Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Гены-супрессоры опухолевого роста, TSG 11
1.2. Современные подходы к поиску новых TSG 17
1.2.1. Анализ геми- и гомозиготных делеций. Количественная - ПЦР в режиме реального времени 18
1.2.2. Поиск участков хромосомы, обладающих способностью подавлять рост опухоли 21
1.2.3. "Вычитающая" гибридизация как один из альтернативных подходов к поиску TSG 22
1.2.4. Применение микропанелей для поиска генов супрессоров 24
1.2.5. Методы анализа метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG в опухолях 26
1.3. Картирование на коротком плече хромосомы 3 критичных районов, потенциально содержащих гены, связанные с эпителиальными опухолями разных локализаций 30
1.3.1. Картирование критичных районов Зр в опухолях почки 30
1.3.2. Картирование критичных районов Зр в опухолях легкого. 32
1.3.3. Картирование критичных районов Зр в опухолях молочной железы 35
1.3.4. Картирование критичных районов Зр в опухолях женских репродуктивных органов 36
1.3.5. Критичные участки на Зр-плече, общие для эпителиальных опухолей разных локализаций 38
1.4. Роль метилирования в регулировании активности генов 42
1.4.1. CpG-островки и гены 42
1.4.2. Гипометилирование ДНК в опухолях 46
1.4.3. Гиперметилирование ДНК в опухолях 48
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов 53
1.5. Гены-кандидаты на коротком плече хромосомы 3, активность которых подавляется в опухолях за счет метилирования 55
1.5.1. Новый ген-кандидат в области Зр23-р22.3 - RAR-beta 2 55
1.5.2. Область Зр21.3, район LUCA (lung cancer) 57
1.5.2.1. Ген-кандидат RASSF1A 59
1.5.2.2. Ген-кандидат SEMA3B. 60
2. Материалы и методы 62
2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы.. 62
2.2. Сбор материала 63
2.3. Выделение геномной ДНК из ткани 64
2.4. Анализ потерь гетерозиготносте 65
2.5. Полимеразная цепная реакция 68
2.6. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации 69
2.7. Метилчувствительный рестриктный анализ (МЧРА) 70
2.8. Бисульфитная модификация геномной ДНК 72
2.8.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе 72
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах 74
2.9. Метил-специфичная ПЦР (МСП) 74
2.10. Бисульфитное секвенирование 75
2.11. Статистическая обработка результатов 77
2.11.1. Точный критерий Фишера 77
2.11.2. Ранговая корреляции Спирмана 77
3. Результаты и обсуждение 79
3.1. Картирование критичных районов в области короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях пяти локализаций 79
3.1.1. Аллельные изменения в полиморфных маркерах Зр-плеча в ДНК эпителиальных опухолей 80
3.1.2. Аллельные изменения на Зр в образцах рака почки 84
3.1.3. Аллельные изменения на Зр в образцах рака легкого 86
3.1.4. Аллельные изменения на Зр в образцах рака молочной железы 88
3.1.5. Аллельные изменения на Зр в образцах рака яичников 90
3.1.6. Аллельные изменения на Зр в образцах рака шейки матки 92
3.1.7. Сравнение аллельных изменений на Зр в образцах ДНК эпителиальных опухолей пяти локализаций 94
3.1.8. Районы наиболее частых аллельных делеций в пяти типах эпителиального рака 96
3.1.9. Корреляция частоты аллельных делеций со степенью и стадией анаплазии в опухолях пяти локализаций 100
3.1.10. Подтверждение данных по картированию аллельных изменений на Зр-плече в опухолях RCC, ВС и СС с помощью ПЦР в режиме реального времени 103
3.1.11 Картирование гомозиготных делеций методом мультиплексной ПЦР 106
3.1.12. Скрининг гомозиготных делеций в генах из критичных районов Зр 109
3.1.13. Кластеры потенциальных TSG и онкогенов в критичных районах Зр 113
3.2. Спектр метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 в эпителивальных опухолях разной локализации 115
3.2.1. Анализ метилирования промоторного района гена RASSF1A методами МСП и МЧРА в опухолях почки, молочной железы и яичников 115
3.2.2. Анализ метилирования промоторного района гена SEMA3B в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования. 125
3.2.3. Анализ метилирования промоторного района гена RAR-beta2 в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования. 132
3.2.4. Корреляция уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 со степенью анаплазии и с клинической стадией в опухолях различных локализаций 139
3.2.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров 141
Выводы 144
- Современные подходы к поиску новых TSG
- Роль метилирования в регулировании активности генов
- Метил-специфичная ПЦР (МСП)
- Спектр метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 в эпителивальных опухолях разной локализации
Введение к работе
Онкологические заболевания занимают второе место в мире по причине смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и представляют собой одну из наиболее, актуальных проблем здравоохранения. Достигнутый в последнее время прогресс в изучении молекулярно-генетических основ канцерогенеза является важным шагом к пониманию природы рака.
Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы. С целью поиска генов, связанных с развитием опухолей, в первую очередь проводят картирование областей ДНК, часто делегируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов. При выявлении новых генов-кандидатов сравнивают уровень их экспрессии (синтез м-РНК) в опухоли по сравнению с аналогичным паттерном в гистологически нормальных тканях, прилежащих к опухоли. В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в их промоторных районах (Jones et al., 2001; Attwood et al., 2002; Jain 2003).
Гиперметилирование CpG-островков в промоторном районе найдено для ряда ге-нов-супрессоров, таких как VHL, hMLHl, pi 6, С ASP 8, pNARF, GSTPl, MGMT RASSF1A и др. (Herman et al., 1994, 1998; Teitz et al., 2000; Esteller et al., 1999a; 1999b; 2000; Dammann et al., 2003). Метилирование регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins), и более того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние (Bird, 2002; Prokhortchouk et al., 2002). Изменение статуса метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза (Nass et al., 2000; Esteller et al., 2001). Изменения в уровне метилирования промоторных районов ряда генов показаны для рака молочной железы, простаты, легкого и рака других локализаций (Baylin et al., 1998; Palmisana et al., 2000; Esteller etal, 2001).
