изменений, а также оценивать эффективность лечения.
Полученные в работе результаты использованы в учебном процессе, а также при выполнении исследований по следующим грантам:
INCO-COPERNICUS (проект № 1С 15-СТ96-0815);
Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 96-15-96389);
Грант РФФИ «Государственная поддержка ведущих научных школ РФ» (проект № 00-15-96667);
Грант АФГИР «Научно-образовательный центр нелинейной динамики и биофизики» (проект № REC-006);
Грант Президента РФ на поддержку ведущих научных школ № НШ-25.2003.2;
Грант Министерства образования Российской Федерации № 01.2003.15221;
Грант Министерства образования РФ по Программе "Фундаментальные исследования в области естественных и точных наук" №Е02-3.2-498;
Грант РФФИ № 04-02-16533.
Достоверность результатов диссертации
Достоверность экспериментальных результатов обеспечивается использованием современной измерительной аппаратуры, апробированных экспериментальных методик, воспроизводимостью результатов экспериментов, а также их согласованием с экспериментальными результатами, полученными другими авторами.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту
Степень остаточной поляризации обратно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств рассеивающей среды, при этом спектральная зависимость степени остаточной поляризации качественно совпадает со спектральной зависимостью параметра «эффективная оптическая плотность», определяемого по спектрам диффузного отражения биоткани.
Наличие хромофора в приповерхностном слое биоткани толщиной, сравнимой с длиной деполяризации линейно поляризованного света, проявляется в уменьшении интенсивности разностного спектра ортогонально поляризованных составляющих диффузно отраженного биотканью линейно поляризованного света в спектральной области поглощения хромофора.
Результаты исследований оптической анизотропии кожной ткани. Цельная кожная ткань крысы обладает оптической анизотропией на макроскопическом уровне, при этом средняя разность показателей преломления среды для обыкновенного и необыкновенного лучей в спектральном диапазоне 550-700 нм составляет величину порядка 0,00023. 4. Метод коррекции проявления в измеряемом спектре АФ кожи эффекта внутреннего фильтра. Корректирующим фактором служит спектр при этом истинный спектр флуорофора кожной ткани определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
Апробация результатов
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях:
Всероссийском семинаре «Проблемы и достижения люминесцентной спектроскопии», (Саратов, 1998 г.);
Международном междисциплинарном научном семинаре и осенней школе молодых ученых «Методы светорассеяния в механике, биомедицине, материаловедении», (Саратов, 1998 г.);
Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'99) (Саратов, 1999);
Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и 'Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2000) (Саратов, 2000);
Первом Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2001» (Москва, 2001);
Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2001) (Саратов, 2001);
6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века», (Пущино, 2002);
Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2002) (Саратов, 2002);
Международной школе для молодых ученых и студентов по Оптике, Лазерной физике и Биофизике (Saratov Fall Meeting SFM'2004) (Саратов, 2004); и на научных семинарах в Саратовском государственном университете.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ (9 статей и 2 тезисов докладов на научных конференциях).
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя заключался в участии в постановке задач, проведении экспериментальных исследований, обработке и обсуждении полученных результатов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, трех глав и заключения. Содержит 148 страниц машинописного текста, включая 64 рисунка, и список используемых источников, насчитывающий 106 наименований.
Влияние поглощения многократно рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения с исходной линейной поляризацией
Существование остаточной поляризации при обратном рассеянии поляризованного излучения обусловлено специфическими условиями формирования рассеянного оптического поля, когда весьма существенен вклад малократно рассеянных парциальных составляющих с характерными расстояниями распространения в среде порядка s Г. Дополнительное поглощение зондирующего излучения в рассеивающей среде будет приводить к отсечке парциальных составляющих рассеянного поля, характеризуемых значениями оптического пути s /z"1, где fia (X) - значение коэффициента поглощения рассеивающей среды на длине волны зондирующего излучения. Дополнительное возрастание относительных вкладов парциальных составляющих с s iQl должно проявляться в возрастании степени остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при увеличении }Ла .
