Содержание к диссертации
Введение
1 Список используемых сокращений 5
2 Введение 7
3 Обзор литературы 14
3.1. Классические методы видовой идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека 14
3.1.1. Морфологические методы 14
3.1.2. Биологические методы 17
3.1.3. Серологические методы 20
3.2. Современные подходы к видоспецифичной идентификации вирусов 25
3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНК 26
3.2.2. Полимеразная цепная реакция 26
3.2.3. Идентификация ортопоксвирусов с использованием полимеразнои цепной реакции 32
3.3. Олигонуклеотидные микрочипы 34
3.3.1. Методы изготовления микрочипов 36
3.3.2. Методы работы с микрочипами 39
3.3.3. Практическое применение микрочипов в диагностических целях 41
3.4. Заключение к обзору литературы 46
4 Материалы и методы 49
4.1. Материалы 49
4.2. Выделение ДНК с помощью набора "QiaAmp Blood mini kit" фирмы "QIAGEIsT(CUIA) 51
4.3. Выделение ДНК с помощью набора производства "Медиген" (Россия) 52
4.4. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом A (Blin, Stafford, 1976) 53
4.5. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом Б 53
4.6. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом В 54
4.7. Выделение ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян из инфицированной клеточной культуры Vera 54
4.8. Выделение ДНК вируса натуральной оспы из струпов 55
4.9. Амплификация фрагментов ДНК 56
4.10. Секвенирование фрагментов ДНК 57
4.11. Компьютерный анализ 57
4.12. Гибридизация ДНК с олигонуклеотидным микрочипом 58
5 Результаты и обсуждение 60
5.1. Выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов 60
5.2. Изучение гена СгтВ в качестве мишени для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе 68
5.2.1. Компьютерный анализ последовательности гена СгтВ ортопоксвирусов 68
5.2.2. Разработка метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов HaMAGIChip 76
5.3. Изучение гена хемокинсвязывающего (vCCI) белка в качестве мишени для видовой идентификации ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе 82
5.3.1. Секвенирование гена vCCI 82
5.3.2. Компьютерный анализ последовательности гена vCCI ортопоксвирусов 88
5.3.3. Разработка метода идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе 104
5.4. Изучение структуры гена а/р-интерферонсвязывающего белка (o/p-lFNr) ортопоксвирусов 109
5.4.1. Секвенирование гена a/p-IFNr ортопоксвирусов 110
5.4.2. Аналиї видоспецифичных различий в последовательности гена a/fi- *IFNr ортопоксвирусов 115
Заключение 123
Вывод 126
- Современные подходы к видоспецифичной идентификации вирусов
- Выделение ДНК с помощью набора "QiaAmp Blood mini kit" фирмы "QIAGEIsT(CUIA)
- Изучение гена СгтВ в качестве мишени для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе
- Изучение структуры гена а/р-интерферонсвязывающего белка (o/p-lFNr) ортопоксвирусов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Существование природного резервуара ортопоксвирусов, патогенных для человека, а также увеличение прослойки неиммунного к ортопоксвирусам населения, делает вероятным появление в природе эпидемически опасного для людей вируса, близкого к вирусу натуральной оспы по патогенности и контагиозности. Кроме того, вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальный агент биотерроризма. Для своевременного принятия противоэпидемических, мер, в случае появления оспоподобного заболевания, необходимо располагать такими методами лабораторного исследования, которые бы давали возможность в короткие сроки расшифровать его этиологию.
Из методов лабораторной диагностики наибольшее значение имеют методы быстрой диагностики. В настоящее время значительно возросли требования, предъявляемые к диагностическим методам. Применяемые методы диагностики оспы должны обладать помимо быстроты ответа, высокой чувствительностью, гарантировать обнаружение вируса в материалах с малым его содержанием, а также обеспечивать дифференциацию близкородственных ортопоксвирусов.
С разработкой техники олигонуклеотидных микрочипов появился новый метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на ПЦР с последующей идентификацией гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах. Этот метод, так же как ПЦР, имеет преимущество — возможность обнаружения следовых количеств исследуемого материала в образце. Но в отличие от метода ПЦР микрочиповая технология позволяет анализировать образцы по множеству локусов одновременно, что повышает надежность полученных результатов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка вариантов метода видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов, патогенных для человека, гибридизацией ПЦР-фрагментов вирусной ДНК на олигонуклеотидных микрочипах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Подобрать метод выделения ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, обеспечивающий эффективное проведение ПЦР на полученных образцах ДНЮ Предложить мишени для создания олигонуклеотидного микрочипа на основании имеющихся в GeneBank нуклеотидных последовательностей генов ортопоксвирусов. Определить нуклеотидные последовательности генов хемокинсвязывающего белка и а/р-интерферонсвязывающего белка ОПВ для имеющихся в нашей лаборатории штаммов ОПВ.