Идентификация и анализ генов, изменяющих статус метилирования в опухолях, -важная задача как для науки, так и для практики. С теоретической точки зрения такие исследования способствуют изучению фундаментальных механизмов патогенеза опухолей, а с практической — позволяют осуществлять поиск новых молекулярных мар-
керов для ранней диагностики, прогноза, профилактики и мониторинга распространенных онкологических заболеваний.
В злокачественных новообразованиях человека делеции и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 1,3, б, 8, 9, 13, 17, 18 и других (Girard et al., 2000; Richard et al., 2000). В некоторых видах опухолей, например, в светлоклеточной карциноме почки, и во всех типах рака легкого в наибольшей степени делециям подвержено короткое плечо хромосомы 3 (Зр). Делеции в области короткого плеча хромосомы 3 также обнаружены в опухолях многих других органов, включая рак молочной железы, шейки матки и яичников (Kok et al, 1997; Maitra et al., 2001; Simsir et al., 2001). Высо-- кая частота потери гетерозиготносте (LOH) в некоторых районах на Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делеции (HD) и опухоль-подавляющей активности явились предпосылкой для поиска на Зр генов, связанных с канцерогенезом.
В результате за последние несколько лет на коротком плече хромосомы 3 человека было открыто до 10 генов-супрессоров, а также кластеры генов-кандидатов в новых критичных районах Зр (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др. 2003, 2004). Регуляция активности ряда генов из этих районов осуществляется с помощью метилирования про-моторных районов: RASSF1A, SEMA3B, HYAL1, BLU, CACNA2D2 и MLH1 (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др 2003; Lerman and Minna 2000).
В связи с этим идентификация на Зр новых генов, участвующих в развитии эпителиальных опухолей, и анализ регуляции их активности за счет гиперметилирования -актуальные задачи онкогеномики и молекулярной биологии в целом.
Данная работа направлена на идентификацию на коротком плече хромосомы 3 новых генов, связанных с патогенезом таких распространенных и социально опасных форм рака, как рак почки, легкого, молочной железы, яичников и шейки матки.
Первый этап работы состоял в проведении делеционного картирования короткого плеча хромосомы 3 в эпителиальных опухолях пяти видов с целью локализации критичных районов, общих и специфичных для разных типов рака, и потенциально содержащих гены, связанные с их развитием. Для этого была использована выборка из 311 парных образцов эпителиальных опухолей различных локализаций и панель из 24 полиморфных микросателлитных маркеров.
Полученные результаты позволили локализовать новый район генов-кандидатов в области Зр21.31 между маркерами D3S2409, D3S2456 и D3S3667. В этом критичном районе (0.6 млн.п.н.) содержится до 20 новых генов; для семи из них имеются данные о возможном участии в онкогенезе. Показано, что метод аллелотипирования поли-
морфных маркеров и метод количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) согласуются при исследовании парных образцов ДНК опухоли и соответствующей нормы {Р<0.05, согласно корреляции Спирмана). Установлена достоверная прямая корреляция частоты аллельных делеций со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций для района АР20 и других участков области Зр21.3. Согласно этим данным, гены из определенных районов Зр связаны с прогрессией рака, и их можно применять с целью прогнозирования течения заболевания.
На втором этапе нашей работы был проведен детальный анализ уровня (частоты и плотности) метилирования CpG-островков в промоторных районах потенциальных - генов-супрессоров RASSF1A, SEMA3B (Зр21.31) и RAR-beta2 (Зр23-р22.3) в первичных опухолях почек, молочной железы и яичников (172 случая). Для этого была использована комбинация методов, включающая бисульфитное секвенирование, МСП (метил-специфичную ПЦР) (Clark et ah, 1994, Herman et al., 1996) и МЧРА (метилчувстви-тельный рестриктный анализ). Для оценки метилирования промоторных районов генов разработана новая модификация метода МЧРА, основанная на применении набора соответствующих метил-чувствительных рестриктаз. Показано, что в такой модификации чувствительность и достоверность результатов МЧРА существенно возрастают и становятся выше, чем при использовании метода МСП. В случае некоторых генов МЧРА с применением набора рестриктаз позволяет детально исследовать метилирование CpG-островка, как и с помощью бисульфитного секвенирования.
В результате был выявлен ряд особенностей метилирования промоторных районов этих генов. Так, ген RASSF1A метилирован в опухолях яичников и почки с частотой 73% и 94% соответственно. В 1.5 раза реже (44% и 61% соответственно) при этих двух видах рака наблюдали метилирование гена SEMA3B. Напротив, частота метилирования гена RAR-beta2 резко отличалась в опухолях этих локализаций, достигая 90% при почечноклеточном раке и только 27% в эпителиальных опухолях яичников. Впервые установлена достоверная положительная корреляция степени метилирования гена SEMA3B со стадией и степенью анаплазии опухолей яичников и почки, а гена RASSF1A - с прогрессией опухолей яичников. Кроме того, в промоторных районах генов Зр RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B обнаружены гомозиготные делеций в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников и показана их ассоциация с тяжелой клинической стадией онкологических заболеваний.
Показано, что метилирование генов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B можно обнаружить уже на ранней стадии опухолевого процесса. В связи с этим данные маркеры целесообразно использовать для ранней диагностики рака. С другой стороны, прямая достоверная корреляция между уровнем метилирования генов RASSF1A и SEMA3B и клинико-морфологическими показателями опухолей позволяет применять эти факторы в качестве молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания.
Следует отметить, что подобное сравнительное исследование отдельной хромосомы в нескольких формах рака проводится впервые.
