Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 8
1.1.Общая характеристика герпесвирусов 8
1.2. Строение и вариабельность генома герпесвирусов человека 11
1.3. Клиническая характеристика герпесвирусных инфекций 15
1.4. Значение герпесвирусов в урогенитальной патологии 17
1.5. Значение герпесвирусов в трансплантологии 20
1.6. Латентность герпесвирусов 24
1.7. Методы диагностики герпетических инфекций 26
2. Материалы и методы 35
2.1. Характеристика клинических образцов 35
2.2. Штаммы вирусов и контрольные ДНК 35
2.3. Выделение ДНК 37
2.4. Подбор праймеров 37
2.5. Полимеразная цепная реакция 38
2.6. Рестрикционный анализ 40
2.7. Секвенирование 40
2.8. Статистическая обработка данных 40
3. Результаты исследований 41
3.1. Конструирование диагностических систем для комплексной детекции герпесвирусов человека 41
3.1.1. Выбор генетической мишени для комплексной детекции герпесвирусов 41
3.1.2. Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1 и 2), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и вируса герпеса человека 8 типа (ВГЧ 8) 42
3.1.3. Проверка работоспособности праймеров и оптимизация условий проведения ПЦР 45
3.1.4. Анализ рестрикционного полиморфизма амплифицируемого универсального фрагмента гена ДНК-полимеразы вирусов ВПГ-І, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8 48
3.1.5. Конструирование ПЦР-системы для комплексной детекции и дифференциации вирусов герпеса человека 6 и 7 типа (ВГЧ-6 и -7) 53
3.2. Изучение видового многообразия герпесвирусов человека, выявляемых в биоматериале медицинского значения 56
3.2.1. Определение аналитической и диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» 56
3.2.2. Сравнение способов обработки клинического материала для ПЦР-анализа 58
3.2.3. Значение комплексного выявления герпесвирусов в клиническом материале урологического и гинекологического профиля 60
3.2.4. Определение частоты встречаемости герпесвирусов у доноров аллотрансплантанта почки. Изучение особенностей течения раннего посттрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров 63
4. Обсуждение результатов 66
Выводы 76
- Строение и вариабельность генома герпесвирусов человека
- Латентность герпесвирусов
- Штаммы вирусов и контрольные ДНК
- Изучение видового многообразия герпесвирусов человека, выявляемых в биоматериале медицинского значения
Введение к работе
В своей практической деятельности врачи многих специальностей встречаются с заболеваниями, вызванными вирусами группы герпеса. В настоящее время известно 8 видов герпесвирусов человека. Герпесвирусы являются у человека возбудителями таких заболеваний как оральный и генитальный герпес, ветряная оспа и опоясывающий лишай, цитомегалия, лимфома Беркита и инфекционный мононуклеоз. В последнее время с герпесвирусами связывают атеросклероз и ИБС, ревматоидный артрит, рассеянный склероз. По данным ВОЗ около 90% населения земного шара инфицировано одним или несколькими герпесвирусами. Первичное инфицирование, как правило, происходит в детском возрасте, после чего герпесвирус переходит в латентное состояние, которое характеризуется отсутствием вирусной репликации и экспрессией вирусных белков. Реактивация герпесвирусов из латентной формы происходит на фоне стрессов, эндокринных нарушений, у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами, а также проходящих иммуносупрессорную терапию (например, после трансплантации органов). У больных с иммунными нарушениями не только высок риск развития герпетической инфекции и отмечается ее более тяжелое течение, но и показана более высокая частота появления резистентных штаммов, что затрудняет проведение противовирусной терапии.
На сегодняшний день существует ряд методов диагностики герпетической инфекции (выявление антигенов при помощи иммуноферментного анализа, серологическая диагностика или изоляция вируса в культуре клеток), но в последние годы все большее внимание уделяется молекулярно-генетическим способам диагностики. Большинство из них построено на принципе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несовершенство таких способов диагностики отчасти связано с моноспецифическим характером систем детекции, которые не обеспечивают выявление всего многообразия видов герпесвирусов, вовлекаемых в развитие патологических состояний. Широкий спектр клинических проявлений, возникновение сочетанных герпесвирусных инфекций, увеличение частоты появления резистентных штаммов и штаммов с нетипичными клиническими проявлениями заставляет пересматривать традиционные способы диагностики и искать новые подходы, В связи с этим разработка новых методов комплексной детекции и дифференциации, основанных на современных знаниях генетического видового разнообразия герпесвирусов при различных патологических состояниях является актуальной задачей фундаментальной и практической вирусологии.
Цель и задачи исследования.
Целью работы явилась разработка молекулярно-генетических подходов для комплексной детекции и дифференциации герпесвирусов человека, позволяющих решать широкий круг научно-практических задач медицинской вирусологии.
Для достижения поставленной цели был определен ряд задач:
Проведение компьютерного анализа современных баз данных нуклеотидных последовательностей геномов герпесвирусов для выбора наиболее консервативной генетической области.