Идентифицировать видоспецифичные отличия в нуклеотидных последовательностях секвенированных ортопоксвирусных генов.
Проверить воспроизводимость результатов идентификации ОПВ на олигонуклеотидных микрочипах, разработанных совместно с ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) и Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (Food and Drag Administration -FDA, США).
Научная новизна и практическая значимость работы. Предложен метод выделения. ДНК ортопоксвирусов из различных материалов, позволяющий выделять ортопоксвирус-ную ДНК в количествах, достаточных для проведения одной ПЦР при наличии в них 5-6 вирионов. Разработана и утверждена методика выделения ДНК из вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян в условиях лаборатории BSL-4.
Впервые определены нуклеотидные последовательности гена хемокинсвязывающего белка (уССГ) для 86 штаммов и генаМ/'Ртерферонсвязывающего б е (их/^УЕЛйг) л я 58 штаммов шести видов ортопоксвирусов. СуммарНО-бити определены последовательности
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1
1 | БИБЛИОТЕКА |
СПме^вург ф
170 тыс. пар нуклеотидов. Данные секвенирования депонированы в базе данных GenBank. В результате компьютерного анализа выявлены видоспецифичные замены, которые могут быть использованы в качестве мишени для диагностики и видовой идентификации ортопок-свирусов на олигонуклеотидном микрочипе.
Совместно с сотрудниками ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва), разработан олиго-нуклеотидный микрочип для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по предложенному фрагменту гена СгтВ и на препаратах ДНК 59 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины доказана надежность и воспроизводимость разработанного метода.
Совместно с сотрудниками FDA (США) разработан и протестирован вариант олигонук-леотидного микрочипа для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов по гену хемо-кинсвязывающего белка на препаратах-ДНК 45 штаммов вирусов натуральной оспы, оспы коров, оспы обезьян, оспы верблюдов, осповакцины и оспы мышей (эктромелии).
Публикации и апробация работы. По материалы диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 3th Internetional conference on Bioinformatics ofgenome regulation and structure (Novosibirsk, Russia, 2002); The World of Microbes (Paris, France, 2002); XlVth International Poxvirus and Iridovirus Workshop (Lake Placid," New York, USA, 2002); 2nd - 5th Meeting of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2001-2003).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы (159 ссылок) и одного приложения. Работа изложена на 152 страницах, содержит 20 рисунков, 17 таблиц.
Вклад автора. Секвенирование генов, хемокинсвязывающего (vCCI) и а/р-интерферонсвязывающего (d/p-IFNr) белков большого набора штаммов ортопоксвирусов выполнено лично автором Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ор-топоксвирусных генов vCCI, a/p-IFNr и СгтВ выполнен лично автором. Автором лично проведен выбор метода выделения ДНК вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов в условиях лаборатории высокой физической защиты, разработана «Методика приготовления ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян», обеспечившая возможность выделения и выноса в биохимическую лабораторию с уровнем биобезопасности 2 препаратов ДНК вируса натуральной оспы. Создание олигонуклеотидного микрочипа для видоспецифичной идентификации ортопоксвирусов гибридизацией с последовательностями гена СгтВ осуществлено сотрудниками Центра микрочипов ИМБ им. Энгельгардта РАН (г. Москва) при участии автора. Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации ортопоксвирусов и вируса ветряной оспы разработан сотрудниками лаборатории современных методов, FDA (США) при участии автора.