Приближенное аналитическое выражение, описывающее взаимосвязь между степенью остаточной линейной поляризации Pi обратно рассеянного излучения и коэффициентом поглощения рассеивающей среды может быть получено путем модификации феноменологического подхода, рассмотренного выше.
Учет влияния поглощения зондирующего излучения рассеивающей средой на степень остаточной поляризации Pi может быть осуществлен введением дополнительного бугеровского множителя, описывающего "отсечку" парциальных составляющих, характеризуемых большими значениями s, и модификацией выражения (1.17) к следующей форме: в которой учтено изменение условия нормировки плотности вероятности оптических путей в случае существования дополнительного поглощения в рассеивающей среде.
Из выражения (1.18) с учетом (1.17) получим окончательно приближенную формулу для степени остаточной поляризации обратно рассеянного излучения в условиях многократного рассеяния плоской линейно поляризованной волны неупорядоченной средой: На рис, 1.8 представлены теоретические зависимости Рц от безразмерного параметра juj при обратном рассеянии плоской линейно поляризованной монохроматической волны полубесконечной неупорядоченной средой, состоящей из диэлектрических сферических частиц с существенно различающимися значениями дифракционного параметра ка и относительным показателем преломления, равным 1.2 (данное значение соответствует, например, таким часто применяемым модельным рассеивающим средам, как полистироловые частицы в воде при использовании излучения видимого диапазона). Значения нормированной длины деполяризации т\=р/1 в соответствии с результатами статистического моделирования и экспериментальными данными, представленными выше, приняты равными и 1 для крупных рассеивающих частиц (режим рассеяния Ми, ка » 1) и и 4 для "релеевских" частиц с ка«\. При зондировании неупорядоченных рассеивающих сред немонохроматическим линейно поляризованным светом спектральные зависимости степени остаточной поляризации рассеянного назад излучения контролируются, с одной стороны, влиянием длины волны X на & и / и зависимостью коэффициента поглощения рассеивающей среды от X, с другой стороны. Селективное поглощение рассеивающей среды, обусловленное наличием определенных хромофоров, должно приводить к возрастанию степени остаточной поляризации обратно рассеянного излучения в спектральных интервалах, соответствующих полосам поглощения хромофоров.
Экспериментальные исследования влияния поглощения рассеивающих сред на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при освещении среды линейно поляризованным светом были проведены с использованием установки, схематически представленной на рис. 1.9.
В качестве источника немонохроматического излучения использовалась система, состоящая из стандартного осветителя типа ОВС-1 на основе галогеновой лампы накаливания (1). Для зондирования исследуемых рассеивающих сред линейно поляризованным излучением и регистрации ко- и кросс-поляризованной составляющих излучения, рассеянного средой в обратном направлении, применялась специально разработанная измерительная головка, состоящая из двух волоконно-оптических жгутов для передачи света от осветителя к исследуемому образцу (2) и сбора рассеянного назад излучения (3), и поляризационных фильтров на основе поляроиднои пленки, расположенных непосредственно перед выходным торцом освещающего жгута (4) и входным торцом приемного жгута (5). В последнем случае поляризационный фильтр был изготовлен из двух кусков поляроиднои пленки с взаимно ортогональными направлениями оптических осей таким образом, чтобы обеспечить возможность детектирования либо ко-поляризованной, либо кросс-поляризованной составляющих рассеянного назад излучения путем смещения фильтра в направлении, перпендикулярном оси приемного волокна, В установке использованы световедущие жгуты диаметром 5 мм с числовой апертурой, равной 0.40. Взаимная ориентация освещающего и приемного жгутов и их положение относительно поверхности исследуемой среды (6) показаны на рис. 1.9; подобная конфигурация измерительной головки позволяет исключить влияние "зеркальной" составляющей, отраженной от поверхности исследуемого образца, на результаты измерения степени поляризации обратно рассеянного излучения. Для используемой в эксперименте измерительной головки диаметр освещаемой области поверхности исследуемых образцов в зоне перекрытия диаграмм направленности освещающего и приемного жгутов составлял 15 мм и во много раз превышал характерные значения транспортной длины для исследуемых сред. Это позволяло рассматривать условия формирования рассеянного поля как соответствующие случаю освещения зондируемой среды протяженным источником света. Спектрофотометрический анализ регистрируемого рассеянного излучения в видимой области спектра осуществлялся с помощью оптического многоканального анализатора ЛЭСА-бмед (7) (изготовитель - фирма Биоспек, Россия), связанного с персональным компьютером (8).