Подбор праймеров и конструирование диагностических системы для комплексной детекции вирусов герпеса человека, основанных на методе ПЦР.
Подбор методов межвидовой генетической дифференциации герпесвирусов, основанных на своеобразии нуклеотидных последовательностей выбраной генетической области.
Изучение генетической стабильности выбранной мишени в природной популяции герпесвирусов.
Клонирование амплифицируемой генетической области всех герпесвирусов и создание банка контрольных матриц.
Оределение специфичности и чувствительности разработанных диагностических систем.
Изучение роли комплексного выявления герпесвирусов при урогенитальной патологии.
8. Определение частоты встречаемости герпесвирусов у доноров аллотрансплантанта почки. Изучение особенностей течения раннего посттрансплантационного периода у реципиентов, получивших органы от инфицированных доноров.
Основные положения, выносимые на защиту.
Данные по изучению генетического полиморфизма гена ДНК-полимеразы герпесвирусов человека.
Разработка молекулярно-генетического метода комплексной детекции и дифференциации пяти видов герпесвирусов человека: ВГГГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8.
Разработка молекулярно-генетического метода одновременной детекции и дифференциации ВГЧ-6 и ВГЧ-7.
Целесообразность проведения комплексного обследования на герпесвирусы человека в гинекологии и трансплантологии.
Строение и вариабельность генома герпесвирусов человека
Геном герпесвирусов представлен линейной двуцепочечной ДНК с молекулярной массой 84-160 МД. Среди человеческих герпесвирусов только ДНК вируса Эпштейна-Барр обнаружена как ковалентно замкнутая циркулярная ДНК. Размер генома, число открытых рамок считывания и G+C состав сильно варьируют у разных видов герпесвирусов Самый большой геном имеет цитомегаловирус, а самый маленький вирус Варицелла-Зостер (таблица 2). Характерной чертой организации герпесвирусного генома является наличие уникальных (U) и повторяющихся фрагментов (R). Интересно отметить, что характер распределения уникальных и повторяющихся последовательностей у различных представителей семейства герпесвирусов, по-видимому, отражает структурную эволюцию генома этой группы [2]. Уникальные фрагменты составляю большую часть генома и разделяются на два типа: UL (уникальный длинный «82% генома) и US (уникальный короткий »18% генома). Около 40 генов UL области консервативные среди всех герпесвирусов. US фрагмент генома гораздо больше подвержен изменениям и включает инвертированные повторы размером от 5 (ВВЗ) до 13 kb (ВПГ1) у Alphaherpesvirinae и 35kb у Betaherpesvirinae [53]. Повторяющиеся фрагменты (R), также могут быть термиальными и инвертированными. Так, например, геном ВПГ состоит из двух уникальных регионов UL и US, фланкированных инвертированными повторами внутри (IRL и IRS) и снаружи (TRL и TRS) (рисунок 1). Во время заболевания US и UL компоненты инвертируют относительно друг друга за счет гомологии прямых и инвертированных повторов, так что популяция вирусной ДНК состоит из эквимолярных количеств 4 изомеров, различающихся друг от друга только относительной ориентацией 2 компонентов (2). В отличие от ВПГ характерной чертой генома ВЭБ является наличие большого числа повторов - большой внутренний повтор (IR1) и другие повторы (IR2-IR4), которые чередуются с уникальными последовательностями (U1-U5). Повторы различно представлены в том или ином штамме и определяют полиморфизм ряда кодируемых белков по молекулярной массе [14]. В герпесвирусном геноме выделяют 3 подгруппы генов: сверхранние (IE), ранние (Е) и поздние (L). Это деление основано на очередности их экспрессии. Экспрессия этих групп генов и, соответственно, синтез кодируемых ими белков подвержены каскадной регуляции [13]. IE - первая группа генов, которые транскрибируются клеточной РНК-полимеразой и не требуют для транскрипции присутствия синтезированных de novo белков.