Современные подходы к поиску новых TSG
Количество выявленных TSG в последнее время значительно возросло. Это связано с прогрессом в расшифровке генома человека и создании общедоступных баз данных и разработкой новых стратегий при поиске генов-супрессоров. Конкретный ген из данной области рассматривается в качестве гена-супрессора на основании следующих критериев: 1.) Локализация в часто делегируемом районе; 2.) Заметно сниженная экспрессия (в результате метилирования промоторного района или мутации гена) или синтез транскрипта ненормального размера; 3.) Способность подавлять рост опухоли при переносе в раковые клетки; 4.) Биологическая функция гена, выявленная на основе его последовательности или при помощи специальных исследований. Стратегия поиска традиционно включает два основных этапа: 1.) Локализацию, сужение и картирование исследуемой области; 2.) Идентификацию и анализ генов-кандидатов внутри исследуемой области (Баранова и др., 1998). Локализация участков хромосомы, наиболее часто делегируемых в опухолях, осуществляется с помощью аллелотипирования полиморфных маркеров. Делеций в ДНК опухолей обнаруживают и цитогенетическими методами. Данные кариотипирования суммированы для 3200 опухолей разной локализации (Mertens et al., 1997), что позволило оценить приблизительное расположение районов с высокой частотой делеций на разных хромосомах человека. Анализ потери гетерозиготности (LOH) с использованием полиморфных маркеров позволяет более детально картировать делеций. Для подтверждения данных аллелотипирования применяют метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), метод сравнительной геномной гибридизации (CGH), и другие (Gray et al., 2000; Alimov et al., 2000). Традиционное картирование исследуемой области с использованием YAC (Yeast Artificial Chromosome)-, РАС (PI-derived Artificial Chromosome)- и ВАС (Bacterial Artificial Chromosome)-ioiOHOB после раскрытия значительной части структуры генома человека теряет популярность. Вместо этой трудоемкой процедуры можно проводить компьютерный анализ баз данных генома человека (например, NCBI). Все чаще используют компьютерные методы анализа, позволяющие распознавать кодирующие участки (CRM, charge residue model) и сравнивать гипотетические экзоны с аминокислотными последовательностями известных белков (XGRAIL). Для выявления генов с измененной транскрипцией применяют программу серийного анализа экспрессии генов (SAGE) (Lash et al., 2000). Для TSG-кандидатов исследуют возможность потери или снижения уровня экспрессии в клеточных линиях и первичных опухолях. Применяют как RT-PCR (ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией), так и классическую нозерн-гибридизацию, обладающую преимуществом различать инактивацию в опухоли отдельных продуктов альтернативного сплайсинга.
Для гена (-ов) с утраченной или пониженной транскрипцией выясняют способ его инактивации: частые мутации в горячих точках гена (как в случае гена р53), делеции или эпигенетическое метилирование. Гиперметили-. рование CpG-островов промоторного района выключает некоторые гены в опухолях с частотой до 90% случаев (Dreijerink et al., 2001). 1.2.1. Анализ геми- и гомозиготных делеций. Количественная ПЦР в режиме реального времени. Основным подходом к выявлению делеций остается анализ потери гетерозиготносте полиморфных маркеров (LOH) при сравнении препаратов ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной ткани. Впервые полиморфные пробы были использованы для такого анализа в 1983 году (Cavenee et al., 1983). Современный метод анализа LOH основан на использовании маркеров с известной геномной локализацией, созданных на основе последовательностей микросателлитов. Микросателлиты представ- ляют собой тандемно повторяющиеся короткие нуклеотидные последовательности (2-4 п.н.). Они входят в состав сателлитной ДНК и образуют в геноме кластеры, содержащие по 15-30 повторов. Частота встречаемости микросателлитных повторов в геноме человека варьирует в зависимости от типа повторов и для СА-повторов составляет примерно 1 кластер на 60 т.п.н. Эти локус-специфичные фрагменты ДНК могут быть амплифицированы в полимеразной цепной реакции с использованием прайме-ров, комплиментарных последовательностям, фланкирующим эти повторы. Важным обстоятельством является высокая специфичность каждого из таких локусов, обусловленная использованием для создания праймеров уникальных последовательностей ДНК. А также характерная для них высокая степень полиморфности, т.е. вероятность того, что два родительских аллеля будут различаться по числу микросателлитных повторов. Гетерозиготность высокополиморфных маркеров составляет 0.7-0.9. Эти особенности позволяют использовать микросателлитные маркеры в качестве удобного инструмента для анализа стабильности данного локуса ДНК (Wooster et al., 1994). По сравнению с цитогенетическим анализом метод определения аллельных потерь обладает рядом преимуществ: 1) Можно использовать ДНК, выдел енную из замороженных или парафинированных тканей; не требуются живые митотические клетки, получение которых из опухолевого образца может вызывать трудности. 2) Более высокая разрешающая способность делеционного анализа с ДНК маркерами по сравнению с цитогенетическими методами анализа. Разрешающую способность делеционного анализа можно увеличить повышая плотность расположения ДНК-маркеров на данном участке хромосомы (Kok et al., 1997). Интерпретация результатов LOH-анализа осложнена загрязнением образцов опухолей нормальными клетками, примесь которых в большей степени затрудняет выявление потери более легкого, или L (Light), аллеля (Liu et al., 1999). Поэтому результаты LOH-анализа необходимо проверить другим, независимым методом, например CGH (Gray et al., 2000; Alimov et al., 2000). Для проверки результатов LOH и поиска гомозиготных делеций используют также мультиплексный ПЦР и метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Realime PCR или ПЦР-РВ), позволяющий количественно определить изменения копийности участка хромосомы в опухоли (Gibson et al., 1996; Heid et al., 1996). В отличие от обычной ПЦР, где продукты определяют на конечной стадии реакции, этот новый метод позволяет наблюдать накопление продуктов ПЦР в экспоненциальной фазе реакции.
