Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ - [5]
ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ КЛЕТОЧНЫХ ГЕНОВ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) - [7]
Введение - [7]
Культуры клеток и объект анализа изменения экспрессии клеточных генов - пул мРНК (кДНК)-[10]
Исследование экспрессии клеточных генов с использованием микроматриц (микрочипов) ДНК - [12]
Серийный анализ генной экспрессии (SAGE) - [19]
Метод дифференциального дисплея - [23]
Метод вычитающей гибридизации - [30]
Подтверждение дифференциальной транскрипции - [46]
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ - [49]
Введение - [49]
Стратегия, использованная для поиска дифференциально экспрессирующихся генов в инфицированных вирусом клещевого энцефалита клетках человека - [50]
Описание метода SSH- [50]
Селективная амплификация обогащенной фракции - [53]
Вычитающая гибридизация. Создание и анализ обогащенных кДНК библиотек - [56]
Идентификация и подтверждение дифференциальной экспрессии транскриптов генов IFI-54KMIFI-56K- [60]
Поздняя индукция генов IFI-54K и IFI-56K - [64]
Разработка метода дифференциального скрининга полученных после супрессионной вычитающей гибридизации библиотек кДНК и создание высокообогащенных или упрощенных библиотек на их основе - [67]
Описание модельной системы — [68]
Исследование кинетики ренатурации фрагментов кДНК вычтенной библиотеки с целью определения условий, необходимых для удаления фоновых молекул - [68]
Подход с использованием экзонуклеазы ЕхоШ- [70]
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ - [76]
МАТЕРИАЛЫ - [76]
Оборудование и расходные материалы - [76]
Среды и растворы - [78]
МЕТОДЫ-[81]
Клетки и вирусы - [81]
Получение РНК- [81]
Электрофорез в агарозном геле - [81]
Очистка олигонуклеотидных праймеров - [82]
PCR ампплификация - [82]
Структура праймеров, используемых в PCR-амплификациях - [83]
Очистка фрагмента ДНК в агарозном геле - [84]
Southern- Dot- и Northern-блот гибридизация - [84]
Создание упрощенных/высокобогощенных зондов и вычтенных библиотек - [84]
Трансформация Е. Coli - [87]
Вычитающая гибридизация — [87]
RT-PCR - [88]
Определение первичной структуры ДНК— [89]
ВЫВОДЫ - [90]
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - [91]
БЛАГОДАРНОСТИ - [101]
Введение к работе
Вирусные инфекции являются одной из основных причин заболеваемости и смертности. Потенциальная возможность появления новых опасных вирусных инфекций наряду с несовершенными противовирусными препаратами, которые имеются в современном арсенале медицины, требует создания новых эффективных средств защиты.
Для создания таких средств, необходимо глубокое понимание механизмов взаимодействия вирусов с клеткой, как основой организма, и выявление основных компонентов противовирусных защитных систем клетки и организма. Такие исследования служат основой для выработки новых подходов к профилактике и лечению вирусных заболеваний.
Следует отметить, что клетки человека все шире используются для решения такого рода задач. Культура изолированных соматических клеток человека открывает возможность изучения болезней человека "в пробирке". Микромасштаб исследований позволяет изучать "следы" и "проявления" болезни в стерильной посуде, содержащей 105-10б клеток. Оказалось, что многие болезни человека имеют специфичные клеточные изменения (болезни репродуктивной системы, эндокринная патология, старение, вирусные, нейрогенные, сердечно-сосудистые заболевания). Начались испытания органотропных лекарств на культуре клеток органов человека. Скрининг органотропных препаратов идет эффективнее и быстрее в микромасштабе культуры по сравнению с соответствующими испытаниями на животных. Многие фирмы используют культуры клеток человека для экспресс-скрининга лекарств, поскольку такие испытания более экономичны, оперативны и информативны.
Первичные культуры соматических клеток человека широко используются для опытов по генной и олигонуклеотидной терапии, подбора векторов для переноса информационных молекул в клетки, а также для создания устойчивых стандартизированных клеточных линий с постоянными характеристиками. В дальнейшем такие линии, по-видимому, станут важным инструментом в лечении болезней человека и будут распространяться клеточными банками по медицинским учреждениям [Сухих, 1998; Репин и др., 1998].
Изменение экспрессии клеточных генов при вирусной инфекции может вызываться как непосредственно, путем воздействием вирусных продуктов на регуляторные системы клетки, так и опосредованно путем, воздействия на эти системы клеточными же продуктами, индуцированными предварительно вирусами.
В свою очередь хозяйские гены участвуют в регуляции экспрессии вируса и продуктивная экспрессия генов у некоторых вирусов зависит, например, от факторов, регулирующих экспрессию генов интерферона первого типа (как это имеет место, например, при инфекции вирусом иммунодефицита человека) [Thornton et al., 1996]. Клеточные гены, индуцируемые вирусами, могут быть существенными для вирусной репликации [Wasylyk et al., 1988].
Основой в понимании этих механизмов на клеточном уровне, является понимание динамики картины экспрессии генов и ее регуляции, в ходе вирусной инфекции. Однако в большинстве случаев спектры генов клетки-хозяина, меняющих экспрессию, изучены недостаточно. Это связано с одной стороны с недостаточной информацией о генной структуре геномов, особенно о функциональной роли различных генов, а с другой стороны с трудностью анализа изменений экспрессии на полногеномном уровне. Это в полной мере относится к исследованиям флавивирусов, в частности вирусу клещевого энцефалита, которому посвящена данная работа. Подходы, используемые для идентификации клеточных генов, изменяющих свою экспрессию при заражении клетки вирусом, рассматриваются в этом обзоре.
Похожие диссертации на Идентификация генов человека, экспрессия которых меняется при инфекции вирусом клещевого энцефалита
