Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА1. Материалы и методы исследований
Система Bac-to-Bac для получния рекомбинантных белков в бакуловирусной системе экспрессии
Получение генетических конструкций, кодирующих разные домены десмоглеина 3 человека
Праймеры
Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами
Трансформация клеток Е. coli штамма DH10 Вас векторами, кодирующими разные фрагменты десмоглеина 3 человека
Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli
Трансфекция клеток насекомых линии Sf9 рекомбинантной вирусной бакмидой
Реамплификация вирусного стока.
Определение титра рекомбинантных вирусов.
Выделение белков с исползованием метода Ni -аффиной хроматографии
Электрофорез в полиакриламидном геле
Иммуноблоттинг
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).
Выделение Ig из сыворотки иммунных кроликов и больных вульгарной
пузырчаткой
Выделение фракции IgG из раствора эуглобулинов.
Анализ участия IgG из сывороток иммунных кроликов в акантолизе кожи.
Антитела, использованные в работе.
Приготовление криосрезов из образцов человеческой кожи.
Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов кожи и клеток линий А431 и
НаСаТ
ГЛАВА 2. Получение в бакуловирусной системе экспрессии рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам десмоглеина человека
2.1. Экспрессия генов Д1, Д2, Д1-2 и Д1-5 доменов ДСГЗ в бакуловирусной системе
2.2. Получение рекомбинантных белков, соответствующих разным доменам ДСГ 3 человека
2.3. Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой
2.4. Идентифиекация В-эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
2.5. Моделирование конформационных эпитопов ДСГЗ, распознаваемых сыворотками больных вульгарной пузырчаткой
ГЛАВА 3. Индукция акантолиза антителами к доменам 1-2 и 3-5 ДСГЗ человека
3.1. Получение кроличьих антител к ДСГЗ
3.2. Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами
3.3. Характеристика клеточных линий кератиноцитов человека.
3.4. Характеристика экспрессии молекул адгезии в неонатальном эпидермисе человека
3.5. Роль антител к различным доменам ДСГЗ в нарушении адгезии между кератиноцитами
3.5.1. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к дистальным доменам Д 1-2 ДСГЗ
3.5.2. Нарушение адгезии между клетками эпидермиса антителами к проксимальным доменам Д 3-5 ДСГЗ
3.6. Связывание антител к ДСГЗ с монослоем кератиноцитов человека линии НаСаТ
ГЛАВА 4. Роль ионов кальция в межклеточной адгезии и ее нарушениях
4.1. Зависимость адгезии в клетках НаСаТ разной степени плотности от ионов кальция
4.1.1. Плотность десмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов
4.1.2. Зависимость адгезии в гиперадгезионных клетках НаСаТ от концентрации ионов кальция
4.1.3. Зависимость адгезии в монослое клеток НаСаТ от концентрации кальция
4.2. Роль синтеза десмосомальных кадгеринов de novo в сохранении гиперадгезии клеток НаСаТ
4.3. Роль температуры в сохранении адгезии клеток НаСаТ.
4.4. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция
4.5. Влияние антител к ДСГЗ на адгезию между клетками НаСаТ при низкой концентрации кальция и комнатной температуре
4.6. Механизм нарушения адгезии между кератиноцитами.
4.7. Различия механизмов действия антител к Д1-2 и ДЗ-5.
4.8. Плотность десмосом на кератиноцитах кожи человека.
4.9. Патогенные антитела к десмоглеину 3 уменьшают число десмосом в супрабазальном слое кератиноцитов кожи
Обсуждение.
Выводы.
Благодарности
Список литературы.
- Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами
- Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой
- Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами
- Плотность десмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов
Введение к работе
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Аутоиммунное заболевание - пузырчатка.
Роль аутоантител в патогенезе пузырчатки.
Внутриклеточные сигнальные пути и их роль при пузырчатке
Изменение качественного и количественного состава десмосом вследствие
действия ВП-IgG
Экспериментальные модели для исследования патогенносте аутоантител
IgG антитела к десмоглеинам - основной класс антител, обнаруживаемых в
сыворотке больных пузырчаткой
Генетические предпосылки, обуславливающие развитие пузырчатки
Структура и функции десмосом
Молекулярная архитектура десмосом
Десмосомальные кадгерины
Адгезионные взаимодействия между десмосомальными кадгеринами
Механизм образования димеров по типу «якорь-карман»
Cis- и trans- димеры - функциональная роль и механизм формирования
Специфичность адгезии, опосредованной кадгеринами
Адгезионные взаимодействия в десмосоме
Динамика формирования десмосом
Роль Са2+ в формировании и функционировании десмоомальных контактов...