Продуктом IE - генов является, например, белок ICP, который участвует в установлении латентного состояния ВПГ-1 и его реактивации. Транскрипция IE -генов находится под контролем большого 1Е-промотора (MIEP). Известно два клеточных белка-репрессора транскрипции IE -генов -MBF1 и YY1, которые связываются с регуляторной областью MIEP и ингибируют транскрипцию [78]. Продукты Е-генов - это вирусспецифическая ДНК-полимераза и тимидинкиназа, необходимые для биосинтеза ДНК герпесвирусов. Другие Е-гены выключают экспрессию генов клетки-хозяина и генов первой группы и инициируют работу группы поздних генов - L. Примером Е-гена является интересный с функциональной точки зрения ген, кодирующий белок названный процессивным фактором (ПФ), который образует комплекс с ДНК-полимеразой. Образование такого комплекса необходимо для эффективной репликации вируса in vivo. В отсутствии процессивного фактора вирусная ДНК-полимераза сохраняет каталитическую активность, но существенно снижается процессивность. Причем функциональное взаимодействие ПФ и ДНК-пол им еразы строго специфично для каждого герпесвируса [65]. Белки, кодируемые группой L-генов, являются структурными полипептидами вириона и в основном представлены оболочечными гликопротеинами. Кроме того, даже наиболее консервативные гены герпесвирусов имеют внутривидовую вариабельность. Так, проведенное сравнение сиквенсов 46 клинических изолятов ЦМВ и штамма AD-169 показало, что для МШ гена процент гомологии составляет 96,7%, для гена ДНК-полимеразы - 97,2%, а для гена гликопротеин В - 98,9% [93]. Филогенетически к ЦМВ наиболее близки ВГЧ-6 и ВГЧ-7; между ДНК ЦМВ и ВГЧ-6 существует от 41 до 75,8% гомологии, а между ДНК ВГЧ-7 и ВГЧ-6 существует от 46,6 до 84,9% гомологии. Интересно отметить, что ВГЧ-6 имеет ряд генов, гомологичных даже ВПГ-1. Вероятно, геном ВГЧ-6 наиболее близок к «герпесвирусу-предшественнику» известных в настоящее время герпесвирусов позвоночных. Определенная генетическая общность между ВГЧ-6 и ВПГ-1 может служить объяснением некоторых наблюдаемых биологических свойств ВГЧ-6, например, его способность вызывать неврологические болезни и относительно широкий спектр клеточных хозяев [53]. 1.3. Клиническая характеристика герпесвирусных инфекций. По данным разных исследований [8, 17, 19, 79] к 18 годам более 90% жителей городов инфицируются одним или несколькими штаммами герпесвирусов. В большинстве случаев первичное и повторное инфицирование происходит воздушно-капельным путем при прямом контакте или через предметы обихода и гигиены (общие полотенца, носовые платки и т.п.). Доказаны также оральный, генитальный, орогенитальный, трансфузионный, трансплантационный и трансплацентарный пути передачи инфекции.
По-видимому, все известные герпесвирусные инфекции могут рецидивировать, однако, как следует из многовекового опыта наблюдения за ними, порог и причины трансформации острой формы в рецидивирующую для каждого типа герпесвируса свои. Так, например, рецидивирование инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, нередко наблюдается на фоне стрессов, неспецифических эндокринных нарушений, изменения географической зоны проживания, гиперинсоляции и др. У пожилых людей, перенесших в детском возрасте ветряную оспу, рецидив инфекции, вызванной вирусом варицелла зостер, протекает в форме опоясывающего лишая (опоясывающего герпеса). Субклинические рецидивы цитомегаловирусной инфекции чаще всего наблюдаются у беременных и больных, получающих иммуносупрессорную терапию. В то же время инфекции, вызванные вирусом Эпштейн-Барр, рецидивируют только у больных с врожденным или приобретенным иммунодефицитом. Рецидивирующие герпесвирусные заболевания у некоторых людей могут восприниматься как "хронические", когда они продолжаются в течение многих лет, разрушая не только физическое здоровье и функции жизненно важных систем, но и психологически калеча больного. В таблице 4 приведены основные формы клинического проявления герпесвирусных инфекций. Существует ряд заболеваний связь которых с герпесвирусами в настоящее время активно изучается (атеросклероз и ИБС, ревматоидный артрит, рассеянный склероз). Имеется большое количество работ, посвященных поискам взаимосвязи маркеров ЦМВ и ВПГ-1 в крови с атеросклеротическим поражением сосудов сердца. Обнаружена корреляция между величинами титра антител к этим вирусам и степенью развития заболевания коронарных сосудов и даже размером атеросклеротических бляшек [78]. Предполагается этиологическая роль ВЭБ в патогенезе онкологических, преимущественно лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваний (ревматоидного артрита, васкулитов, неспецифического язвенного колита) [18]. Причина развития рассеянного склероза также до конца не выяснена. На роль вирусного агента в данном случае претендует ВГЧ-6. Предполагают, что болезнь может быть связана с вирусной инфекцией, перенесенной в раннем детстве и аутоиммунными процессами в ЦНС [34, 36].