Линейный отрезок кривой можно использовать для определения начального числа копий исследуемого фрагмента ДНК. К преимуществам метода относятся быстрота, точность определения, воспроизводимость результатов, широкий диапазон концентраций и чувствительность, а также отсутствие дополнительных процедур после завершения реакции. Благодаря тщательно отработанному составу реакционной смеси и температурному режиму, значительно уменьшается риск появления побочных продуктов. Метод применим для полиморфных и неполиморфных STS (sequence tagged site) (Boulay et al., 1999; Ginzinger et al., 2000). TaqMan Realime PCR состоит из двух основных стадий: 1) гибридизации исследуемой ДНК с TaqMan-пробой (коротким олигонуклеотидом, содержащим на 5 - конце флуоресцентный краситель) и 2) ПЦР, катализируемой ДНК-полимеразой Taq, которая, обладает 5 - экзо-нуклеазной активностью и одновременно расщепляет TaqMan-пробу (рис 1). Это приводит к нарастанию флуоресцентного сигнала в результате нарушения взаимодействия репортерного красителя с "гасителем", находящимся на 3 -конце пробы. Измерение флуоресценции во время экспоненциальной фазы позволяет определить величину порогового цикла С/, обратно пропорциональную исходному числу копий анализируемой ДНК. При сравнении образцов мужской и женской ДНК, с помощью Realime PCR удаётся "вслепую" определить пол пациентов (Senchenko et al., 2003). 1.2.2. Поиск участков хромосомы, обладающих способностью подавлять рост опухоли. Важную роль в предварительной идентификации районов TSG на Зр-плече сыграли работы по локализации участков, способных подавлять опухолевый рост. Эту способность выявляли с помощью опосредованного микроклетками переноса хромосомы (ММСТ, microcell mediated chromosome transfer, Stanbridge et al., 1990) мышам с иммунодефицитом. В исходных опытах гибридные микроклетки создавали из линии клеток фибросаркомы мыши А9 и хромосомы 3 человека (Kok et al., 1997). В дальнейшем проводили слияние гибридов А9-хромосома 3 и линий опухолевых клеток человека (KRC -7, HEY и др.) (Cheng et al., 1998; Lowell et al., 1999). Полученные клетки вводили бестимусным мышам и анализировали их способность к образованию опухолей по сравнению с исходной клеточной линией. В гибридных клетках опухолей картировали делеции на хромосоме 3 человека и определяли участки, подавляющие рост опухолей.
Роль метилирования в регулировании активности генов
Геном млекопитающих можно разделить на две неравные части по уровню метилирования ДНК (Cooper et al., 1983; Bird et al., 1985). Основная часть CpG-динуклеотидов (около 98% от общего количества) представлена фрагментами по 50-100 п.н. и интенсивно метилирована, меньшая, около 2%, представлена фрагментами длинной до 10 п.н. и неметилирована. Фрагменты в составе G/C-обогащенных участков ДНК и локализованные в 5 -областях генов, получили название CpG-островков (Bird, 1987). Приблизительно 60% генов, связанных с CpG-островками, являются генами "домашнего хозяйства", а 40% представлены ткане-специфичными генами. В большинстве случаев CpG-островок включает в себя промоторный район гена и один или более экзонов гена. Основная часть CpG-островков представлена короткими фрагментами (до 1000 п.н.) с содержанием G/C-нуклеотидов 60-70% от общего количества (табл. 2). 95% CpG островков включают не более 1850 п.н., а 75% из них - менее 850 п.н. Самый большой из них (36619 п.н.), расположен на 10 хромосоме, еще 322 островка включают более 3000 п.н. В составе некоторых больших островков содержатся рибосомаль-ные псевдогены и гены р-РНК, составляющие очень маленькую часть от всех CpG-островков ( 0.5%). Функции и роль больших CpG-островков неясна (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001). Плотность распределения CpG-островков по хромосомам различна. Большинство хромосом содержит 5-10 CpG-островков на 1 млн.п.н. Однако для хромосомы Y характерна низкая плотность (2.9 на 1 млн.п.н.), в то время как максимум принадлежит хромосоме 19 (43 CpG-островка на 1 млн.п.н.). Относительная плотность CpG-островков коррелирует с оценкой относительной плотности генов на этих хромосомах. Показано, что CpG-островки чаще находятся в районах начала репликации геномной ДНК (R-полосы), чем в районах конечной стадии репликации (G-полосы) (Aissani and Bernardi 1991; Craig and Bickmore 1994). У курицы CpG-островки сконцентрированы на микрохромосомах, тогда как макрохромосомы бедны генами (McQueen et al., .1996). В геноме мыши кластеризация CpG-островков характерна для районов начала репликации (R-полосы), как и у человека (Cross et al., 1997). Поскольку CpG-островки являются эффективными маркерами генов, то клонирование CpG-островков было использовано для идентификации новых генов (Okano et al., 1999; Esteller et al., 1998; 2002; Lerman and Minna 2000).
