Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1 Краткая история изучения ретровирусов и ретроэлементов 11
2.2 Жизненный цикл ретровирусов, их строение и синтез LTR 12
2.3 Ретроэлементы: происхождение, структура и классификация 15
2.4 Семейство HERV-K(HML-2) 21
2.5 Функциональные элементы в составе LTR. 23
2.6 Биологическое значение LTR 28
2.7 Инсулятор: блокирование взаимодействия энхансера с промотором 33
2.8 Инсулятор: защита от эффекта положения 34
2.9 Структурные особенности отдельных инсуляторов 35
2.10 Функции отдельных инсуляторов 39
2.11 Преодоление активности инсулятора 44
2.12 Механизмы действия инсуляторов 46
2.13 Перспективы использования инсуляторов 51
2.14 Заключение 52
3. Материалы и методы 54
3.1 Материалы 54
3.2 Методы 57
3.2.1 ПЦР амплификация 57
3.2.2 Трансформация E.coli и выделение плазмид 58
3.2.3 Рестрикция и лигирование 59
3.2.4 Культивирование клеток 60
3.2.5 Трансфекция клеток 62
3.2.6 Позитивно-негативная селекция 63
3.2.7 Получение клеточного лизата 63
3.2.8 Определение количества белка 64
3.2.9 Определение активности р-галактозидазы 64
3.2.10 Определение активности люциферазы 64
3.2.11 Выделение геномной ДНК 65
3.2.12 Картирование фрагментов в геноме человека 65
4. Результаты и обсуждение 66
4.1 LTR: Обоснование выбора объекта 66
4.2 Описание опытных конструкций и экспериментального подхода 70
4.3 Промоторная активность LTR 71
4.4 Негативный регуляторний элемент (НРЭ) 77
4.5 Энхансерная активность LTR 78
4.6 Тканеспецифичность энхансера SV40 80
4.7 Инсуляторная активность S/MAR 82
4.8 Система для поиска инсуляторов 87
4.9 Идентификация и картирование инсуляторов 98
Выводы 104
Список литературы 105
- Жизненный цикл ретровирусов, их строение и синтез LTR
- Ретроэлементы: происхождение, структура и классификация
- Инсулятор: блокирование взаимодействия энхансера с промотором
- Трансформация E.coli и выделение плазмид
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Геном человека содержит около 40000 генов, всего один процент генома непосредственно кодирует белки. При этом он содержит огромное число функциональных элементов, не кодирующих белки. Так, более половины генома представлено повторяющимися элементами, которые содержат сотни тысяч регуляторных последовательностей, способных влиять на экспрессию генов (Lander et al, 2001). Примерами могут служить энхансеры, промоторы и терминаторы транскрипции, участки, ответственные за образование комплексов ДНК и РНК с белками, сайты интеграции ретровирусов, области начала репликации, инсуляторы и т.д. ' Картирование таких последовательностей поможет лучше понять механизмы регуляции на уровне всего генома. Более того, исследование геномных последовательностей, окружающих эти элементы, позволит изучить регуляторные механизмы, определяющие активность отдельных генов.
Однако, многие регуляторные элементы невозможно
идентифицировать, исходя исключительно из их нуклеотидной
последовательности, для этого требуется непосредственный анализ их
активности. Следует учитывать, что в геноме они существуют в составе
хромосом, каждый элемент - со своим уникальным окружением,
способным влиять на его активность. Примером последовательностей,
содержащих ряд различных взаимодействующих между собой
регуляторных элементов, являются длинные концевые повторы
эндогенных ретровирусов (LTR - Long Terminal Repeat), содержащие:
ТАТА-бокс, участки связывания ядерных факторов и сигнал
полиаденилирования. В геноме человека присутствуют тысячи таких
регуляторных комплексов. Многие эндогенные ретровирусы обладают транскрипционной активностью, а одиночные LTR способны влиять на экспрессию близко расположенных генов.