С целью учета влияния на результаты измерения степени остаточной поляризации обратно рассеянного излучения систематических погрешностей, обусловленных поляризационными характеристиками элементов оптической схемы и спектральной зависимостью степени дихроизма поляроидной пленки, была проведена калибровка измерительной системы с использованием различных тестовых рассеивателей, для которых степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения измерялась в независимых экспериментах на фиксированных длинах волн зондирующего излучения. Кроме того, для анализа влияния коэффициента поглощения исследуемых образцов на степень остаточной поляризации рассеянного назад излучения выбирался спектральный диапазон видимой области от 450 до 650 нм, в котором используемая поляроидная пленка обладает высокой степенью дихроизма ( 100:1).
Феноменологическая модель формирования разностного поляризационного спектра обратно рассеянного биотканями света
Когда линейно поляризованное излучение падает на биоткань, то происходит его частичное отражение ( 5%) от поверхностного слоя, при этом отраженный свет сохраняет поляризацию падающего излучения. Оставшаяся (не отраженная) часть излучения распространяется вглубь биоткани, где он частично поглощается и рассеивается. По мере распространения вглубь среды увеличивается число актов рассеяния, которые приводят к тому, что свет теряет информацию о первоначальном состоянии поляризации и становится деполяризованным. С другой стороны, рассеяние света приводит к формированию обратно рассеянного излучения, которое выходит из биоткани и воспринимается, как отраженное ей излучение. В состав этого излучения входят две составляющие. Излучение, отраженное от поверхности и непосредственно под ней расположенных слоев, характеризующихся малократным рассеянием, преимущественно сохраняет ориентацию поляризации падающего излучения, т. е. является частично поляризованным. Излучение, обратно рассеянное более глубоко залегающими слоями биоткани, является полностью деполяризованным.
Теоретический анализ влияния оптических свойств среды на разностный поляризационный спектр обратно рассеянного средой излучения может быть проведен в рамках феноменологического подхода на основе концепции распределения p{s) оптических путей парциальных компонентов рассеянного оптического поля с различным состоянием поляризации, изложенной в главе 1.
В рамках этого феноменологического подхода интенсивности ко-поляризованной и кросс-поляризованной составляющих рассеянного поля могут быть представлены в форме интегральных преобразований/) ); где f/ - длина деполяризации многократно рассеивающей среды, определяющая скорость релаксации исходного состояния поляризации зондирующего пучка при его распространении в среде. Из (2.1) видно, что разностный поляризационный компонент определяется как статистикой эффективных оптических путей, так и скоростью релаксации состояния поляризации, определяемой длиной деполяризации.
Длина деполяризации рассеивающей среды зависит от ее оптических свойств (транспортной длины / и параметра анизотропии g) и для многократно рассеивающих сред, состоящих из «мягких» частиц, максимальное значение & w 4 / имеет в случае изотропного рассеяния (g » 0), а с ростом параметра анизотропии длина деполяризации монотонно убывает до значе-нийр«/ при gw 0.91-г0.93.