Кроме того, каждый CpG-островок содержится в геномной ДНК в эквимолярных количествах в отличие от транскриптов, представленных в к-ДНК библиотеках. Локализацию и клонирование CpG-островков использовали для идентификации генов, в том числе отсутствующих в библиотеках к-ДНК (Dammann et al. 2000; Kashuba et al., 2004). Был разработан метод направленной массовой изоляции CpG-островков из геномной ДНК с помощью матрицы, содержащей метил-СрО-связывающий домен (MBD), выделенный из крысиного белка МеСР2 и прикрепленный к твердой основе (рис. 4.) (Cross et al., 1994). Колонка, содержащая матрицу, фракционирует ДНК в соответствии с уровнем метилирования CpG-островков, дольше удерживая те последовательности, которые сильнее метилированы. Эксперимент состоит из четырех этапов. На первом, геномная ДНК подвергается обработке рестриктазой Msel (ТТАА), участки узнавания которой редко встречаются в CpG-островках: 1 на 1000 п.н., что реже, чем в геноме в целом (1 на 140 п.н.). На втором этапе происходит отбор фрагментов с низким уровнем метилирования. На третьем - под действием бактериальной метилтрансферазы M.Sssl метилируются все CpG во всех собранных фракциях. Фрагменты CpG-островков с низким метилированием преобразуются в высоко метилированные и повышается их сродство к колонкам. В результате на четвертом этапе должна получиться фракция сильно обогащенная CpG-фрагментами, исходно неметилированными. Плотность распределения CpG-островков по хромосомам различна. Большинство хромосом содержит 5-10 CpG-островков на 1 млн.п.н. Однако для хромосомы Y характерна низкая плотность (2.9 на 1 млн.п.н.), в то время как максимум принадлежит хромосоме 19 (43 CpG-островка на 1 млн.п.н.). Относительная плотность CpG-островков коррелирует с оценкой относительной плотности генов на этих хромосомах. Показано, что CpG-островки чаще находятся в районах начала репликации геномной ДНК (R-полосы), чем в районах конечной стадии репликации (G-полосы) (Aissani and Bernardi 1991; Craig and Bickmore 1994). У курицы CpG-островки сконцентрированы на микрохромосомах, тогда как макрохромосомы бедны генами (McQueen et al., .1996). В геноме мыши кластеризация CpG-островков характерна для районов начала репликации (R-полосы), как и у человека (Cross et al., 1997). Поскольку CpG-островки являются эффективными маркерами генов, то клонирование CpG-островков было использовано для идентификации новых генов (Okano et al., 1999; Esteller et al., 1998; 2002; Lerman and Minna 2000). Кроме того, каждый CpG-островок содержится в геномной ДНК в эквимолярных количествах в отличие от транскриптов, представленных в к-ДНК библиотеках. Локализацию и клонирование CpG-островков использовали для идентификации генов, в том числе отсутствующих в библиотеках к-ДНК (Dammann et al. 2000; Kashuba et al., 2004). Был разработан метод направленной массовой изоляции CpG-островков из геномной ДНК с помощью матрицы, содержащей метил-СрО-связывающий домен (MBD), выделенный из крысиного белка МеСР2 и прикрепленный к твердой основе (рис. 4.) (Cross et al., 1994). Колонка, содержащая матрицу, фракционирует ДНК в соответствии с уровнем метилирования CpG-островков, дольше удерживая те последовательности, которые сильнее метилированы. Эксперимент состоит из четырех этапов. На первом, геномная ДНК подвергается обработке рестриктазой Msel (ТТАА), участки узнавания которой редко встречаются в CpG-островках: 1 на 1000 п.н., что реже, чем в геноме в целом (1 на 140 п.н.). На втором этапе происходит отбор фрагментов с низким уровнем метилирования. На третьем - под действием бактериальной метилтрансферазы M.Sssl метилируются все CpG во всех собранных фракциях. Фрагменты CpG-островков с низким метилированием преобразуются в высоко метилированные и повышается их сродство к колонкам. В результате на четвертом этапе должна получиться фракция сильно обогащенная CpG-фрагментами, исходно неметилированными. С использованием этого метода были созданы библиотеки CpG-островков для человека, мыши и курицы, которые были использованы для анализа организации генов и геномов (Cross and Bird, 1995; McQueen et al, 1996; Cross et al., 1994; 1997).
Метилирование цитозина — единственная эндогенная модификация ДНК у млекопитающих (Doerfler, 1983). Большинство 5 -метилцитозинов в ДНК млекопитающих присутствует в динуклеотидах 5 -CpG-3 (Riggs и Jones, 1983). Non-CpG-последовательности, такие как 5 -CpNpG-3 (Clark et al., 1995) или асимметричные 5 -СрА-3 и 5 -СрТ-3 (Woodcock et al., 1997), также могут демонстрировать метилирование, но в гораздо меньшей степени. В эмбриональных клетках мыши метилирова-_ние non-CpG составляет 15-20% от общего количества 5 -метилцитозинов (Ramsahoye et al., 2000). Метилирование ДНК присутствует у всех организмов - от бактерии до человека. У бактерий метилирование - это часть защитного механизма, снижающего перенос генов между видами. Мутанты бактерий, не имеющие метилирования, тем не менее, живут и размножаются. В отличие от бактерий инактивация любого из трех генов, кодирующих метилтрансферазы у мышей, приводит к летальному исходу (Bestor et al., 1988; Okano et al, 1999). При изучении метилирования ДНК на разных этапах развития организма было установлено, что яйцеклетки менее метилированы, чем сперматозоиды (Monk et al, 1987; Kafri et al, 1992). Во взрослом состоянии, степень метилирования ткани и клеток специфична и изменяется с возрастом (Issa, 2000). Предложены два механизма метилирования CpG-островков в неоплазиях (Baylin et al., 1998; Jones, 1999; Tycko, 2000). Один путь метилирования ДНК в опухолевой клетке связан с потерей факторов, защищающих ДНК от метилирования. В роли этих факторов могут быть как структурные белки, так и факторы транскрипции (Brandeis et al., 1994; Zardo and Caiafa 1998). Согласно другому механизму предполагается, что аномальное метилирование CpG-островков связано с гиперэкспрессией генов, ответственных за метилирование ДНК. В клетках млекопитающих было найдены три гена метилтрансфераз: DNMT1, DNMT3A и DNMT3B (Bestor et al., 1988: Okano et al., 1999). DNMT1 использует частично метилированную ДНК как селективный шаблон (Bouchrd and Momparler 1983).