Латентность герпесвирусов
Латентность - это способность вируса к персистенции в инфицированных клетках в отсутствие вирусной репликации и практически без экспрессии вирусных белков, которые могли бы стать мишенями для иммунного ответа. При этом интеграция вирусной ДНК в геном клетки-хозяина не происходит. В латентном состоянии вирусный геном переходит в нереплицирующееся состояние, которое обеспечивает ген, кодирующий синтез самого раннего белка (синтезируется до репликации вирусной ДНК и вовлекается в процесс транскрипции других вирусных генов), специфичного для каждого вида герпесвируса. Предполагается, что этот процесс регулируется не самим вирусом, а генным аппаратом клетки хозяина. Клинически латентная стадия характеризуется присутствием специфических IgG против вируса (серопозитивность), а сам вирус в этот период у людей с нормальным иммунным статусом в периферической крови не определяется даже таким высокочувствительным методом, как полимеразная цепная реакция (ПЦР). При латентной инфекции герпесвирусы находятся в определенных клетках-депо организма, которые специфичны для каждого типа герпесвируса. Альфа-герпесвирусы (ВПГ и вирус ВВЗ) в латентном состоянии находятся в клетках паравертебральных сенсорных ганглиев. Персистенция этих вирусов сопровождается экспрессией только одного РНК-транскрипта -латентно-ассоциированного транскрипта (LAT), функция которого до конца не ясна [78]. Существуют две гипотезы для обьяснения механизмов персистенции ВПГ: статическая и динамическая. Согласно статической гипотезе под влиянием «пускового фактора» вирус активируется и перемещается из ганглия по аксону периферического нерва в эпителиальные клетки, где реплицируется. Динамическая гипотеза предусматривает постоянную репликацию и выброс из ганглиев небольших количеств вируса герпеса. По нервному волокну достигая кожи, вирус вызывает микрофокусы инфекции, сдерживаемые механизмами защиты, что предупреждает рецидивы или ослабляет их проявление [13]. Механизм персистенции бета-герпесвирусов (в особенности ЦМВ) на сегодняшний день является предметом изучения многих лабораторий мира. У здоровых серопозитивных доноров ЦМВ был обнаружен в моноцитах периферической крови, а также в CD34+ гемопоэтических клетках-предшественниках. Реактивация вируса происходит в тот момент, когда моноциты периферической крови дифференцируются в макрофаги под влиянием цитокинов [31]. Вероятность персистенции ЦМВ в латентном состоянии в других клетках периферической крови очень мала. Другие исследователи предполагают, что ЦМВ в состоянии латентности может находиться в эндотелиальных клетках артерий и капилляров [43, 47]. Для ВГЧ-6 известно два известных сайта латентности - моноциты и Т-лимфоциты периферической крови [25]. Гамма-герпесвирусы (ВЭБ) в состоянии латентности локализуются в В-лимфоцитах, эпителиоцитах назофарингеальной области и слюнных желез.
Число вирусных копий в латентном состоянии небольшое и клетка не разрушается, Персистенция ВЭБ в В-лимфоцитах сопровождается экспрессией ограниченного набора вирусных генов, кодирующих функции необходимые для сохранения эписомальной вирусной ДНК во время деления В-клеток. В ядре клетки-хозяина ДНК ВЭБ может не только формировать эписому (кольцевую структуру), но и встраиваться в геном, вызывая хромосомные нарушения [18]. В литературе имеются данные о высоком проценте (до 50%) обнаружении ВЭБ в стенке артерий у пациентов не имеющих в анамнезе заболеваний сердечнососудистой системы [47]. Это указывает на то, что эндотелий артериальной стенки также может быть потенциальным местом персистенции ВЭБ. 1.7. Методы диагностики герпетических инфекций. Диагностика герпетических инфекций представляет собой достаточно сложную задачу, что объясняется как широким спектром клинических проявлений, так и недостатками традиционно использующихся диагностических методов. Методы диагностики герпетических инфекций. Электронная микроскопия (ЭМ) У Цитологический метод Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Вирусологический метод Иммуноферментный анализ (ИФА) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) Электронная микроскопия, С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1-Ю6 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет типировать герпесвирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. Так, вирусы простого герпеса, цитомегалии или опоясывающего герпеса морфологически практически неотличимы. Цитологический метод. Материалом для исследования служит содержимое везикул, соскоб со дна эрозии, слизистой уретры, стенок влагалища, цервикального канала, конъюнктивы глаз. Метод заключается в обнаружении в исследуемом материале многоядерных гигантских клеток с внутриядерными включениями. Несмотря на доступность и простоту, недостатком цитологического метода диагностики является невозможность дифференциации разных типов герпесвирусов, а также первичной инфекции от рецидивирующих.
В ряде случаев по характеру цитопатического действия возбудителя можно доказать лишь вирусную природу. Вирусологический метод позволяет наиболее достоверно поставить диагноз герпетической инфекции и предполагает использование культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов или человека. Однако метод длителен по времени (2-6 недель) и мало доступен для практического здравоохранения. В настоящее время появилась модификация метода - быстрый культуральный метод. Сущность метода заключается в том, что материал полученный от больного, культивируют совместно с культурой клеток Vero в течение 24 часов, после чего проводят выявление ранних антигенов вируса в реакции непрямой иммунофдюоресценции. Метод позволяет получить результат в течение двух суток. Реакция иммуиофлюоресценции позволяет обнаружить антигены вируса в различном материале - мазки, соскобы, ликвор, кровь, сперма, слезная жидкость, моча - с помощью моноклональных антител, связанных с красителем, например флюоресцеин-изотиоцианатом. При оценке результатов обращают внимание на характер и количество антигенсодержащих клеток, локализацию специфического свечения и его интенсивность. По количеству светящихся клеток делают заключение об интенсивности выделения вируса. Для ВПГ характерна локализация в ядре или в ядре и цитоплазме одновременно. Чувствительность и специфичность данного метода составляют соответственно 90% и 96%. Наряду с этими характеристиками, быстрота получения результата исследования (в течение 1-2 часов), его доступность делают метод основным в клинической лабораторной диагностике, что особенно важно при обследовании новорожденных детей с тяжелой формой заболевания.