Современные подходы к видоспецифичной идентификации вирусов
В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Разработка молекулярных методов детекции видоспецифичных отличий основана на следующих основных принципах: {, 1. Комплементарность нукпеотидных оснований - аденин всегда гибридизуется с гуанином, а тимидин с цитозином; 2. При нагревании происходит разъединение цепей ДНК (денатурация); 3. При охлаждении происходит восстановление двухцепочечной структуры в соответствии с правилом комплементарности ігуклеотидов; 4. Расщепление молекулы ДНК может быть достигнуто с помощью специальных бактериальных ферментов - эндонуклеаз, рестрицирующих молекулу ДНК в местах со строго определенной для каждой эндонуклеазы последовательностью пуклеотидов; 5. Искусственный ферментативный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (ПЦР); действием электрического тока; положение фрагментов ДНК при электрофорезе определяется размерами ДНК-фрагментов. 3.2.1. Рестрикционный анализ вирусной ДНК Первый метод идентификации поксвирусов на основе последовательности ДНК состоял в гидролизе ДНК рестриктазой и последующем электрофоретическом разделении образовавшихся фрагментов в агарозном геле. Хотя разные виды ортопоксвирусов по последовательности ДНК имеют высокий уровень гомологии, тем не менее их. можно различить по спектру фрагментов, генерируемых той или иной рестриктазой. {Esposito et al., 1978; Mackett and Archard, 1979; Esposito and Knight, 1985). Однако штаммы ортопоксвирусов, принадлежащие одному виду, могут существенно различаться по спектру рестрикционных фрагментов (Маренникова и др., 1996; Esposit and Knight, 1985), что осложняет использование данного метода для дифференциации ортопоксвирусов. Недостатком такого анализа является необходимость осуществления препаративной наработки.и высокой очистки образца вируса, что существенно удлиняет время анализа по сравнению с другими, методами диагностики. Поэтому данный подход не получил широкого-распространения при идентификации поксвирусов. 3.2.2. Полимеразная цепная реакция После открытия в середине 80-х годов XX века принципа ПЦР появилась реальная возможность прямой детекции возбудителей инфекционных заболеваний (Mullis and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988; Шипулин и др., 1998). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного . копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Общая схема ПЦР приведена на рис. 2.
Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-пол и меразой, как и в клетках живых организмов. ДНК- полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды (Mullls and Falona, "1987; Stoflet et. al, 1988), Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами "затравочной" ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров "узнавать" строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарное (Mullis and Falona, 1987; Stoflet et. al, 1988). В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые "ограничивают" амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов (см. Рис. 2А): I. денатурация, или "плавление" ДНК, когда двухцепочечная ДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние; II. связывание (отжиг) праймеров с матричной ДНК; III. элонгация (удлинения) цепи. Смена этапов каждого цикла осуществляется . путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, по в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах (см. рис, 2Б). При этом количество основного продукта ГЩР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле, то есть растет с числом циклов экспоненциально. Продукты ПЦР могут быть выявлены различными методами детекции (Southern, 1975; Orita et. al, 1989; Fodde and Losekoot; 1994). Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другие лабораторные методы (иммунологические, биологические, микроскопические) невозможны (Dragon et al, 1993; Persing and Cimino, 1993). Это достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК-последовательности в исследуемом материале (Newton and Graham, 1996), но на практике необходимо 10-10 бактериальных клеток в исходном образце (Dragon et al, 1993; Persing and Cimino, 1993), в то время как чувствительность иммунологических и микроскопических тестов колеблется в пределах -103—106 бактериальных клеток (Crowther, 2002). Важное свойство ПЦР - ее высокая специфичность, определяемая, прежде всего уникальностью генетического материала каждого вида микроорганизмов. Поэтому при использовании праймеров, комплементарных определенной "видоспецифичной" последовательности ДНК, и соблюдении оптимального температурного режима реакции только ДНК искомого вида подвергается многократному копированию даже в присутствии большого количества другой, "балластной", ДНК, например, ДНК различных организмов, в том числе и ДНК человека (Dragon et al, 1993; Persing and Cimino, 1993).