Метил-специфичная ПЦР (МСП)
Препараты ДНК из опухолей и из соответствующей нормальной ткани подвергали конверсии бисульфитом, а затем исследовали с помощью ПЦР. Праймеры подбирали кисследуемому локусу в двух вариантах: 1) к метилированному аллелю, 2) к немети-лированному аллелю. Предполагалось, что CpG-пары, входящие в состав праймеров, или полностью метилированы или, наоборот, полностью свободны от этой модификации. Параметры праймеров указаны в таблице 9. ПЦР проводили на амплификаторах Techne РСН-3 (Англия) и Терцик (Россия). МСП проводили в 50 мкл реакционной смеси для амплификации, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 9.3; 16.7 мМ (NH SO , 0.01% твин-20; 0.25 мМ каждого dNTP; 5 -20 нг модифицированной ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 5 - 10 ед Taq полимера-зы; MgCh в концентрации 2.0.-3.0 мМ. Амплификация праймеров 7+8 проходила по следующей программе: 95С - 5 мин; 35 циклов (94С - 45 с, 58С - 1 мин, 72С - 1 мин) и 72С - 7 мин. Полученные амплификационнные фрагменты были использованы для повторной амплификации с двумя парами праймеров, содержащими CpG-пары, при следующих условиях: 1) 95С - 5 мин; 35 циклов (95С - 30 с, 58С - 1 мин, 72С - 30) и 72С - 7 мин для не метилированной последовательности (3+4); 2) 95 С - 2 мин; 35 циклов (95С - 30 с, 64С - 30 с, 72С - 30 с) и 72С - 7 мин метилированной последовательности (5+6). В качестве положительного контроля была использована клеточная линия рака легкого U2020. В качестве негативных контролен использовалась как лимфоцитарная ДНК, подвергшаяся модификации, так и ДНК не подвергшаяся обработке. 10 мкл ам-плификата разделяли в 2% агарозном геле и затем фотографировали (рис. 29А). 2.10. Бисульфитное секвенирование. Препараты ДНК после бисульфитной конверсии использовали для амплификации исследуемых фрагментов генов с целью их дальнейшего секвенирования (Frommer et al., 1992; Dammann et al., 2000). Праймеры были подобраны таким образом, чтобы они были специфичными для прямой последовательности модифицированной ДНК и не содержали CpG пар в оригинальном сиквенсе. Параметры праймеров для локусов SemV и Rar-m указаны в таблице 9. ПЦР проводили в 50 мкл реакционной смеси для амплификации, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 9.3; 16.7 мМ (NH SC) 0.01% твин-20; 0.25 мМ каждого dNTP; 5 - 20 нг модифицированной ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 5 ед Taq полимеразы; MgC в концентрации 2.0.-3.0 мМ. Амплификация праймеров SemV проходила по следующей программе: 95С - 10 мин; 30 циклов (95С - 30 с, 62С - 1 мин, 72С - 1 мин) и 72С - 7 мин; Rar-m: 94С - 5 мин; 35 цик- лов (94С - 15 с, 53С - 15 с, 72С - 30с) и 72С - 5 мин. ПЦР проводили на амплификаторах Techne РСН-3 (Англия) и Терцик (Россия). Весь полученный амплификат наносился на 1,5 % агарозный гель с последующей элюцией фрагмента нужной длинны с использованием JETquick Gel Extraction Spin Kit фирмы "Genomed".
Пробы растворяли в деионизованной воде и проверяли концентрацию относительно плазмиды pBR322 в 2% агарозном геле. Проба для сиквенса содержала 5 - Юнг исследуемого образца и 25 пмолей одного из праймеров для исследуемого локуса. Автоматическое секвенирование нуклеотидных последовательностей. Автоматическое секвенирование включает две стадии: 1) терминирующую реакцию 2) разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Терминирующие реакции проводили с использованием флуоресцентно меченных ddNTP (каждый тип ddNTP-терминатора своим красителем) и немеченого праймера. Конечный объем составлял 20 мкл реакционной смеси, содержащей lx ABI PrismR BigDye V 1.6 буфер (Perkin Elmer), 10 мкМ праймера, 5-20 нг исследуемого образца и 3% ДМСО. Реакцию проводили на амплификаторах Perkin Elmer (Foster City, США) по следующей программе: 1) Начальная активация AmpliTaq полимеразы при 95С - 2 мин 2) 60 циклов, состоящих из: а) денатурации при 95 С - 15 с б) отжиг при 55С - 20 с в) элонгации при 68С - 20 с Полученные в реакции секвенирования флуоресцентно меченные одноцепочечные фрагменты ДНК анализировали на секвенаторе ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Разделение флуоресцентно меченных одноцепочечных фрагментов ДНК проходило в 5% полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевину и в трис-боратном буфере (89 гаМ Трис-НС1, 8.9 тМ борной кислоты, 2тМ ЭДТА, рН 8.0-8.5). "Трехкомпонентные" красители класса BigDye (Applied Biosystems), характеризуются безизлучательным переносом энергии возбужденного состояния от донора к акцептору. Донором в BigDye является 4 -аминометил-5(или 6)-карбоксифлуоресцеин (5CF или 6CF), который связан с акцептором (представителем семейства d-родаминов) через остаток 4-аминометилбензойной кислоты. Данные красители флуоресцируют в видимой области спектра в диапазоне длин волн 450-650 нм. В процессе сканирования эмиссия флуоресценции отделяется от отраженного света . лазера, рассеивается посредством дифракционной решетки - это позволяет разложить исходный световой пучок на спектральные составляющие, и фиксируется CCD-камерой. Кванты света преобразуются в пиксели во всем промежутке спектра. Какой именно набор пикселей преобразовать в пик на хроматограмме задается заранее в зависимости от используемых флуорофоров и способа введения метки. Хроматограммы анализировали с помощью программы Chromas V 1.45. 2.11. Статистическая обработка результатов. 2.11.1. Точный критерий Фишера. Для сравнения частот встречаемости LOH, HD и метилирования нами использовался точный критерий Фишера. Достоверными считали различия при Р 0.05. Тест Фишера позволяет оценить статистическую достоверность различий между 2 группами. Используется матрица размером 2x2, столбцами и строками, в которой являются соответственно исследуемые группы и группы сравнения. Нулевой гипотезой считается предположение о наличии различий между группами, альтернативной - об их отсутствии. В отличие от других статистических тестов, уровень значимости различий вычисляется с помощью точного алгоритма.
