Введение к работе
Актуальность проблемы
Разработка и совершенствование методик диагностики и терапии раковых заболеваний является актуальной задачей современной науки и медицины. Метилирование генов-супрессоров опухолевого роста (tumor supressor gene, TSG) является одним из ранних событий канцерогенеза, которое может быть диагностировано значительно раньше других изменений в организме. В связи с этим поиск новых TSG как опухолевых маркеров представляет большой интерес.
Показано, что короткое плечо хромосомы 3 (Зр) человека содержит факторы, обладающие способностью подавлять опухолевый рост и подвержено частым аберрациям при многих видах рака; поэтому высказано мнение, что Зр -вероятный участок локализации целого ряда генов-супрессоров опухоли (Killary et al., 1992; Kok et al., 1997; Zabarovsky et al., 2002; Braga et al., 2002; Massion and Carbone, 2003; Angeloni et al., 2007), однако, в настоящее время в этом большом (100 млн.п.н.) районе удалось выделить и охарактеризовать всего несколько TSG. Широко охарактеризованы только некоторые из них: ген VHL (Зр25), подавляющий активность РНК-полимеразы II на стадии элонгации, ген системы репарации MLH1 (Зр22) и ген RASSF1A (Зр21), вовлеченный в регуляцию клеточного цикла. Не вызывает сомнений необходимость более детального анализа этого участка генома для выявления новых TSG.
Одновременное использование комбинаций нескольких маркеров повышает эффективность диагностики опухолей. В этой связи важной задачей является разработка методик мультиплексного скрининга маркеров канцерогенеза и все большее значение приобретает технология микрочипов, которая позволяет одновременно анализировать десятки тысяч генов. (Gray and Collins, 2000; Trevino et al., 2007). Бурно развивающаяся технология микрочипов позволяет изучать дифференциальную экспрессию генов и является эффекгивньщ методом в поиске новых генов, вовлеченных в различные заболевания. (Su et al., 2001; Macgregor et al., 2003).
Создание новых ДНК-микрочипов имеет принципиальное значение для получения информации, не доступной на уровне мРНК (кДНК): гетерозиготные делеции, метилирование ДНК, ацетилирование гистонов. Метилирование и другие эпигенетические факторы, как известно, являются одними из кпючевьк механизмов регуляции экспрессии генов и играют важную роль в канцерогенезе. Эпигенетические изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза раковых заболеваний.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы является поиск и характеристика новых генов-супрессоров опухолевого роста на хромосоме 3 человека с помощью технологии гибридизации HaNotI-микрочипах.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Модифицирование методики сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах для скринирования хромосомы 3 человека.
Анализ геномных и эпигеномных изменений хромосомы 3 человека в образцах опухолей с использованием разработанных Notl-микрочипов и поиск новых кандидатов в TSG.
Исследование изменений геномных локусов, выявленных гибридизацией на Notl-микрочипах, с помощью независимых методов: метил-специфичной ПЦР (МСП) и бисульфитного секвенирования.
Проверка взаимосвязи метилирования генов - кандидатов в TSG с их экспрессией в образцах эпителиальных опухолей.
Сравнение данных по метилированию и опухоль-подавляющей способности TSG RASSF1A и TSG-кандидата RASSF2 в клеточных линиях и образцах опухолей различной локализации.
Оценка способности TSG-кандидата RASSF2 к подавлению опухолевого роста в культуре клеток и у иммунодефицитных мышей.
Определение частоты возникновения мутаций в TSG RASSF1A и RBSP3 хромосомы Зр человека в раковых клеточных линиях и образцах эпителиальных опухолей.
Научная новизна работы
В работе модифицирована технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах, созданных с использованием Notl-связующих клонов (Zabarovsky et al, 1990; Li et al., 2002, международный патент WO02/086163). Нами использованы Notl-микрочипы для скрининга хромосомы 3 человека, позволяющие одновременно анализировать 181 Notl-ассоциированный сайт хромосомы 3. Внесен ряд изменений в процесс подготовки проб ДНК-зондов для гибридизации на Notl-микрочипах:
-использование рестрикгазы Sau3AI в комбинации с NotI, дающее возможность получать короткие фрагменты геномной ДНК, эффективно гибридизующиеся на микрочипах;
-использование биотинилированного Notl-линкера и стрептавидиновых магнитных шариков, позволяющее избавляться от метилированных фрагментов ДНК и от повторов геномной ДНК, которые существенно занижают силу сигнала при гибридизации.
Отработаны условия машинной гибридизации ДНК-проб на Notl-микрочипах.
Модифицирована математическая обработка результатов гибридизации на микрочипах.
С помощью модифицированной технологии сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах проанализированы геномные и эпигеномные изменения хромосомы 3 человека в 250 образцах эпителиальных опухолей и лейкемии. Показано, что причиной инактивации TSG, локализованных в хромосоме 3, могут быть не только мутации и делении, но и метилирование их промоторных областей. На основании результатов гибридизации на Notl-микрочипах и бисульфитного секвенирования метилирование NotI -локусов в генах NKiRASl, RARbetal, ITGA9, MINT24, ZIC4, VHL, RBSP3, BHLHB2, GATA2, UBE2E2, LRRC3B выявлено более чем в 30% образцов опухолей различной локализации. Метилирование генов BHLHB2, ITGA9, ZIC4, GATA2 при канцерогенезе показано впервые.
Обнаружена взаимосвязь между снижением экспрессии гена RASSF2 и метилированием его промоторной области в клетках рака молочной железы, образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и рака молочной железы. Экспериментально установлено, что обработка с 5-aza-2dC способна восстановить экспрессию RASSF2 в тех раковых клеточных линиях молочной железы, в которых прежде наблюдалось метилирование. В данной работе впервые показана способность гена RASSF2A подавлять рост клеток рака молочной железы in vitro и в иммунодефицитных мышах. Обнаружено, что в образцах опухоли почки и НМРЛ, где метилированы промоторные области генов HYAL2, RBSP3, RASSF1A, ITGA9, снижен уровень мРНК этих генов.
Впервые выявлена повышенная частота мутаций в генах-супрессорах опухолевого роста RASSF1A и RBSP3 и показано, что мутации могут снижать опухоль-подавляющую способность этих генов.
Практическая значимость работы
Практическая ценность работы заключается в модификации методики гибридизации на Notl-микрочипах, позволяющей одновременно определять наличие геномных и эпигеномных изменений в геноме опухолевых клеток. Модифицированная методика позволяет достаточно быстро выявлять новые онко-ассоциированные гены. Идентифицированные в данной работе новые 9 генов-кандидатов в TSG на хромосоме 3 человека могут быть использованы в качестве
маркеров для ранней диагностики и мониторинга эффективности лечения онкозаболеваний, а также представляют потенциальный интерес для генной терапии.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на International Conference "Genetics in Russia and in the World", Moscow, July 2006; 11th Annual Human Genome Meeting, Helsinki, 2006; IACR Workshop (The International Agency for Research on Cancer, IARC), Lion, France, June, 2006; 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine October 12-14, 2006, Hersonissos, Crete, Greece; 3-ей Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007; The 12th World Congress on Advances in oncology and 10th International Symposium on Molecular Medicine, 11-13 October, 2007, Hersonissos, Crete, Greece; The EMBO/FEBS workshop «Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer» on the Island of Spctscs, Greece August 15-24, 2007.
По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи в международных и отечественных рецензируемых журналах и 7 сообщений в виде тезисов научных конференций.
Струшура и объем работы
Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список
цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста
и содержит иллюстраций (рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография
включает наименований.