Штаммы вирусов и контрольные ДНК
В качестве контрольных препаратов вирусной ДНК использовали суммарную ДНК культур клеток Vero, инфицированных штаммами: УСІ, Л2, ЕС, Kleiman (ВПГ-1), G и ВН (ВПГ-2), АД-169 (ЦМВ), а также лимфобластоидную перевиваемая клеточную линию P3HR1 (ВЭБ), и клеточную линию BCBL (ВГЧ-8). Препараты культур клеток получены из коллекции ГЦНИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и НИИ Канцерогенеза им. Блохина РАМН (BCBL). Кроме того, использовали коммерческий препарат геномной ДНК ВГЧ-6 (НИИ эпидемиологии МЗ РФ). Клонирование фрагментов ДНК герпесвирусов для получения контрольных препаратов ДНК. В экспериментах по отработке аналитической чувствительности в качестве контрольной ДНК использовали клонированные фрагменты вирусной ДНК. Клонирование вирусных фрагментов проводили следующим образом. Использовали систему клонирования на основе вектора pGEM. Ампликоны герпесвирусов ВПГ-1, ВПГ-2, ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-8 размером 800 п.н., полученные с праймерами HV1 и HV3 (см. раздел "Результаты исследований"), очищали от компонентов реакционной смеси с помощью набора Wizard PCR preps DNA Purification фирмы "Promega". Очищенные ампликоны лигировали с вектором pGEM и трансформировали в компетентные клетки XL-BLUE. Полученные рекомбинантные клоны были проанализированы методом ПЦР и отобраны трансформанты, дающие положительный сигнал с праймерами HV1 и HV3. Последующий отбор нужных клонов проводился на основе рестрикционного анализа вставок, при котором использовали рестриктазы Ncol, Smal для ВПГ-1 и ВПГ-2; Pstl, Smal и Ват HI для ВЭБ; Rsal и Рае\ для ЦМВ, Ndel и Bglll для ВГЧ-8. Для определения чувствительности готовили 10-кратные разведения плазмидных ДНК с исходной концентрацией 1 мкг/мкл. При постановке ПЦР положительный сигнал получали при разведении плазмидной ДНК в 1012 раз для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и в 10й раз для ВГЧ-8. Исходя из этих данных можно расчитать минимальное количество копий ДНК плазмиды (N) всех герпесвирусов, выявляемое универсальной ПЦР-системой по формуле: С (мкг/мл) -10 -6,02- 1023 N (геном-эквивалент/мл) = D-660 Где С (мкг/мл) - концентрация ДНК 6,02-10 - число Авогадро D - длина плазмиды со встроенным фрагментом - 3,7 -10"3 п.н. 660 - средняя молекулярная масса нуклеотидной пары (грамм) Также было проведено клонирование фрагментов ДНК ВГЧ-6 и ВГЧ-7 размером 723 п.н. с праймерами П67-1 и П67-2. Для определения чувствительности готовили 10-кратные разведения плазмидных ДНК с исходной концентрацией 1 мкг/мкл.
При постановке ПЦР положительный сигнал получали при разведении плазмидной ДНК в 10 раз для обоих вирусов. 2.3. Выделение ДНК. Выделение ДНК из инфицированных клеточных культур. Клетки промывали в lxPBS (20мМ фосфатный буфер с 0,15 М NaCl, рН 7.5. К осадку добавляли 200 мкл лидирующего буфера (Трис-НС1 10 мМ рН 8.0; 0,5% Tween-20 и 100 мкг/мл протеиназа К (Sigma, USA) и инкубировали при 56С в течение часа. Протеиназу инактивировали нагреванием до 95 С в течение 10 минут. Затем смесь центрифугировали 5 минут при 10000 об/мин и 3 мкл супернатанта анализировали в ПЦР. Выделение ДНК из урогениталъного материала и биопсийного материала. Соскобный клеточный материал из влагалища и уретры и биопсийный материал промывали в lxPBS. К осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера и инкубировали как описано выше. В реакцию ПЦР брали 3 мкл супернатанта. Выделение ДНК из цельной крови. Цельную кровь с добавлением 6 мМ ЕДТА в качестве антикоагулянта центрифугировали в градиенте Histopaque-119 (Sigma, USA). Затем собирали лейкоцитарную фракцию и дважды промывали лейкоциты в lxPBS. К осадку лейкоцитов добавляли 100 мкл лизирующего буфера и инкубировали как описано выше. 3 мкл супернатанта анализировали в ПНР. Выделение ДНК методом экстракции ДНК сорбентом. Выделение ДНК из урогениталъного материала проводили согласно методике «ДНК-сорб-А» (АмплиСенс, НИИ эпидемиологии МЗ РФ) 2.4. Подбор праймеров. При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов пяти герпесвирусов ВПГ-1(Х14112), BIiT-2(Z86099), ЦМВ(Х17403), ВЭБ(У01555) и ВГЧ-8(и93872) в программе MACAW 2.0.5 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) были идентифицированы три консервативные области в гене ДНК-полимеразы. К каждой области подобраны праймеры HV1, HV2 и HV3, которые