Для кожной ткани в видимом диапазоне спектра среднее значение коэффициента рассеяния кожи составляет величину порядка /JS = 60 мм , параметр анизотропии g = 0.85. Это позволяет оценить транспортную длину / как величину порядка 100 мкм. В случае детектирования обратно рассеянного кожей излучения при освещении ее линейно поляризованным светом длина деполяризации fy уменьшается до величины порядка /, сравнимой с толщиной эпидермиса. Этот факт не только объясняет результаты экспериментов по визуализации структуры кожной ткани [52], но и дает основание считать, что разностный поляризационный спектр несет информацию о состоянии эпидермального слоя.
Поляризационные измерения спектров отражения проводились на установке, схема которой приведена на рис. 1.9. Излучение широкополосного источника света 1 (галогеновая лампа мощностью 200 Вт) доставлялось к исследуемому объекту с помощью волоконно-оптического жгута 2, на выходном конце которого был закреплен широкополосный поляризационный фильтр 4, после прохождения которого, свет становился линейно поляризованным. Диаметр освещаемого участка поверхности составлял 8 мм. Сбор отраженного кожей излучения осуществлялся с помощью волоконно-оптического жгута 3, на входном конце которого располагался поляризационный фильтр 5 с возможностью изменения его ориентации (параллельной или ортогональной) относительно поляроида, расположенного на облучающем световоде. Использование волоконно-оптического жгута для сбора отраженного объектом излучения было обусловлено наличием остаточной поляризации прошедшего через световод излучения в случае использования моноволокна, что отражалось на форме регистрируемого спектра (дифракционный спектрометр чувствителен к состоянию поляризации излучения относительно входной щели прибора). С целью исключения попадания в приемную систему зеркально отраженного от объекта б света, волоконно-оптичеческий жгут располагался под углом 20 по отношению к нормали к поверхности объекта. Дистальный конец жгута располагался перед входной щелью оптического многоканального анализатора (ОМА) спектров 7 ЛЭСА-6мед, с помощью которого регистрировались спектры отраженного объектом излучения.
Комбинированный метод отражательной и флуоресцентно спектроскопии как метод исследования многослойных биологических структур
Одним из современных подходов анализа состояния биоткани является многоволновый спектральный метод, заключающийся в комплексном анализе АФ, возбуждаемой в разных спектральных диапазонах. Тем самым затрагивается излучение всех флуорофоров исследуемого объекта. Для визуализации зависимости интенсивности АФ биоткани от длин волн возбуждения и эмиссии создаются трехмерные представления, называемые экситационно-эмиссионными матрицами (ЕЕМ - картами) [77-83], являющиеся наиболее полным результатом реализации данного метода.
Пространственные изображения областей возбуждения и эмиссии АФ изучаемых биотканей служат для выявления основных флуорофоров, формирующих спектр АФ исследуемого объекта, а также для последующего создания объективных математических алгоритмов их количественной оценки. Одна из целей данного метода исследования - нахождение таких длин волн возбуждающего света и флуоресценции, измерение интенсивности флуоресценции на которых позволяет наилучшим образом установить отличительные критерии для биоткани с различными патологическими изменениями.
Метод ЕЕМ-матриц оказался достаточно эффективным" при исследовании природы АФ биотканей, в частности, кожной ткани [77,78], шейки матки [80], слизистой толстой кишки [83], а также при выявлении различий в АФ нормального эпителия и эпителия с патологией (к примеру, с дисплазией и карциномой ткани защечного мешка хомяка [79], меланомой ткани уха мыши [81], аденомой слизистой толстой кишки[82]).
Упрощенной модификацией метода ЕЕМ-матриц является метод флуоресцентной диагностики биотканей, основанный на сравнении спектров АФ, возбужденных на отдельных длинах волн [77-81,83-85]. Данный метод также позволяет отличить нормальную биоткань от патологической. В частности, интенсивность АФ слизистой толстой кишки существенно меньше интенсивности АФ патологической ткани (полипы, аденома, неоплазия), возбужденной светом разных длин волн: 325 нм [86], 337 нм [87], 370 нм [88]. Патологию можно также определить по форме спектра АФ, возбужденной светом видимого диапазона: 405 нм [89], 479, 549 и 615 нм [90].