Его суть заключается в определении вероятностей получения нашей конкретной выборки и всех выборок с еще меньшей вероятностью при случайном переборе исходных данных. Сумма этих вероятностей и является искомым уровнем значимости различий между двумя сравниваемыми выборками. 2.11.2. Ранговая корреляция Спирмана. (Conover, 1980). Для оценки взаимосвязи между величинами, не подчиняющимися нормальному распределению, к которым относятся и табулированные случайные величины используется ранговая корреляция Спирмана. Она относится к группе непараметрических методов и соответственно не требует никаких предположений о распределении случайной величины. Сначала проводится формирование выборок состоящих из одинаковых элементов. Затем рассчитываются ранги для каждой из выборок. Ранг равен среднему порядковому номеру в группе одинаковых элементов (т.е. одинаковых значений переменной). Далее считается квадрат разности рангов по формуле: С целью локализации критичных районов, потенциально содержащих гены-супрессоры опухолевого роста (TSG), на первом этапе данной работы было проведено детальное картирование короткого плеча хромосомы 3 (Зр) в образцах эпителиальных опухолей пяти локализаций (311 случаев). Для этого использована плотная панель микросателлитных маркеров, состоящая из 10 три- и тетрануклеотидных и 14 динук-леотидных маркеров. Использованные маркеры входят в состав 11 цитогенетических районов, что позволило исследовать аллельные изменения, происходящие на всем -протяжении Зр-плеча. Наиболее детально исследован район Зр21.3,10 маркеров. На втором этапе нашей работы был изучен спектр метилирования промоторных районов новых кандидатов в TSG: RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2, в первичных опухолях почек, молочной железы и яичников (172 случая). Использована комбинация методов: бисульфитное секвенирование, метил-специфичная ПЦР (МСП) и метил-чувствительный рестриктный анализ (МЧРА). Оценка вклада метилирования TSG среди других путей его инактивации важна для выяснения роли TSG при развитии злокачественных новообразований и для выявления возможных ассоциаций с клини-ко-гистологическими характеристиками образцов, которые можно использовать в целях диагностики, прогноза и мониторинга заболевания.
Спектр метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 в эпителивальных опухолях разной локализации
Физическая карта промоторного района гена RASSFIA (Зр21.31, LUCA) представлена на рис. 28, на котором также показаны 18 CpG-nap фрагмента, участки узнавания метилчувствительных рестриктаз и все праймеры, использованные в работе. Анализ метилирования этого CpG-островка в ДНК опухолей проводили методами МСП (метил-специфичная ПЦР) и МЧРА (метил-чувствительный Еестрикциозный анализ). При использовании метода МСП ПЦР проводили на геномной ДНК после дезамини-рования с помощью бисульфита незащищенных метильной группой цитидиновых остатков. Использовали ДНК опухоли (Т) и прилежащей гистологически нормальной ткани (N). Примеры продуктов МСП показаны на рис. 29А. Как видно из рис. 29А, уровень метилирования RASSFIA в этих тканях (Т и N) сильно различается. Например, метилирование этого гена наблюдали во всех шести представленных образцах RCC и только в одном из шести образцов нормальной ткани (348 N). При ПЦР, специфичной к неметилированному аллелю, продукт амплификации выявлен во всех проанализированных образцах (T/N, данные не приведены). Образование такого продукта в образцах опухолей связывают, главным образом, с их загрязнением прилежащей гистологически нормальной тканью или клетками, проникающими в опухоль, например клетками иммунной системы, составляющими значительную А: Электрофоретическое разделение в 2%-ном агарозном геле продуктов МСП, полученных для ДНК RCC, ВС и ОЕТ. ПЦР проводили на ДНК, конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A; праймеры M/U-L и M/U-R (Burbee et al., 2001) указаны на рис. 28. Продукты ПЦР, специфичной к неметилиро-ванному аллелю, не показаны. М - маркер с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder). Б: Применение МЧРА: электрофоретическое разделения в 2%-ном агарозном геле продуктов ПЦР, полученных для ДНК из четырех образцов RCC до и после (+) гидролиза метил-чувствительной рестриктазой Acil. Контроль полноты рестрикции — фрагмент 445 п.н.; контроль целостности ДНК - фрагмент 229 п.н.; анализируемый фрагмент гена RASSF1A — 357 п.н. (табл. 8). К(-) - отрицательный контроль (в отсутствие ДНК). М - маркер с шагом 100 п.н. часть опухолевой массы.