обеспечивали специфическую амплификацию ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ, ВЭБ и ВГЧ-8. HV1 5 -CGTGTT(CTG)GACTTTGCCAGCCT-3 HV2 5 -GAGTCCGTGTCCCCGTAGATGT-3 HV3 5 -AC(GC)AG(AGC)TCCACGCCCCTT-3 При анализе геномов ВГЧ-6А (Х83413), ВГЧ-6В (AF157706) и ВГЧ-7 (U43400) в программе MACAW 2.0.5 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA) были подобраны праймеры в гене ДНК-полимеразы для мультиплексной амплификации: П 67-1 5 -CCTTCACAAAATCGCAAGAAGTC-3 П 67-2 5 GATGGCTCATAATCTGTGTTATAG-3 П 6 5 -ACGATCTGTGATATGTTTGG-3 П 7 5 GTCCGAATACATGGCGCTGTC-3 2.5. Полимера зная цепная реакция. ПЦР в системе «Пентагерп». Реакционная смесь объемом 30 мкл включала 10 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 50 мМ KCI, 0,5% Tween-20, 5% формамида, 200 мкМ каждого dNTP, 2 мМ MgC , 1 пкмоль праймеров HV1 и HV3 для 1 этапа и 2 пкмоль прайм еров HV1 и HV2 для 2 этапа, 1 U Taq полимеразы и 3 мкл тестируемого образца. ПЦР проводили в два этапа на амлификаторе ТЕРЦИК (Россия). Режимы амплификации на первом и втором этапах были одинаковыми - 1 цикл состоял из 4 мин при 95С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 60С, 1 мин при 72С и 40 сек при 95С; 1 цикл 4 мин при 72С. После первого этапа амплификации 1 мкл амплификата переносили в новую реакционную смесь и повторяли амплификацию. На первом этапе реакционная смесь содержала праймеры HV1 и HV3, а на втором этапе - праймеры HV1 и HV2. ПЦР в системе «Герп 67». ПЦР - смесь объемом 30 мкл включала 10 мМ Трис-НС1, рН 8.8, 50 мМ КС1, 0,5% Tween-20, 5% формамида, 200 мкМ каждого dNTP, 2 мМ MgCb, 1 пкмоль праймеров П67-1 и П67-2 для 1 этапа и 1 пкмоль праймеров П6, П7 и П67-2 для 2 этапа, 1 U Taq полимеразы и 3 мкл тестируемого образца. ПЦР проводили в два этапа на амлификаторе ТЕРЦИК (Россия). Режимы амплификации на первом и втором этапах были одинаковыми - 1 цикл состоял из 4 мин при 95С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 55С, 1 мин при 72С и 40 сек при 95С; 1 цикл 4 мин при 72С. После первого этапа амплификации 1 мкл амплификата переносили в новую реакционную смесь и повторяли амплификацию. Для избежания ложноположительных результатов каждый образец исследовали в трех независимых экспериментах. ПЦР с праймерами к гену /3-глобину. Данную реакцию проводили для исключения наличия ингибиторов ПЦР в исследуемых клинических образцах. ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК (Россия) в один этап в режиме 1 цикл 4 мин при 95С; затем 30 циклов состоящих из 30 сек при 55С} 1 мин при 72С и 40 сек при 95С; 1 цикл 4 мин при 72С.
Состав реакционной смеси см. выше. Праймеры - BGPc03-l и BGPcOS - использовали в концентрации 5 пкмоль/мкл. Образование ампликонов в данной реакции подтверждало отсутствие ингибиторов в исследуемом образце. BGPc03-l 5 - АСА САА CTG TGT ТСА СТА GC -3 BGPc05 5 - GAA АСС САА GAG ТСТ ТСТ СТ -3 По окончании амплификации продукты реакции анализировали электрофоретически в 1,5% агарозном геле с этидием бромидом. В качестве маркера молекулярной массы ДНК использовали плазмиду pUC 19, обработанную эндонуклеазой Msp I. Размеры фрагментов: 501 / 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111/110, 67, 34, 26 п.н. 2.6. Рестрикционный анализ. Каждая ПЦР-позитивная реакционная смесь подверглась рестрикционному анализу с ферментами Taq\ и Hinfl (Fermentas, Литва). Общий объем смеси для рестрикции составлял 20 мкл, из которых 8 мкл ПЦР-смесь, 2 мкл соответствующего рестрикционного буфера и 1-2 U фермента. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при 37С (Hinfl) или при 65С (Taql). Образцы после рестрикции анализировали посредством электрофореза в 1,5% агарозном геле. 2.7. Секвенирование. Секвенирование проводили с использованием набора Thermo Sequenase Су5 Dye Termination Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Ltd). Разделение фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ALFexpressII фирмы Amersham BioSciences (USA). 2.8. Статистическая обработка данных. Для описания данных использовали методы описательной статистики. Указывали количество случаев (п), для количественных признаков - среднее значение (М), стандартное отклонение и диапазон значений; для качественных - абсолютные и относительные частоты. Для сравнения качественных признаков применяли критерий х2 и двухуровневый критерий Фишера (при количестве наблюдений 5).