Помимо выявления патологий биоткани, несомненный интерес представляет количественная оценка патологических изменений биоткани. Такую оценку можно проводить, выбирая в качестве критерия данной патологии величину, являющуюся комбинацией интенсивностей возбуждающего излучения и флуоресценции на отдельных длинах волн, а также коэффициентов диффузного отражения на определенных длинах волн. При этом целесообразней вести анализ биоткани по тем участкам спектров, где вариации состава и структуры биоткани приводят к наибольшему изменению в спектрах возбуждения флуоресценции, эмиссии флуоресценции и диффузного отражения, или там, где расхождения между спектральными распределениями интенсивностей флуоресценции или отражения здоровой и пато-логической ткани максимально. Поиск и установление таких спектральных зон при фиксированных условиях возбуждения или наблюдения флуоресценции является важным моментом в исследовательских работах [91-95]
Выше уже отмечалось, что комбинированный параметр /НАДН/ЯЗ65, где /нлд-н - интенсивность флуоресценции НАД-Н {ХЕХ=365 нм), R365 - коэффициент диффузно отраженного света обеспечивает полуколичественную оценку концентрации НАД-Н в ткани сердечной мышцы.
В предложенном авторами [96] флуоресцентной методике оценки фотостарения кожи в качестве индикатора фотостарения используется отношение интенсивностей УФА-возбужденной флуоресценции на длинах волн 390 нм и 429 нм: для кожи» подвергшейся солнечному воздействию, это отношение 1, в то время как для необлученной кожи оно несколько выше ( 1,2).
Исследованные авторами [97] различия в спектрах УФ-возбужденной флуоресценции злокачественных и доброкачественных образований молочной железы использовались для качественного определения типа образований. Для спектра возбуждающего излучения в диапазоне 250-289 нм интенсивность флуоресценции доброкачественных образований выше по сравнению со злокачественными образованиями, в то время как при возбуждении флуоресценции излучением диапазона 289-310 нм наблюдалась обратная зависимость. В изобестической точке (289±3 нм) спектры возбуждения оставались неизменными для обоих видов ткани. Для количественной оценки авторами предложено пользоваться следующими отношениями интенсивностей: #i = 289/ 268, Ri= Imlhm- Ткань считалась нормальной при R\ 1,5 и R2 1,5.
На основе анализа ЕЕМ-матриц авторами [79] введены классификационные параметры, которые позволяли проводить дискриминацию нормального эпителия защечного мешка хомяка и ткани с различными патологиями (воспаление, гиперплазия, дисплазии разной степени, злокачественные новообразования). Такими параметрами являлись отношения интенсивностей УФ-возбужденной флуоресценции hssihiSb hntJhss, /470//525- В частности, значение параметра h hih равного 3, является граничным с точки зрения разделения между группой образцов здоровой ткани и с патологией. Критерием различий между нормальной тканью слизистой толстой кишки и тканями с доброкачественными и злокачественными новообразованиями, по мнению авторов [98], являлись соотношения между интенсивно-стями АФ биоткани на длинах волн 440нм, 480нм, 515нм, которые соответствуют максимумам флуоресценции двух формам НАД-Н, флавинов и липо-пигментов.