По этой причине, ПЦР-диапюстикумы в отличие от иммунологических тест-систем исключают проблемы, связанные с перекреслю реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая высокую специфичность (Crowther, 2002; Dragon et al, 1993). Такие свойства ПЦР, как скорость и высокая производительность (то есть возможность параллельного анализа большого количества образцов), являются бесспорными преимуществами данного метода. Стандартные процедуры выделения микробной ДНК из клинического материала или чистой культуры и последующей ГЩР-амплификации обычно требуют для своего завершения не более нескольких часов. Продукты ПЦР могут быть идентифицированы с помощью простых методов (гель-электрофорез, гибридизация) приблизительно за то же время. Таким образом, весь процесс ПЦР-анапиза — от момента поступления образца в лабораторию до получения конечного результата - занимает обычно не более 10 часов (Dragon ct al, 1993; Persing and Cimino, 1993). Очень высокая чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно как преимуществом, так и недостатком ПЦР-систем. Этот парадокс известен как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а следовательно, к ложноположительному результату (Dragon et al, 1993; Newton and Graham, 1996; Persing and Cimino, 1993). Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля, через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводить к ложноположительному результату анализа образцов (Dragon et al, 1993; Newton and Graham, 1996). В случае высокой концентрации тестируемой ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой
Выделение ДНК с помощью набора "QiaAmp Blood mini kit" фирмы "QIAGEIsT(CUIA)
К 100 мкл образца добавляли 300 мкл раствора 1 и 10 мкл сорбента и инкубировали в течение 10 мин при 25С, затем сорбент осаждали центрифугированием при 3000g 1 мин. Осадок ресуспендировали в 150 мкл раствора 2 и переосаждали центрифугированием при 3000g 1 мин. Ресуспендировали в 750 мкл раствора 3, и осаждали сорбент центрифугированием при 3000g 1 мин. Осадок высушивали при 50С и добавляли 100 мкл деионизированой воды, затем инкубировали при 50С в течение 10 мин. Смесь центрифугировали 3 мин при 18000g, супернатант гіреносили в новую пробирку и хранили при +4СС. 4.4. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом A (Blin, Stafford, 1976) Образец объемом 100-200 мкл ресуспендировали в 90 мкл лизирующего буфера (ЛБ) и 10 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл). В течение 10 мин инкубировали при 37С, затем добавляли 350 мкл ЛБ и 50 мкл раствора протеиназы К, инкубировали в течение 5-12 ч при 37 С. Добавляли 70 мкл 3 М ацетата натрия {рН 5,0) и проводили фенольную депротеинизацию 500 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1). Водную фазу переносили в новую 2 мл пробирку и добавляли 1,5 мл 96% этанола, затем инкубировали в течение 15 мин при -20С. Центрифугировали при lOOOOg в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-НС1 (рН 7,0). Раствор хранили при +4С. 4.5. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом Б Образец объемом 100-200 мкл переносили в 1,5 мл пробирку, содержащую 20 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл) и добавляли 200 мкл ЛБ. Смесь инкубировали в течение 10 мин при 56С и проводили фенольную депротеинизацию 400 мкл смеси фенол/хлорофбрм (1:1). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 40 мкл З М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 400 мкл изопропанола. Смесь инкубировали в течение 15 мин при - 20С, и центрифугировали при lOOOOg в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при +4С. 4.6. Выделение ДНК ортопоксвирусов методом В Сухой образец объемом 10-100 мкг помещали в 1,5 мл пробирку, добавляли 180 мкл ЛБ и инкубировали в течение 10 мин при 85С. Добавляли 20 мкл раствора протеи пазы К (10 мкг/мкл) и инкубировали в течение 1 ч при 56С. Добавляли 200 мкл ЛБ, инкубировали 10 мин при 56С и проводили фенольную депротеинизацию 400 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 40 мкл З М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 400 мкл изопропанола.
Смесь инкубировали в течение 15 мин при - 20С, и центрифугировали при 10000g в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при +4С. 4.7. Выделение ДНК вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян из инфицированной клеточной культуры Vero Выделение вирусной ДНК из штаммов вируса натуральной оспы и вируса оспы обезьян из Российской коллекции проводили в лаборатории 4-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор», сертифицированной для этих работ Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) и Министерством здравоохранения РФ. Эксперименты с неинфекционной ДНК проводили в условиях лаборатории 2-го уровня биобезопасности. Клетки из инфицированного клеточного монослоя пяти пластиковых матрасов (150 см2; приблизительно 2 х 108 клеток) переносили в 250 мл центрифужные стаканы для JA-10 ротора, Затем клетки собирали центрифугированием в течение 15 мин при 1500g, ресуспендировали в 10 мл изотонического буфера и осаждали центрифугированием 15 мин при 1500g. Клеточную массу ресуспендировали в 9 мл гипотонического буфера и инкубировали при 0С в течение 10 мин, затем добавляли 25 мкл меркаптоэтанола и 1 мл 10% (v/v) Triton Х-100, и продолжили инкубацию 10 мин при 0С с мягким перемешиванием. Центрифугировали 5 мин при 1000g при 4С, супернатант переносили в 50 мл центрифужные стаканы для JA-21 ротора и центрифугировали при 20000g в течение 60 мин при 4С. К осадку добавляли 140 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл) и 1 мл ЛБ, затем инкубировали 10 мин при 56С. Раствор переносили в новые 1,5 мл пробирки по 600 мкл в каждую, и проводили фенольную депротеинизацию 600 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 60 мкл З М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 600 мкл изопропанола. Пробирки помещали в передаточную камеру, после обработки внешней поверхности пробирок формалином и 30% перекисью водорода в передаточной камере, пробирки переносили в лабораторию 2-го уровня биобезопасности.