Изучение видового многообразия герпесвирусов человека, выявляемых в биоматериале медицинского значения
Чувствительность, наряду со специфичностью, является основополагающей характеристикой любой тест-системы, претендующей на выявление возбудителя в клиническом материале. В приложении к клинико-диагностическим проблемам разделяют аналитическую и диагностическую чувствительность. Только определив эти показатели можно определить область применения диагностических систем и их возможности. Для систем комплексной детекции сразу нескольких видов возбудителей, важной характеристикой является также уровень чувствительности для каждого из детектируемых видов. Аналитическую чувствительность ПЦР-системы «Пентагерп» оценивали в экспериментах с коммерческими образцами вирусной ДНК и с плазмидными ДНК, содержащими клонированные фрагменты вирусов ВПГ-1, ВПГ-2 ЦМВ, ВЭБ, ВГЧ-8 (см. «Материалы и методы»). В первом случае матрицами вирусной ДНК являлись препараты контрольных ДНК ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). Исходная концентрации ДНК по паспорту составляла для ВПГ-1 - 1,7-Ю5 копий в мл, для ВПГ-2 - 2,5-Ю4 копий в мл, для ЦМВ - 1,46-105 копий в мл, для ВЭБ - 1,28 104 копий в мл. Тестирование десятикратных разведений контрольных ДНК в системе «Пентагерп» дало следующие показатели чувствительности системы: для ВПГ-1 - 170 копий в мл, для ВПГ-2 - 250 копий в мл, для ЦМВ - 146 копий в мл и для ВЭБ - 128 копий в мл. В экспериментах с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК, содержащей клонированные фрагменты вирусов минимальное количество плазмидной ДНК, выявляемое системой «Пентагерп» составило 1 фг/мл для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ, и 10 фг/мл для ВГЧ-8, что в пересчете на число копий плазмидной ДНК составило 200 геном-экв/мл для ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ и ВЭБ и 2000 г-экв/мл для ВГЧ-8. Как видно из результатов, оценка чувствительности ПЦР системы «Пентагерп», полученная двумя независимыми исследованиями, имела близкие показатели. Аналитическую чувствительность системы «Герп 67» определяли также в двух независимых экспериментах с коммерческим препаратом ДНК ВГЧ-6 (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) и плазмидной ДНК, содержащей клонированные фрагменты вирусов ВГЧ-б и ВГЧ-7 (см. «Материалы и методы»). Тестирование 10-кратных разведений коммерческого препарата ДНК ВГЧ-6, содержащего 1,110 г-экв/мл вирусной ДНК, определило чувствительность системы «Герп 67» на уровне 100 г-экв/мл. Минимальное количество плазмидной ДНК, выявляемое системой «Герп 67», составило 1 фг/мл для ВГЧ-6 и ВГЧ-7, что в пересчете на число копий плазмидной ДНК составило 200 копий в мл. Для сравнения диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» с коммерческим использовали ПЦР-системы ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ - «АмшшСенс ЦМВ» и «АмплиСенс ВГЧ-6». Объектами исследования являлись ДНК ЦМВ и ВГЧ-6, соответственно. Материалом для исследования служили 75 клинических образцов для системы «Пентагерп» и 58 клинических образцов для системы «Герп 67». Все клинические образцы предварительно прошли тестирование в ГЩР системе с праймерами к гену 5-глобина.