Следовательно, должны существовать механизмы, ограничивающие влияние регуляторных комплексов в составе генов или повторяющихся элементов на другие гены. Эту роль, возможно, играют последовательности, обладающие инсуляторной активностью, т.е. способные нейтрализовать действие окружающих последовательностей на ген. Эта активность (в экспериментальных условиях) проявляется в защите трансгена от эффекта положения, а также в «экранировании» промотора 01 дистально расположенного энхансера. За последние 15 лет инсуляторы были обнаружены в геномах растений, беспозвоночных и позвоночных животных. С практической точки зрения инсуляторы могут бьпь использованы для разработки систем генной терапии и трансгеноза, а именно для создания системы экспрессии гетерологичных генов, не зависящих от эффекта положения, и не влияющих на окружение. На сегодняшний день отсутствуют данные о функциональных исследованиях протяженных участков геномов, целью которых бьшо бы выявление в них инсуляторов.
Недавние успехи секвенирования геномов открывают перспективы для нового направления - функциональной геномики, то есть для конструирования карт генов и транскрибируемых последовательностей и выявления их биологических функций и механизмов взаимодействий при помощи всей совокупности генетических, ЭВОЛЮЦИОННЫХ и биохимических методов.
Данная работа направлена на решение фундаментальной проблемы биологии - картирование регуляторных элементов генома человека и изучение их свойств.
Цеди и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось изучение свойств различных типов регуляторных элементов генома человека. Работа состояла из двух частей: первая была посвящена изучению тканеспецифичности промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей LTR, принадлежащего семейству HERV-K(HML-2), а вторая - выявлению участков ДНК хромосомы 19 человека, обладающих инсуляторной активностью. Для решения второй задачи необходимым этапом было создание метода, позволяющего проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК.
Были поставлены следующие экспериментальные задачи:
- в различных клеточных линиях определить транскрипционную
(промоторную и энхансерную) активность индивидуального LTR
семейства HERV-K(HML-2);
оценить влияние негативного регуляторного элемента (НРЭ) в составе LTR на его активность в различных клеточных линиях;
исследовать инсуляторную активность участков ДНК, связывающихся с ядерным матриксом (S/MAR-элементов - Scaffold/Matrix Attachment Region), в условиях временной трансфекции;
- разработать метод, позволяющий проводить поиск инсуляторов в
протяженных участках ДНК;
- применить разработанный метод для выявления инсуляторов в локусе
хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1;
- построить карту распределения инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и Сох7А1.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые было проведено комплексное исследование промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей одиночного LTR семейства HERV-K(HML-2). Учитывая, что значительная часть LTR сохранила свой регуляторный потенциал в процессе эволюции и может принимать участие в регуляции экспрессии клеточных генов, исследование свойств LTR представляется важной задачей. Нами показана зависимость транскрипционной активности LTR от типа клеток.
Нами были проанализированы пять S/MAR-элементов на наличие у них промоторной, энхансерной, сайленсерной и инсуляторной активностей. Два S/MAR-элемента проявили инсуляторную активность в условиях транзиентной трансфекции. При этом ни один из пяти не проявил промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей. Подобная схема анализа может быть использована для изучения других регуляторных последовательностей. Найденные инсуляторы могут применяться в векторных конструкциях для генной терапии и трансгеноза, а именно при создании системы экспрессии гетерологичных генов, независимой от эффекта положения.
Для проведения поиска инсуляторов в протяженных участках ДНК нами
был разработан метод, основанный на защите транскрипции репортерного гена
от влияния энхансера. Применение данного метода позволило нам выявить 8
инсуляторов в локусе хромосомы 19 человека между генами FXYD5 и CoxlAl.
Была построена карта их распределения относительно известных генов и
S/MAR-элементов, ранее картированных в данном локусе. Разработанный и
испытанный нами метод позволяет вьшвлять последовательности, обладающие инсуляторной активностью, что чрезвычайно актуально при создании функциональных карт геномов, поскольку в настоящее время не существует иных путей обнаружения инсуляторов, кроме прямого анализа специфической активности, который является очень трудоемким при исследовании протяженных последовательностей.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 2 статьи.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
-
VI чтения, посвященные памяти академика ЮА Овчинникова (Москва-Пущино, 2002);
-
2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution" (Сочи, 2003);
-
29th meeting on Retroviruses (Cold Spring Harbor, 2004);
-
XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005).
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 195 ссылок. Работа содержит 27 рисунков и 10 таблиц.