Смесь инкубировали в течение 15 мин при - 20С, и центрифугировали при 10000g в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола и растворяли в 600 мкл ТЕ. Добавляли 600 мкл изопрапонала, инкубировали в течение 15 мин при - 20С, и центрифугировали при 18000g в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 300 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при +4С. 4.8. Выделение ДНК вируса натуральной оспы из струпов Корочку из кожного поражения, полученную от человека, болевшего натуральной оспой в 1975 г., и сохраненную в Российской коллекции вируса натуральной оспы, помещали в 1,5 мл пробирку и растирали полипропиленовым пестиком производства «Sigma» (США). Затем добавляли 200 мкл ЛБ и инкубировали 10 мин при 85С. Добавляли 20 мкл раствора протеиназы К (10 мкг/мкл) и инкубировали в течение 1 ч при 56С. Добавляли 200 мкл ЛБ, инкубировали 10 мин при 56С и проводили фенольную депротеинизацию 400 мкл смеси фенол/хлороформ (1:1). Водную фазу переносили в новую 1,5 мл пробирку, добавляли 40 мкл З М ацетата натрия (рН 5,0), 30-40 мкг РНК-носителя и 400 мкл изопропанола. Пробирки помешали в передаточную камеру, после обработки внешней поверхности пробирок формалином и 30% перекисью водорода в передаточной камере, пробирки переносили в лабораторию 2-го уровня биобезопасности. Смесь инкубировали в течение 15 мин при - 20С, и центрифугировали при 18000g в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола и растворяли в 300 мкл ТЕ. Добавляли 300 мкл изопрапонала, инкубировали в течение 15 мин при — 20С, и центрифугировали при 10000g в течение 15 мин, супернатант удаляли. Осадок промывали 1 мл 70% этанола, высушивали при 65С, и растворяли в 50 мкл 1 мМ Трис-HCl (рН 7,0). Раствор хранили при +4С.
Изучение гена СгтВ в качестве мишени для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов на олигонуклеотидном микрочипе
С целью определения района генома ортопоксвирусов пригодного для конструирования олигонуклеотидного микрочипа, был осуществлён поиск в международном банке данных (GeneBank) гена, структура которого, известна для наибольшего числа штаммов. На момент поиска это был ген СгтВ, кодирующий один из белков, блокирующих цитокины хозяина. Белок СгтВ является гомологом клеточного рецептора фактора некроза опухолей. Структура этого гена была известна для 53 различных штаммов ортопоксвирусов (Таблица 7), принадлежащих видам: VARV, CPXV, MPXV, VAC, CMLV. В результате анализа построенной филогенетической дендрограммы (Рис. 8) для представителей всех выявленных вариантов последовательности (Nei and Kumar, 2000) обнаружили, что штаммы ортопоксвирусов четко кластеризуются в группы по их видовой принадлежности. Вычисленные генетические расстояния показывают относительно высокую внутривидовую гомогенность всех изученных видов ортопоксвирусов (Таблица 8). По увеличению степени гомогенности внутри групп ортопоксвирусы выстраиваются в следующем порядке CPXV (0,0334), VACV (0,0150), MPXV (0,0048), VARV (0,0041), CMLV (0,0034). Из значений генетических расстояний между группами (см. таблицу 8) ортопоксвирусы можно расставить по степени уменьшения выделенное выявленных групп в следующем порядке: MPXV (минимальное генетическое расстояние 0,0766), VARV (0,0468), CPXV (0,0408), VACV и CMLV (по 0,0362). При выборе района, оптимального для идентификации ортопоксвирусов, с использованием выровненных нуклеотидных последовательностей (Рис. 10), руководствовались следующими требованиями: Во-первых, внутри этого района должны присутствовать вариабельные участки, специфичные для каждого из видов ортопоксвирусов. Во-вторых, этот район должен легко выделяться из генома методом ГЩР с прай мерами, консервативными для всех видов ортопоксвирусов, то есть вариабельный участок должен быть фланкирован консервативными. В-третьих, длина амплифицируемого фрагмента, используемого для гибридизации, должна быть не более 300 нуклеотидов. Микрочип разрабатывался в сотрудничестве с Институтом молекулярной биологии имени Энгельгардта РАН (г. Москва), где используют вариант микрочипа с гелевыми ячейками, внутри которых иммобилизованы олигонуклеотиды. При пробоподготовке использовали флуоресцентно меченый праймер, что делало невозможным дальнейшую фрагментацию ДНК. Для поиска подходящего района на языке программирования Delphi 6 (Borland, США) была написана программа, которая рассчитывает степени отличия для каждой позиции в выровненных последовательностях генов подсчетом количества несовпадающих нуклеотидов во всех возможных комбинациях последовательностей деленного на количество всех возможных комбинаций (Рис. 9).