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Приготовление компетентных клеток для трансформации рекомбинантными векторами
Эксперименты, проведенные с нормальными кератиноцитами человека и клетками линии DJM-1 показали, что свзязывание аутоантител с ДсгЗ приводит к интернализации и деградации молекул ДсгЗ. Это, в свою очередь, приводит к образованию ДсгЗ-истощенных десмосом (Aoyama et al., 1999a,b). Иммуноблоттинг и иммунофлуоресцентная микроскопия с использованием антител к Дсгі, ДсгЗ, ПГ, десмоплакину 1 и цитокератинам показали, что при инкубировании с ВП-IgG ДсгЗ довольно быстро, в течение 20 минут, исчезает с поверхности мембран (Triton Х-100 растворимая фракция ДсгЗ). В то же время, в цитоскелет-ассоциированной (Triton X-100 нерастворимая) фракции падение количества ДсгЗ не наблюдается (Aoyama et al., 1999b). Однако, при более длительной инкубации с ВП-IgG - от 24 до 30 часов -приводит к заметному падению количества ДсгЗ, но не других белков, в цитоскелет-ассоцировашюй и десмосомальной фракциях. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что ВП-IgG и патогенные моноклональные антитела к ДсгЗ уменьшают количество молекул ДсгЗ в десмосомах. В то время как в имеющихся через 30 часов инкубации межклеточных контактах сохраняются Дсгі, ПГ, десмоплакині, кератиновые филаменты, в них почти отсутствует ДсгЗ. Эти данные подтверждаются иммуноэлектронным микроскопическим исследованием. Кластеры ДсгЗ, находящиеся на поверхности и не включенные в десмосомальный контакт интернализуются в эндосомы пустя 60 минут после начала инкубации с ВП-IgG (Sato et al., 2000). После 30 минут инкубации соотношение мембранных молекул ДсгЗ/ДскЗ, не включенных в состав десмосом резко падает ( в 10 раз) (Shu et al., 2005). Данные об интернализации и деградации внедесмосомального мембранного пула ДсгЗ и образовании ДсгЗ-истощенных десмосом также подтверждаются тем, что ВП-IgG индуцирют интернализацию ДсгЗ в комплексе с плакоглобином, но не с десмоплакином (Calkins et al., 2006). Также показано, что инкубация клеток с ВП-IgG приводит к уменьшению времени полужизни ДсгЗ и нарушает сборку десмосом de novo в местах межклеточных контактов (Cirillo et al., 2006а). Такое же действие на внедесмосомальный пул ДсгЗ оказывают и моноклональные анти-ДсгЗ антитела (Yamamoto et al., 2007). Важно, что подобное действие ВП-IgG наблюдается не только на клеточных линиях in vitro, но и в модели пассивного переноса ВП-IgG в неонатальных мышей (Shu et al., 2007). У таких мышей в течение 24 часов развивается акантолиз, а количество ДсгЗ, связанного с Р катенином снижено на 30% по сравнению с контролем. В той же работе показано, что в образцах кожи пациентов с ВП, также отмечается снижение уровня ДсгЗ/ [3- катенин. Все эти данные говорят о том, что интернализация и деградация ДсгЗ и образование ДсгЗ-истощенных десмосом вносит важнейший вклад в акантолиз. Ослабление адгезии в десмосомальных контактах может усугубляться внутриклеточными процессами.
Интернализованные молекулы ДсгЗ в комплексе с ПГ или без него как раз и могут запускать ряд таких внутриклеточных процессов, что в конечном итоге приводит к акантолизу.