Жизненный цикл ретровирусов, их строение и синтез LTR
Несмотря на разнообразие видов-хозяев и вызываемых заболеваний, все ретровирусы имеют сходную структуру вириона, геномную организацию и репликативный цикл. Эндогенные ретровирусы по своей геномной организации близки про вирусам экзогенных ретровирусов, от которых они, возможно, произошли (Temin, 1980; Sverdlov, 1998). Хотя вследствие мутаций в процессе эволюции они утратили способность к размножению, некоторые, по-видимому, кодируют вирус-подобные частицы, например, HTDV (Human Teratocarcinoma-derived Virus) -продукт представителя семейства HERV-K(HML-2) (Lower et al, 1993; Lower et al, 1996). Такие частицы структурно похожи на вирионы экзогенных ретровирусов (рис.1).
Ретровирусный геном представляет собой две молекулы плюс-РНК длиной от 7 до 10 тн, нековапентно связанные между собой в 5 -области. Они взаимодействуют с ферментами - обратной транскриптазой (Reverse Transcriptase - RT), интегразой (Integrase - IN) и протеазой (Protease - PR) - продуктами гена/JO/ (Polymerase), необходимыми для перевода генетической информации из одноцепочечной РНК в двухцепочечную ДНК и ковалентного соединения вирусной и геномной ДНК, то есть для образования провируса (Leis et al, 1988; Umovitz and Murphy, 1996).
Кроме того, с геномной РНК ретровируса ассоциирована молекула тРНК, 18 3 -концевых нуклеотидов которой связываются с комплементарной нуклеотидной последовательностью (Primer Binding Site - PBS), локализованной на расстоянии 100-500 н.т. от 5 -конца генома. Эта молекула тРНК играет ключевую роль в репликации, являясь праймером для инициации синтеза ДНК обратной транскриптазой (Temin, 1981); (Агол в сб. "Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот", 1990).
Гены, кодирующие вирусные белки, фланкированы в геномной РНК нетранслируемыми последовательностями, обозначаемыми RU5 и U3R, состоящими из прямого концевого повтора (Redundant - R), ограничивающего 5 -специфичный (5 Unique - U5) и З -специфичный (3 Unique - U3) районы, на соответствующих концах генома. Последовательность расположения генов имеет вид gag-pol-ettv и является инвариантной для всех ретровирусов. Эти гены кодируют белки нуклеокапсида, ферменты и белки оболочки, соответственно. Однако у некоторых групп ретровирусов (так называемых сложных ретровирусов, например HTLV, HIV и др.) она может дополняться генами, регулирующими вирусную экспрессию. Недавно было показано существование последовательностей, гомологичных таким генам, в составе HERV-K(HML-2) про виру сов (Magin et ai, 1999).
Жизненный цикл ретровирусов можно разделить на две стадии (рис.1). Первая стадия обеспечивается вирусными белками, входящими в состав вириона, и проходит в отсутствии экспрессии вирусных генов. После попадания в клетку и частичного освобождения вирусной РНК обратная транскриптаза в цитоплазме внутри капсида синтезирует линейную двухцепочечігую ДНК-копию ретровирусного генома, которая встраивается в геном клетки при помощи интегразы. Синтезированный таким образом провирус содержит вирусные гены gag-pol-env} и, в силу особенностей механизма обратной транскрипции и интеграции, имеет на концах LTR, отсутствующие в геномной РНК и оказывается фланкирован 4-х - б-ти нуклеотидными прямыми повторами хозяйской ДНК (Temin, 1981; Varmus, 1982).
Вторая стадия репликативного цикла осуществляется системами репликации, транскрипции и модификации клетки-хозяина. Интегрированный провирус реплицируется и наследуется, как часть хромосомной ДНК. Благодаря образованию LTR, содержащих регуляторные последовательности (Ш -область содержит промоторные и энхансерные элементы, R (у HERV-K) — сигнал и сайт полиаденшшрования), активный провирус транскрибируется. Затем его РНК подвергается посттранскрипционным модификациям и сплайсингу и может быть транслирована с образованием вирусных белков-предшественников. Однако часть вирусной РНК сплайсингу не подвергается, а упаковывается в нуклеокапсид, который, отпочковываясь от клетки, образует вирусную частицу (Lower et al., 1996; Sverdlov, 1998). В отличие от экзогенных ретровирусов, в жизненном цикле ERV и ретротранспозонов отсутствует внеклеточная стадия, для которой необходимы белки Env. Полноразмерные HERV, как и провирусы экзогенных ретровирусов, содержат ген env, однако, до настоящего времени, их инфекционность не была показана. В настоящее время MMTV и JSRV (Jaagsiekte Sheep Retrovirus) могут служить примерами ретровирусов, находящихся как в экзогенной, так и в эндогенной форме у представителей вида-хозяина (Lower et al., 1996; QJn et al. 1999).