В результате анализа был выбран подходящий для диагностики участок с 145 по 430 нуклеотид (см. рис. 9В). Так, его длина менее 300 нуклеотидов, он содержит вариабельные районы, фланкированные консервативными, а также содержит единственную замену, характерную сразу для всех CPXV и отличающую их от других ОПВ (см. рис. 10). Таким образом, в результате был осуществлён окончательный дизайн праймеров TNFRlf и TNFR3r (см. рис. 10). Микрочип разрабатывался совместно с сотрудниками Центра микрочипов института молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН (г. Москва). В Центре микрочипов используют вариант микрочипа с гелевыми ячейками, внутри которых иммобилизированы олигонуклеотиды (Храпко и др., 1991). Преимуществами этого типа микрочипов является то, что количество иммобилизированных зондов в каждой ячейке значительно выше, чем в микрочипах с зондами, прикрепленными на стекло, поэтому эти микрочипы обладают большей емкостью, что позволяет анализировать образцы с низкой степенью включения метки. Кроме того, для микрочипов с зондами, иммобилизированными в геле, известна зависимость эффективной температуры отмывки микрочипа, при которой остаются только правильные дуплексы, от концентрации олигонуклеотида в гелевой ячейке, что позволяет не меняя структуры зондов оптимизировать их работу (Храпко и др., 1991). Существенным недостатком этого типа микрочипов является то, что гибридизируемая ДНК более 300 нуклеотидов медлено диффундирует в гелевые ячейки, и для ее связывания с олигонуклеотидными зондами необходимо не менее 2 ч. Используя выровненные нуклеотидные последовательности предложенного локуса гена СгтВ, совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН (г. Москва) были рассчитаны 14 олигонуклеотидных зондов для пяти участков с видоспецифичными отличиями. На рис. 10 показано их расположение относительно выровненных последовательностей гена СгтВ различных штаммов ОГТВ. На микрочипе зонды иммобилизовали в гелевые ячейки, расположенные в 5 колонках (Рис. 11), где каждая колонка представляет отдельный тестируемый участок амплифицируемого фрагмента вирусной ДНК. Внутри каждой колонки только один видоспецифичный зонд может формировать совершенный дуплекс с одноцепочечным меченным образцом, в то время как все другие зонды формируют несовершенные дуплексы. Так как энергия образования правильных дуплексов (AG) значительно меньше, чем энергия образования неправильных дуплексов, то количество образованных правильных дуплексов превосходит количество неправильных. Поэтому гелевые ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы, имеют больший флуоресцентный сигнал в сравнении с ячейками с несовершенными дуплексами. При этом интенсивность флуоресценции гелевых ячеек должна рассматриваться внутри каждого столбца. В результате гибридизационные картины уникальны для всех тестируемых видов ОПВ, что позволяет проводить точную видовую идентификацию сравнением с исходными шаблонами (см. рис. 11). На первом этапе проверки специфичности метода была проведена ПЦР-амплификация с имеющихся у нас препаратов ДНК 59 штаммов 6 различных видов ОПВ (Таблица 9).
При использовании праймеров TNFRlf и TNFR3r не образовывался ПЦР-амплификат только на ДНК вируса эктромелии, т.к. в его геноме выбранный для идентификации локус отсутствует [U86381, EMBL]. Праймеры также не давали ПЦР-. продуктов при амплификации с ДНК, выделенной из крови здорового человека, клеточной ДНК, выделенной из неинфицированной культуры Vero, и ДНК неродственных поксвирусов - вирусов миксомы кролика, фибромы Шоупа (род Leporipoxvirus) и вируса оспы кур (род Avipoxvirus). . На следующем этапе получали флуоресцентно-меченную одноцепочечную ДНК, проведением ассиметричной ПЦР с флуоресцентно-меченным праймером, концентрация которого в 10 раз выше концентрации второго прайм ера. Одноцепочечную ДНК гибридизировали с микрочипом в течение 4 ч при 37С. После отмывки дистиллированной водой и просушивания в струе СОг гибридизационную картину . регистрировали конфокальным микроскопом с CCD-камерой. На рис. 11 слева показаны гибридизационные шаблоны для всех тестируемых видов ОПВ, а справа - реальные картины гибридизации для двух различных штаммов каждого вида ОПВ. Идентификацию осуществляли сравнением полученной гибридизационной картины со всеми разработанными гибридизационными шаблонами, приведенными на рис. 11. При этом, как упоминалось ранее, интенсивность флуоресценции гелевых ячеек рассматривали отдельно внутри каждого столбца. Так, например, рассмотрим крайнюю левую колонку микрочипа после гибридизации с ДНК вируса оспы верблюдов (см. рис. 11-12). Флуоресцентный сигнал в ячейке, где образовался совершенный дуплекс при гибридизации изучаемой ДНК с зондом №3, может быть однозначно идентифицирован внутри колонки, несмотря на то, что абсолютный уровень его флуоресценции сравним с некоторыми сигналами, представляющими несовершенные дуплексы в других колонках. В результате были успешно идентифицированы все протестированные штаммы вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакципы и оспы верблюдов. Все результаты гибридизации соответствовали ожидаемым. При выборе олигонуклеотидов (см. рис. 10), на основании имеющихся к тому времени данных предполагалось, что можно будет отличить вирус оспы кроликов от вируса осповакцины. Но при проведении гибридизации на микрочипе обнаружили, что некоторые штаммы вируса осповакцины имеют картину гибридизации, соответствующую вирусу оспы кроликов.