Результаты исследования показаны в таблице 9, из которой следует что различий в диагностических показателях коммерческих и разработанных нами ПЦР-систем не выявлено. Таким образом, определение аналитической и диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» показало, что системы обладают достаточно высокой чувствительностью, соответствующей высокочувствительным коммерческим диагностическим системам, при этом уровень чувствительности для разных видов герпесвирусов был приблизительно одинаковым. Таблица 9. Сравнительная оценка диагностической чувствительности систем «Пентагерп» и «Герп 67» с коммерческим ПЦР-системами ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Подготовка клинического материала для ПЦР-анализа - важный этап, от которого зависит истинность полученных результатов. Клинический материал представляет из себя смесь специфической (искомой) ДНК и неспецифической ДНК вирусов или бактерий, а также ДНК клетки-хозяина. Кроме того, в клиническом образце содержится огромное количество различных белков, многие из которых являются ингибиторами ДНК-полимеразы. Способ обработки должен позволять получать качественную очищенную ДНК, предотвращать потери ДНК и контаминацию тестируемого образца [42, 86]. В работе было проведено сравнительное исследование двух способов обработки урогенитальных образцов: метод лизиса исследуемого материала с последующей обработкой протеиназой К и метод экстракции ДНК с помощью сорбента (ДНК-сорб-А, ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ). В обоих случаях после постановки ПЦР в системе «Пентагерп» были получены одинаковые результаты (рисунок 12). Кроме того, показано отсутствие ингибиторов при использовании праймеров к гену 5-глобина. Так, следует отметить, что метод грубого лизиса не уступает по качеству методу с использованием сорбента и технически прост в исполнении. Рисунок 13. Результаты ПЦР-анализа клинических образцов, обработанных методом лизиса с последующей обработкой протеиназой К и методом экстракции ДНК с помощью сорбента. Известно, что герпетическая инфекция - одна из самых распространенных вирусных инфекций, поражающая гениталии человека. Наиболее изученными урогенитальными герпесвирусами являются ВПГ-1 и -2 типа и ЦМВ [2, 9, 16, 19]. Роль вирусов ВЭБ, ВГЧ-6, -7 и -8 в гинекологической и урологической патологии остается еще мало изученной и поэтому диагностике этих герпесвирусов не уделяется достаточного внимания. Целью данного раздела являлось определение роли комплексного обследования на герпесвирусные инфекции при урогенитальной патологии. На первом этапе исследования мы изучали видовое разнообразие герпесвирусов в урогенитальном материале. Особенностью данного этапа являлось комплексное выявление 7 видов герпесвирусов во всех клинических образцах. Материалом для исследования служили урогенитальные образцы (п=170), направленные в период 2002-2003 гг. в лабораторию молекулярной диагностики ИМГ РАН из медицинских учреждений г. Москвы для обследования на герпесвирусные инфекции. Поступающие в лабораторию клинические образцы анализировались системами «Пентагерп» и «Герп 67». При проведении ПЦР в 66 урогенитальных образцах (39%) был обнаружен герпесвирус. При этом моноинфекция была обнаружена в 48 пробах (73%), а смешанная инфекция в 18 пробах (27%) (рисунок 13). Рисунок 14. Представленность разных видов герпесвирусов в урогенитальном материале (п=66). Как показано на рисунке 13, все герпесвирусы человека могут инфицировать урогенитальные органы человека. ВПГ-1 и ВГЧ-8 на данном этапе исследования обнаружены не были.
При этом наиболее частыми инфекционными агентами являются наименее изученные ВЭБ, ВГЧ-6 и ВГЧ-7. Смешанные герпесвирусные инфекции также являются не редким событием. Наиболее часто встречались сочетания ВЭБ и ВГЧ-7 - 10 образцов (15%), а также ВЭБ и ВГЧ-6 -3 образца (4%). Кроме того, было отмечено, что наиболее частым сопутствующим герпесвирусом являлся ВЭБ - 16 (24%) образцов. Учитывая достаточно высокий уровень выявления всех герпесвирусов и наличие смешанных герпесвирусных инфекций, на втором этапе мы провели специальное исследование, направленное на выяснение понимания этой ситуации практически врачами. В качестве объекта исследования были выбраны два вида герпесвируса - ЦМВ и ВПГ, роль которых в урогенитальной патологии хорошо известна современной медицине. Особенность исследования состояла в том, что выборку составили пробы, которые по назначению врача направлялись на диагностику только одного вида герпесвируса (ВПГ или ЦМВ). Пробы первоначально исследовались лабораторными моноспецифическими ГЩР-системами нестед-ВПГ и нестед-ЦМВ [3, 15] в соответствии с направлениями врача. По результатам этих анализов было выявлено 75 ВПГ-положительных и 35 - ЦМВ-положительных образца. Далее проводилось дополнительное исследование положительных образцов в тест-системе «Пентагерп», которое принесло следующие результаты: все ВПГ-положительные образцы дали ампликоны в тест-системе «Пентагерп», при этом в 18 случаях (24%) был типирован ВПГ-1 и в 57 случаях (76%) - ВПГ-2. Кроме этого, в 6 пробах был обнаружен второй герпесвирус - в четырех пробах это был ЦМВ, а в двух пробах - ВЭБ. Наличие ДНК ЦМВ подтвердилось во всех 35 пробах при обследовании в универсальной ГЩР-системе. Кроме этого, в четырех пробах были еще обнаружены вирусы ВПГ-1 (в двух пробах) и ВПГ-2 (в двух пробах) (таблица 10). Полученные данные подтвердили результат предыдущих исследований, что сочетанные герпесвирусные инфекции (ВПГ+ЦМВ+ВЭЕ) являются не редким случаем. Кроме этого, приведенные данные убедительно показывают, что практикующие врачи могут не подозревать об этом и пропускать такие случаи. Таблица 10. Частота выявления герпесвирусов при урогенитальной патологии.