При возбуждении АФ излучением 366 нм лучше всего дифференцируется здоровая ткань и ткань с неоплазиеи, так как в этом случае происходит модификация профиля спектра АФ в области 440-480 нм. Отношение интен-сивностей АФ /48(Ді40 возрастает при переходе от здоровой ткани к очагу патологии. Этот факт предполагает присутствие существенно большего количества свободной формы НАД-Н в опухоли, по сравнению с остальной тканью. Если же АФ возбуждается светом коротковолнового видимого диапазона (405 нм, 436 нм), то изменяется форма спектров АФ в диапазоне свыше 500 нм, что соответствует присутствию в ткани липопигментов - биохимических компонентов, вовлеченных в происходящий в строме процесс развития опухоли. Дифференциация поврежденных и неповрежденных тканей осуществляется с помощью отношения I5isflnO
Корреляционное выражение для дифференциации патологических изменений цервикальной ткани
Таким образом, результаты комбинированных измерений спектров отражения и флуоресценции при одинаковых условиях освещения и регистрации, могут быть вовлечены в процесс создания корреляционного выражения для дифференциации патологических изменений цервикальной ткани.
Анализ изменений в спектрах флуоресценции исследуемого модельного объекта, произведенный на основе выбранных параметров, позволил сформулировать корреляционное выражение в виде:
В этом выражении слагаемые (А)-(С) отражают патологические структурные изменения модельных образцов: они увеличиваются при увеличении толщины "эпителиального" слоя, при увеличении содержания крови в "субэпителиальном" слое и в случае разрушения "базальной мембраны". Увеличение содержания НАД-Н также ведет к увеличению этих слагаемых. Слагаемое (D) зависит от содержания крови в "строме": при увеличении ее содержания оно увеличивается. Слагаемые (Е) и (F) ведут себя аналогично (В) и (С), но они не чувствительны к содержанию крови. Таким образом, любые отклонения в структуре и биохимическом составе модельного образца от нормы приводят к увеличению параметра S. Весовые коэффициенты (А) - (F) должны быть выбраны, исходя из количественных соотношений (значений) слагаемых, водящих в S и результатов клинических исследований для различных патологий.
На основе феноменологических моделей для анализа спектров диффузного отражения и АФ кожи предложен и апробирован метод коррекции проявления эффекта внутреннего поглощения в спектрах АФ кожи. Корректирующим фактором служит спектр -\ДДЯ): истинный спектр флуорофора кожной ткани определяется путем деления измеренного спектра на фактор коррекции.
На основе проведенных экспериментальных исследований УФ возбужденной флуоресценции ( ЕХ=337 нм) модельных образцов, адекватно отражающих структуру и биохимический состав цервикальной ткани в норме и при патологии, определены параметры, являющиеся комбинацией интенсив-ностей флуоресценции и коэффициентов диффузного отражения на определенных длинах, зависящие от изменений структуры биоткани и содержания в ней биохимических компонентов. Сформулировано корреляционное выражение, позволяющее оценивать морфо-функциональные изменения в цервикальной ткани.
Исследована возможность и выявлены условия применимости спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой по спектру диффузного отражения биоткани, для количественной оценки содержания в биоткани хромофоров. Показано, что в случае однородного распределения хромофоров по объему биоткани спектры поглощения и «эффективной оптической плотности» биоткани качественно совпадают в спектральной области, где транспортный коэффициент рассеяния биоткани слабо зависит от длины волны зондирующего излучения. В случае локализации хромофоров в приповерхностном слое биоткани это ограничение снимается, и величина «эффективной оптической плотности» линейно зависит от концентраций содержащихся в биоткани хромофоров.
Исследовано влияние поглощения рассеивающей среды на степень остаточной поляризации обратно рассеянного излучения при зондировании многократно рассеивающих сред линейно поляризованным светом, В рамках феноменологического подхода, основанного на статистике оптических путей парциальных составляющих рассеянного света, получено приближенное выражение, описывающее зависимость степени остаточной линейной поляризации обратно рассеянного излучения от оптических характеристик (поглощения и рассеяния) многократно рассеивающей среды, в том числе биоткани. Показано, что спектральная зависимость параметра «степень поляризации» обратно диффузно рассеянного биотканью света с исходной линейной поляризацией зависит от поглощающих свойств среды аналогично спектральной зависимости параметра «эффективная оптическая плотность», определяемой из спектра диффузного отражения биоткани.