Изучение структуры гена а/р-интерферонсвязывающего белка (o/p-lFNr) ортопоксвирусов
С целью увеличения количества локусов, потенциально пригодных для видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, в рамках данной работы было решено провести секвенировапие и компьютерный анализ организации гена B19R (по номенклатуре VACV штамма Copenpagen), продукт которого является молекулярным фактором вирулентности ортопоксвирусов и поэтому может иметь видоспецифичные отличия по нуклеотидной последовательности. Ген B19R кодирует секретируемый на ранних стадиях инфекции белок, который функционирует как растворимый рецептор а/р-интерферона (a/p-interferons receptor - а/fi-IFNr) и тем самым блокирует противовирусный клеточный ответ, индуцируемый а/р-интерфероном. После секретирования этот белок связывается как с уже инфицированными клетками, так и с неинфициро ванными, чем блокирует воздействие a/p-интерферона на зараженные и незараженные клетки, тем самым подготавливая незараженные клетки для последующего инфицирования (Alcami et аі., 2000). На данном рисунке приведено только по одному представителю каждого вида ОПВ и рассчитанные олигонуклеотидные прайм еры для ПЦР и секвенирования выбранного гена. Для амплификации фрагментов ДНК, содержащих ген a/p-IFNrt использовали пару праймеров: B19-U1 и B19-L1. При проведении ПЦР с указанными праймерами амплифицировали фрагменты длиной от 1348 п.н. для CPXV штамм GRI до 1398 п.н. для CMLV. Очистку фрагментов осуществляли электрофорезом в 1% агарозе с последующей экстракцией из агарозы с помощью набора MinEIute Gel Extraction («QiaGen», США). Так как, при секвенировании на капилляре длиной 61 см с одного праймера можно надежно определить около 600 нуклеотидов, а длина амплифицированньтх фрагментов была больше 1300 п.н., то при секвенировании использовали праймеры, с которых нарабатывали фрагменты, а также четыре внутренних праймера B19-U2, B19-U3, B19-L2 и B19-L3 (см. рис. 18). В результате секвенирования были определены нуклеотидные последовательности 58 штаммов ОПВ, из них 19 - VARV, 5 - MPXV, 19 - CPXV, 8 - VACV, 5 - CMLV и 2 штамма ECTV. Суммарно определили 75,4 т.п.н. Данные секвенирования депонировали в базу данных GenBank (Таблица 17). С целью проведения анализа последовательности гена a/p-IFNr ортопоксвирусов были выровнены 58 секвенированных нами (см. таблицу 17), и 15 из базы данных GenBank (см. таблицу 16) нуклеотидных последовательностей гена белка a/p-IFNr.
После сравнения последовательностей гена белка a/fi-IFNr удалили все повторяющиеся варианты последовательностей, в результате было обнаружено 37 различных генотипов (см, таблицы 16 и 17). При анализе построенной филогенетической дендрограммы обнаружили, что штаммы ортопоксвирусов, за исключением CPXV, кластеризуются в группы по их видовому признаку (Рис. 19). Изоляты CPXV, как и в случае с геном vCCI, разделились на две подгруппы, обозначенные нами CPXV1 и CPXV2. Группа CPXV1 оказалась филогенетически ближе к VARV и CMLV, в то время как CPXV2 ближе к MPXV (см. рис. 19). На филогенетической дендрограмме по гену a/fi-IFNr, в отличие от гена vCCI, штаммы VACV образуют отдельную группу, не пересекающуюся с CPXV. Из этого можно заключить, что на микрочипе с использованием зондов к данному району генома можно легко будет различать VACV от других ОПВ. Изоляты MPXV и CMLV по гену a/p-IFNr сохранили разделение по регионам выделения штамма, которое наблюдалось на дендрограмме по гену vCCI, Центрально-африканские изоляты MPXV по структуре изучаемого гена отличаются от западноафриканских M/LIB и M/BEN, a CMLV распадаются на две подгруппы: выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах и изоляты из Ирана и Казахстана (см. рис. 19, таблицы 16 и 17). В то же время различия VARV по гену a/p-IFNr не связаны с регионами происхождения штаммов. Анализ выровненных нуклеотидных последовательностей гена белка a/fi-IFNr позволил обнаружить «мозаичпость» структуры этого гена при сравнении одних видов относительно других. На рис. 20 приведены все варианты последовательностей гена белка a/fi-IFNr и его окружения. Как видим, в 5 -фланкирующем районе гена