Поэтому данный тест не позволяет выявлять различия между опухолевой и нормальной тканью и служит только для подтверждения целостности ДНК. Анализ метилирования CpG-островка гена RASSFIA методом МЧРА в опухолях проводили с применением набора из четырех метил-чувствительных рестриктаз: Hpall, Hhal, Bshl236l, Acil. В исследованном фрагменте гена содержится 4 участка узнавания Bshl236l, 7 сайтов Acil, 3 участка Hpall и 6 сайтов Hhal (рис. 28). На рис. 29Б приведены типичные примеры анализа метилирования гена RASSFIA методом МЧРА с использованием метил-чувствительной рестрикционной эндонуклеазы Acil. Видно, что во всех четырех случаях RCC (и в Т, и в N) амплифицируется фрагмент 357 п.н. негидролизованного гена RASSFIA. В одном случае (RCC 540) этот фрагмент амплифицируется и в опухолевой, и в прилежащей нормальной ткани после воздействия рестриктазы Acil, что указывает на метилирование исследуемого участка, как в опухоли, так и в прилежащей морфологически нормальной ткани. Напротив, в случае RCC 545 не наблюдали амплификации обработанного рестриктазой Acil фрагмента гена RASSFIA (357 п.н.) ни в опухолевой, ни в нормальной ткани, хотя ПЦР-продукт исходной ДНК из обоих видов ткани (T/N) виден четко. Показаны и два наиболее типичных примера (RCC 304 и 516), когда после гидролиза продукт ПЦР виден только в образцах опухолей. Сохранение целостности ДНК во всех препаратах подтверждается образованием продукта ПЦР фрагмента RARB2, (229 п.н.), а полнота расщепления рестриктазой - амплификацией фрагмента гена В-ЗА-адаптина (445 п.н.) только из не-гидролизованных ДНК (T/N) и полным ее отсутствием после воздействия рестриктазой Acil. Праймеры и условия ПЦР показаны в разделе 2, табл. 8. На рис. 30 схематически приведены полученные МЧРА с использованием четырех метилчувствительных рестриктаз (Hpall, Hhal, Bshl236l, АсіТ) данные для 53 образцов RCC и 30 образцов прилежащей к опухоли условно нормальной ткани почки. Согласно этим данным, промоторный район гена RASSFIA метилирован в RCC с частотой 94% (50/53), а в гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли — с частотой 33% (10/30) (рис. 30, см. ниже табл. 13). Методом МСП изучены 29 парных образцов (T/N) RCC (на рис. 30 представлены результаты для 19 Т и 6 N). Метилирование промоторного района гена RASSFIA в опухолях почки наблюдали с частотой 86% (25/29), а в условно нормальной ткани - с частотой 10% (3/29) (см. ниже табл. 13). Метод МСП позволяет тестировать только шесть CpG-пар ( 12, 13, 14, 25, 26 и 27), входящих в состав праймеров (M/U-L, M/U-R). В то же время, промоторный район гена RASSF1A содержит 20 участков узнавания Hpall, Hhal, Bshl236l и Acil, 18 из которых не перекрываются (рис. 28). МЧРА с использованием этих ферментов позволяет оценить статус метилирования 18 CpG-nap. С помощью такого подхода удалось не только более полно определить частоту метилирования гена RASSF1A (или долю образцов, в которых этот ген метилирован), но также оценить плотность метилирования CpG-островка в образце или группе образцов (рис. 30, см. ниже табл. 13). С этой целью рассчитывали долю метилированных CpG-nap в образцах соответствующей группы (T/N). Согласно МЧРА, уровень метилирования CpG-островка достигает 72% (644/900) в опухолях почки и 54% (98/180) - в гистологически нормальной ткани почки, прилежащей к опухоли (рис. 30, см. ниже табл. 13). На рис. 29А показаны продукты МСП, полученные для ДНК из четырех ВС, пяти ОЕТ и соответствующей морфологически нормальной ткани. На рис. 31 и 32 схематически представлены данные анализа 46 ВС и 50 ОЕТ с помощью МЧРА и МСП.
Всего методом МСП проанализировали 28 пар ВС и 29 пар ОЕТ. Как видно из этих рисунков, уровень метилирования гена RASSF1A в опухолях заметно выше, чем в условно нормальной ткани. Частоты метилирования гена RASSF1A в опухолях и в условно нормальной ткани также достоверно различаются (Р 0.0051, см. ниже табл. 13), тогда как различия в уровнях метилирования менее выражены: согласно МЧРА, достоверность различий по Фишеру в ВС составила Р = 1.6 х 10" и? = 0.22 при ОЕТ (табл. 13). Следует указать, что метилирование обнаружено также в пяти пограничных и двух доброкачественных опухолях яичников (рис. 32). В ДНК из крови 15 здоровых доноров с использованием МЧРА и этих же метил-чувствительных рестриктаз, Hpall, Hhal, Bshl236l и Acil, не выявлено ни одного случая метилирования CpG-островков гена RASSF1A. Соответствие данных МСП и МЧРА оценивали статистически с использованием ранговой корреляции Спирмана и t-теста Стьюдента. Так результаты обоих методов (рис. 30) совпали для 24 из 25 образцов RCC (19 Т + 6 N): метилирование гена RASSF1A выявлено в 18 опухолевых и одном условно нормльном образце и не выявлено в пяти образцах условно нормальной ткани. Корреляция результатов, полученных двумя методами, высоко достоверна (Rs = 0.937, t = 12.931, v = 23, Р=4.91 х 10 ). Данные МСП и МЧРА совпали также для 14 из 21 образца ВС (9 с метилированием и пять без метилирования, рис. 31, Rs = 0.893, t = 8.642, v = 19 и Р = о 2.34 х 10 ) и 40 из 47 образцов ОЕТ (18 с метилированием, 22 без метилирования, рис. 32, Rs = 0.802, t = 8.994, v = 45 и Р = 1.06 х 10 11). Таким образом, для всех исследованных нами эпителиальных опухолей (RCC, ВС и ОЕТ) установлена достоверная положительная корреляция результатов, полученных методами МСП и МЧРА. Данные о метилировании промоторного района гена RASSF1A противоречивы и варьируют в широких пределах: от 23 до 91% в RCC, от 9 до 62% в ВС и от 10 до 40% в ОЕТ (Pfeifer et al., 2002; Dammann et al., 2003). Результаты нашей работы подтверждают высокую частоту метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях. При этом определенные нами частоты метилирования в ВС и RCC весьма близки или совпадают с наибольшими из значений, установленных ранее: 64%-78% по сравнению с 62% для ВС и 86%-94% против 91% для RCC (Dreijennk et al., 2001, Pfeifer et al., 2002). Однако частота метилирования в ОЕТ, полученная в нами с помощью МСП и МЧРА составила 59 и 73% соответственно, что в 1.5 раза выше известного максимального значения (40%) (Pfeifer et al., 2002). Наблюдаемые различия в частотах метилирования гена RASSFIA могут быть связаны как с чувствительностью использованных методов, так и с этнографическими особенностями западноевропейской, американской и российской (московской) популяций.