Ретроэлементы: происхождение, структура и классификация
Все ретроэлементы объединяет способность к ретротранспозиции, т.е. увеличению числа ДНК-копий в геноме хозяина с использованием механизма обратной транскрипции и реинтеграции. Характерной особенностью этого процесса является образование в сайте интеграции коротких прямых повторов хозяйской ДНК. Подавляющее большинство ретроэлементов в геноме транскрипционно не активны, а увеличение числа копий в геноме происходит, предположительно, за счет активности «мастер-генов» (Deininger etal., 1992).
Существуют две основные гипотезы, объясняющие возникновение экзогенных ретровирусов и ретроэлементов. Согласно одной из них, экзогенные предшественники ERV инфицировали на разных этапах эволюции клетки зародышевого пути предков современных животных, где реплицировались вместе с генами клетки-хозяина, подвергаясь внутригеномной амплификации путем ретротранспозиции (Lower et al, 1996). У потомков, развивавшихся из зараженных гамет, провирусы реплицировались вместе с генами хозяина во всех клетках его организма и наследовались по законам Менделя. Вследствие мутаций в процессе эволюции большинство ERV утратили ряд свойств экзогенных ретровирусов, например, способность к образованию инфекционных вирусных частиц (Sverdlov, 1998).
Выдвинутая Теминым протовирусная гипотеза предполагает последовательную эволюцию более сложных ретроэлементов от простых по структуре предшественников. Согласно этой точке зрения, ретроэлементы начали свою эволюцшо в геноме от предшественника гена/?о/. Приобретение путем рекомбинаций дополнительных регуляторних последовательностей, а также генов, кодирующих структурные белки, привело к возникновению наблюдаемого разнообразия ретроэлементов, в том числе экзогенных ретровирусов (Temin, 1971; Lindeskog, 1999).
Согласно одной из этих двух гипотез, можно предположить, соответственно, либо потерю, либо приобретение гена en v в ходе эволюции, что привело к превращению ретровирусов в ретротранспозоны или к возникновению экзогенных ретровирусов (рис.2). Следует отметить, что эти гипотезы не являются взаимоисключающими - эволюция ретроэлементов проходила, по-видимому, по обоим путям (Leib-Mosch and Seifarth, 1995). На основании структурных различий (и, предположительно, в соответствии с положением на эволюционной «лестнице») ретроэлементы подразделяют на несколько групп (табл.1) (Leib-Mosch and Seifarth, 1995; Lower et al, 1996; Andersson etal, 1998).
Псевдогены являются примером обратной транскрипции мРНК хозяина и реинтеграции кДНК в геном. Псевдогены, которые обладают промоторными последовательностями и поэтому активно транскрибируются, были названы ретрогенсши. Они амплифицированы до невысокого количества копий и не обладают активностью обратной транскриптазы. К ретрогенам можно отнести онкогены в составе провирусов и «мастер-гены» А1 и-повторов, произошедшие от гена 7SL РНК предков человека (Mighell et al, 1997).
Ретропозоны. У ретропозонов отсутствует ген env и длинные концевые повторы (рис.2). Как и ретротранспозоны, они не являются инфекционными. Ретропозоны подразделяются на основе наличия гена, гомологичного гену pol, (Long Interspersed Element - LINE) или его отсутствия (Short Interspersed Element - SINE) (Lower et ah, 1996). Они амплифицированы в геноме до чрезвычайно высокого количества копий, большинство из которых содержат множественные мутации и делеции. Так, например, Alu-повторы, относящиеся к SINE, являются наиболее многочисленными ретроэлементами в геноме человека с числом копий порядка 10б (Mighell et al, 1997; Lander et al, 2001). Ретропозоны транскрибируются с внутренних промоторов (поскольку не имеют механизма восстановления промотора после транскрипции, аналогичного синтезу LTR) LINE - РНК полимеразой II, a SINE - РНК полимеразой III (Leib-Mosch and Seifarth, 1995).