a/p-IFNr, выделенного серым блоком на рис. 20, наблюдаются точечные видоспецифичные отличия между различными видами ОПВ. Рассчитав зонды для этой области можно сконструировать микрочип, используя который можно будет различать все представленные виды ОПВ. На рис, 20 видоспецифичные замены, характерные для всех MPXV, выделены зеленым цветом, для ECTV - голубым, VARV - красным, CPXV2 -желтым. CMLV можно отличить от других ОПВ по комбинации замен в 44-м и 56-м нуклеотидах, кроме этого по 53-му нуклеотиду можно различать CMLV по регионам выделения штаммов. Замены в положениях 73, 88 и 92 характерны для всех VACV и для CPXV штамма GRI-90, который можно отличить от всех VACV по 48-му и 111-му положениям. В начале гена a/p-lFNr расположен консервативный район (182-381-й нуклеотид) в котором присутствуют единичные видоспецифичные замены. Наиболее интересен этот район тем, что он содержит единственную однонуклеотидную замену, характерную сразу для всех VACV (382-й нуклеотид) и не встречающуюся у других видов ОПВ. В районе 401-610 имеются множественные точечные отличия CPXV2, MPXV и VACV от других видов при высокой идентичности последовательностей между собой. Начиная с 529-го нуклеотида к ним присоединяется еще и ECTV. По району 509-535 можно идентифицировать все виды ОПВ. В этот район попадает одна видоспсцифичная замена для MPXV (позиция 522), одна для CMLV (531), две для VARV (516 и 529). Остальные виды ОПВ можно идентифицировать по комбинации замен. Так, VACV можно идентифицировать по комбинации нуклеотидов в положениях 534-535, ECTV 509 и 529, a CPXV - методом исключения с учетом всех перечисленных замен. З -концевой район гена (611-1195) имеет высокую гомологию среди различных видов ОПВ с единичными видоспецифичными отличиями. З -фланкирующий район гена (1196-1351) отличается высокой вариабельностью, и в нем присутствуют видоспецифичные отличия характерные только для CMLV, CPXV2 и ECTV.
Как упоминалось при анализе филогенетической дендрограммы (см. рис. 19), нуклеотидные последовательности гена a/p-IFNr различаются в зависимости от региона происхождения изолятов у MPXV и CMLV, Штаммы MPXV, выделенные в центральной Африке, можно отличить от западноафриканских штаммов по заменам в положениях 463 и 1004. У CMLV штаммы, выделенные в Объединенных Арабских Эмиратах, отличаются от штаммов, выделенных в Иране и Казахстане, по положениям 53 и 865. Таким образом, использование района гена a/fS-lFNr для диагностики ортопоксвирусов дает возможность дифференцировать различные виды ОПВ. По структуре данного гена все виды ортопоксвивирусов филогенетически разделены, в отличие от гена vCCI, для которого некоторые штаммы CPXV1 попадают в группу VACV. В связи с прекращением вакцинации людей против оспы у большинства людей отсутствует иммунитет к ортопоксвирусным заболеваниям. Это позволяет быстрее распространяться и изменяться в сторону большей патогенности в человеческой популяции ранее малопатогенным для человека ортопоксвирусам, таким как CPXV и MPXV (ВахЬу and Bennett, 1997; Breman, 2000; Meyer et al., 1999; Mukinda et a!, 1997). Начавшаяся в 1996 г. в Конго и продолжающаяся до сих пор массовая вспышка оспы обезьян среди людей (Mukinda et al, 1997, Hutin et al, 2001) подтвердила возможность такого развития событий, Более того, в 2003г. зарегистрирована вспышка оспы обезьян среди людей в США (Update Weekly CDC, 2003) и оспы коров среди людей в Бразилии. Кроме всего перечисленного, вирус натуральной оспы рассматривается как потенциальное биологическое оружие (Spencer and Lightfoot, 2001; Breman and Henderson, 2002; Mahy, 2003; Mortimer, 2003). Учитывая вышеизложенное, становится понятным, почему необходимо располагать такими методами лабораторной диагностики, которые бы обладая высокой чувствительностью, давали возможность в короткие сроки расшифровать этиологию оспоподобного заболевания. Одним из таких методов, появившимся в последнее десятилетие, является метод диагностики различных заболеваний и дифференциации видов, основанный на идентификации посредством гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом. Область применения микрочипов быстро расширяется.