Ретротранспозоны присутствуют в геномах множества организмов - от простейших до человека. От ретровирусов они отличаются отсутствием гена env (рис.2). Ретротранспозоны амплифицированы до высокого числа копий, большинство из которых дефектны. Гомологичность последовательностей провирусов и ретротранспозонов, присутствие генов gag и рої и LTR означают, что последние могут быть предшественниками ретровирусов или, наоборот, ретро виру сами с делецией гена env.
Эндогенныеретровирусы (ERV). Ретровирусы можно считать специализированными мобильными элементами, способными быстро распространяться в популяции хозяина (Lower et а!., 1996). При сохранении способности к ретротранспозиции число копий провируса и одиночных LTR в геноме возрастает, хотя новых инфекций не происходит. Судя по тому, что геном человека содержит около 8% последовательностей, гомологичных последовательностям инфекционных ретровирусов (Lander et ah, 2001), такая внутриклеточная ретротранспозиция очень эффективна. Полноразмерные HERV, как и "классические" провирусы экзогенных ретровирусов, включают в себя гены gag, рої и env, кодирующие белки, необходимые для сборки инфекционных частиц, фланкированные длинными концевыми повторами, регулирующими их экспрессию. Одиночные LTR образуются в результате рекомбинации между фланкирующими LTR ретровируса и делеции внутренних последовательностей. Они представляют собой следы интеграции ретровирусов (Глазер 1998; Свердлов, 1999). В случае ретротранспозона gypsy Drosophila melanogaster, такая перестройка может проявиться фенотипически, как реверсия. При его интеграции между энхансером и геном, инсулятор в составе gypsy приводит к снижению экспрессии гена, а при рекомбинации он удаляется и экспрессия повышается (Modolell et al, 1983). Теоретически возможной является рекомбинация между двумя одиночными LTR или LTR двух разных провирусов, что приведет к инверсии или потере участка хромосомы хозяина. Однако детектировать подобные события возможно только при сохранении обоих аллелей в популяции вида-хозяина. Примером может служить человеческий ген рецептора гормона роста, третий экзон которого фланкирован фрагментами LTR семейства HERV-P или отсутствует (частоты встречаемости аллелей 75% и 25%, соответственно). В последнем случае в интроне между 2-м и 4-м экзонами остается продукт гомологичной рекомбинации - одиночный LTR (Pantel et ai, 2000).
Инсулятор: блокирование взаимодействия энхансера с промотором
По определению, инсуляторы - это последовательности ДНК, способные, находясь между промотором и энханссром, блокировать активирующее действие последнего in vivo, а также, будучи помещенными по краям генетической конструкции (трансгена), вводимой генно-инженерными способами в клетки, защищать экспрессию трансгена от эффекта положения (Kuhn and Geyer, 2003). Одним из первых доказательств существования элементов, способных блокировать энхансеры, стало исследование изменения уровня экспрессии гена yellow плодовой мушки Drosophila, вызванного вставкой ретротранспозоиа gypsy в регуляторную область этого гена. Экспрессия гена находится под контролем ряда тканеспецифических энхансеров. Вставка gypsy в 5 -область тепа yellow между дистальными энхансерами wing и body cuticle и проксимальным энхансером larval приводит к блокированию действия дистальных энхансеров на промотор, но не влияет на активность проксимального энхансера (Geyer et a!., 1990; Geyer and Corces, 1992). Вскоре были выявлены инсуляторные последовательности, ограничивающие локус генов теплового шока hsp70 в геноме Drosophila melanogaster. Они были названы специализированными структурами хроматина (scs /scs - specialized chromatin structures). В трансгенных мухах scs или scs -элемент, помещенный между промотором и энхансером, подавлял активацию транскрипции репортерного гена (Kellum and Schedl, 1992). Впоследствии анализ блокирования энхансера стал определяющим тестом на наличие инсуляторной активности.
С помощью этого теста, было идентифицировано несколько инсуляторов у других беспозвоночных и у позвоночных. К ним относятся sns-элементы (silencing nucleoprotein structure), расположенные в кластере ранних генов гистонов у морского ежа (Palla etal., 1997); RO-область межгенного спейсера генов рРНК у Xenopus (Robinettefa/., 1997), BEAD-элемент (blocking element alpha/delta-1) локуса a/6 рецептора T-клеток (TCR) человека, DMR-элемент (Differently Methylated Region) локуса Igf2/H19 человека (Zhong and Krangel, 1997), а также 5 - и З -границы локуса р-глобиновых генов цыпленка (Zhan et ah, 2001).
Во всех приведенных/известных случаях блокирование энхансера наблюдается только если исследуемый инсулятор расположен между энхансером и промотором. Следовательно, действие инсулятора зависит от его положения, хотя его ориентация относительно репортерного гена не имеет значения (Cai and Levine, 1995). При временной трансфекции, когда не происходит интеграции кольцевого вектора в хромосому, одной копии инсулятора оказывается недостаточно в силу двунаправленного действия энхансера. Для полного блокирования энхансера необходимо, чтобы он был фланкирован копиями инсулятора с обеих сторон (Recillasarga et al.t 1999; Parnell and Geyer, 2000). Этот результат также подтверждают более ранние исследования, показывающие, что инсулятор не ипактивирует ни энхансер, ни промотор, а только препятствует их взаимодействию друг с другом. Энхансер, ограниченный с одной стороны инсулятором, способен активировать транскрипцию генов, промоторы которых расположены с другой стороны. То же самое справедливо и для промоторов: будучи ограниченными инсулятором с одной стороны, они могут быть активированы под влиянием энхансеров, расположенных с другой стороны. Таким образом, инсулятор представляет собой барьер, придающий определенную направленность действию энхансера (Cai and Levine, 1995).
Вторым определяющим свойством инсуляторов является их способность ограничивать влияние репрессирующих и активирующих сигналов соседних областей хроматина на репортерный ген. Впервые это свойство было обнаружено у scs /scs-элементов. При стабильной трансформации клеток Drosophila конструкцией, содержащей ген miniwhite (управляемый минимальным промотором), ответственный за цвет глаз у плодовой мушки, были получены линии мух, различающиеся цветом глаз, что служит проявлением эффекта положения. Если ген miniwhite с обеих сторон был окружен последовательностями scs-элемента, то эффект положения был подавлен (Kellum and Schedl, 1991).
В дальнейшем было обнаружено, что gypsy-инсулятор также способен защищать от эффекта положения как репортерный ген (Bell et al., 2001), так и точку начала репликации (Lu and Tower, 1997). Gypsy обеспечивает полную дозо вую компенсацию сцепленного с мужской Х-хромосомой гена при его переносе на аутосому (Roseman et al., 1995). 5 - р -глобиновый инсулятор цыпленка (cHS4) также отвечает за независимую от места интеграции экспрессию трансгена у Drosophila (Chung et al.t 1993), как и в линии ранних эритроидных клеток цыпленка (Pikaart et al, 1998). Способность защищать от эффекта положения была продемонстрирована для А-элемента гена лизоцима цыпленка и З МАК-элемента гена аполипопротеина (АроВ) человека (Namciue/a/., 1998).
Первым инсулятором, обнаруженным в дрожжах S. cerevisiae, стал UASjpg-элемент (upstream activation site), являющийся участком промотора двух генов TEF1 и TEF2. Эти гены принадлежат к большому семейству генов, кодирующих компоненты трансляционной машины (ribosomal protein genes - RPG). Инсулятор обеспечивал устойчивость репортерного гена к сайленсингу, вызванному вставкой экспрессирующей конструкции в НМ-локус (л оку с генов спаривания гомоталличных штаммов дрожжей), хроматин которого находится в конденсированном состоянии (Bi and Broach, 1999). Все эти инсуляторы, за исключением gypsy-ретротранспозона и UASjpg, были обнаружены на границах отдельных генов или генных локусов, что соответствует их предполагаемой роли в поддержании хромосомных доменов и защите их от влияния окружающего хроматина (Bell et а!., 2001).
Трансформация E.coli и выделение плазмид
С другой стороны, ряд примеров указывает на консервативность действия некоторых инсуляторов: I) scs, gypsy, Fab-элементы блокируют активацию разных генов под действием разных энхансеров; 2) scs-элемситы Drosophila функционально активны в клетках Xenopus, р-глобиновый инсулятор цыпленка- в клетках Drosophila и человека. Возможным объяснением может служить предположение, что случай, когда энхансер и промотор находятся в непосредственной близости друг от друга, отличается от ситуации, когда они удалены друг от друга. Поэтому в дальнейшем необходимо более точно разобраться в особенностях взаимодействия энхансеров и промоторов (Bell and Fclsenfeld, 1999; Bell et al.t 2001; Zhan et aLt 2001).
Несмотря на все сложности, связанные с их изучением, инсуляторы начали находить практическое применение. Они могут стать незаменимым инструментом в прикладной генной терапии, атаюке для получения генетически модифицированных растений и животных. Ранее для увеличения эффективности экспрессии трансгенов предлагали применять сильные энхансеры, однако их способность влиять на окружающие трансген гены хозяина может приводить к нежелательным последствиям. Инсуляторы, с одной стороны, исключают влияние эффекта положения на трансген, с другой стороны, исключают влияние регуляторных элементов в составе трансгенной конструкции на геномное окружение в месте интеграции (Recillasarga et ai, 2004). Был получен ретровирусный вектор, содержащий у-глобшювые гены человека, фланкированные инсулятором cHS4 р-глобинового локуса цыпленка. Результатом трансфекции такой конструкции была стабильная экспрессия провируса, как в линии трансфицированных клеток, так и in situ при трансплантации мыши костного мозга, содержащего трансфицированные клетки (Emery et al,t 2000). Это исследование открывает возможность лечения р-гемоглобинопатий, таких как р-талассемия и серповидно-клеточная анемия.
В ходе другого исследования была показана активность инсулятора из генома морского ежа Hemicentrotus puicherrimus в клетках табака Nicotiana tabacum. Наличие инсулятора в векторной конструкции не влияло на позицию трансгенов в геноме или на их количество. Оно не приводило к повышению уровня экспрессии отдельных трансгенов. Однако общий уровень экспрессии заметно повышался. Эти результаты указывают на то, что в данном случае действие инсулятора также основано на подавлении эффекта положения Как было показано, регуляторными элементами рстровирусного провируса являются его длинные концевые повторы. Приведенные выше примеры указывают на наличие биологической активности у LTR представителей разных семейств эндогенных ретровирусов человека, наиболее интересным проявлением которой является их потенциальная способность влиять на экспрессию клеточных генов. При этом они сами находятся под влиянием геномного окружения, ядерных белков и других факторов, предоставляемых клеткой-хозяином. Исследование механизмов взаимодействия, сложившихся за миллионы лет совместного существования эндогенных ретровирусов и их хозяев, является интересной и актуальной задачей.
С учетом малого количества данных о регуляторном потенциале LTRHERV-K и, особенно, Ш-области в их составе, анализ ткапеспецифичности активности LTR и его фрагмента, содержащего делецшо З -концевой части Ш-области представляет несомненный интерес. S/MAR-элементы - участки ДНК, вовлеченные во взаимодействие с ядерным матриксом. По ряду данных, они обладают инсуляторной активностью, т.е. способностью блокировать взаимодействие между энхансером и промотором in vivo и, возможно, представляют собой целые инсуляторы или их фрагменты. Тем не менее, окончательного доказательства такого соответствия не существует. С целью получить дополнительную информацию об инсуляторной активности S/MARs из полученной рапсе библиотеки этих элементов были выбраны пять фрагментов ДНК, различающиеся по длине и сродству к ядерному матриксу, для проведения проверки этих последовательностей па наличие у них свойств инсуляторов (или других регуляторі іьіх элементов) в условиях временной трансфекции. Не все инсуляторы проявляют активность в условиях временной экспрессии. Кроме того, эксперимент по временной экспрессии не позволяет исследовать одновременно множество последовательностей, в то время как именно поиск новых инсуляторов приблизит нас к разгадке механизмов их действия и регуляции экспрессии генов. Поэтому необходимо разработать систему для выявления инсуляторных свойств изучаемых последовательностей при интеграции в геном и использовать ее для функционального анализа протяженных участков геномной ДНК. Для проверки системы использовали локус хромосомы 19 человека между генами FXYD5KCOX7A1.