Исходя из вышеизложенного, можно сказать, что в развитии акантолиза, как ключевого события патогенеза пузырчатки, задействованы как прямые, так и непрямые механизмы действия антител. В настоящее время, получены надежные доказательства того, что потеря межклеточной адгезии и акантолиз при ВП и ЛП запускается скорее внутриклеточными сигнальными путями, чем прямым блокированием адгезионных взаимодействий молекул Дсг. Работы (Caldelari et al., 2001; Berkowitz et al., 2005a,b; Waschke et al., 2006), в которых было показано, что ингибирование или полное удаление важных компонентов внутриклеточных сигналов (плакоглобин, р38МАРК, RhoA) сильно влияет на акантолитическую активность аутоантител. Отсутствие нарушения адгезии в кератиноцитах, инкубируемых при низкой температуре в присутствии аутоантител, показывает, что прямого нарушения адгезионных взаимодействий между молекулами Дсг не достаточно для развития акантолиза (Calkins et al., 2006). Если бы такое ингибирование было бы первичной причиной акантолиза, то трудно объяснить почему акантолиз может быть заблокирован при модификации внутриклеточных сигнальных путей или низкой температурой. Возможно, что блокирование аутоантителами Дсг взаимодействий вносит дополнительный вклад во внутриклеточные сигнальные процессы (Tsunoda et al., 2003; Sharma et al., 2007). Однако в ряде работ показано, что ЛП-IgG способны запускать внутриклеточные процессы без существенного влияния на взаимодействия между молекулами Дсг (Waschke et al., 2005; Heupel et al., 2007), что прямое ингибирование взаимодействий между молекулами не существенно для нарушения процессов, контролирующих межклеточную адгезию. Интересно предположить, что при ВП и ЛП разные механизмы играют разную роль, так как клинические проявления при ВП более тяжелые, чем при ЛП. Действительно, некоторые механизмы потери межклеточной адгезии обнаружены только для ВП. Например, антитела, вызывающие акантолиз при ВП, напрямую ингибируют взаимодействия между молекулами ДсгЗ, но при ЛП такого действия антител пока не обнаружено (Waschke et al., 2005; Heupel et al., 2007). Во-вторых, при ВП убедительно показана интернализация и деградация ДсгЗ, но при ЛП таких данных для Дсгі пока не имеется (Yamamoto et al., 2007). Следовательно, прямое действие антител при ВП может играть существенно большую роль, чем при ЛП. В целом ВП является более изученным типом пузырчатки, чем ЛП, поэтому ряд фактов, полученных только на основе сывороток или ВП- lgG, могут оказаться важными и для ЛП. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы оценить вклад в акантолиз таких факторов, как внеклеточный протеолиз Дсг и Дек, изменения внеклеточной концентрации ионов Са2+, полиморфизм генов десмосомальньтх кадгеринов, и структурные исследования самих молекул Дсг и Дек.
Распознавание различных доменов ДСГЗ сыворотками больных пузырчаткой
Несмотря на большой интерес и соответствующее число работ в этой области, механизм установления, поддержания и регулирования адгезии в десмосоме во многих деталях остается неясным. К настоящему времени известно, что в десмосомах, в отличие от других адгезионных контактов, принимают участие только два типа белков - десмоглеины и десмоколлины. Механизм адгезионных взаимодействий этих белков является неясным и противоречивым. Проблема усложняется тем, что и десмоглеины, и десмоколлины представлены в виде нескольких генетических изоформ, для каждой из которых имеется отдельный ген и есть различия в аминокислотной последовательности. Гораздо более изученным является адгезионные контакты, в которых принимают участие классические кадгерины (Е-, N-, С-, Р-кадгерины). В частности, имеется много данных кристаллографического анализа и предложены способы образования адгезионных структур для этих белков. С учетом большой степени гомологии (до 60%) между классическими и десмосомальными кадгеринами, а также одинаковым строением внеклеточной части, вполне вероятно, что образование адгезионных структур с участием десмоглеинов и десмоколлинов происходит по тем же механизмам.
Первые работы по кристаллизации различных фрагментов классических кадгеринов были выполнены в 1995-1996. Shapiro L. с коллегами получили кристаллы N-концсвого домена мышиного N-кадгерина, продуцированного в виде слитого белка с глутатион-8-трансферазой в Е.соИ. У этого белка были два дополнительных аминокислотных остатка на N-конце - Glnl-Ser2, а также использовались ионы Yb3+ в качестве заменителей ионов Са2+. Участок связывания ионов Са2+ был неполным. В 1996 году Nagar В. с коллегами получили кристаллы двух дистальных доменов мышиного Е-кадгерина, продуцированного в Е.соИ. По результатам этих исследований было окончательно установлено топологическое строение внеклеточной части классических кадгеринов, которое оказалась общим для всех белков этого семейства. Одновременно, были сделаны попытки определить участки и аминокислоты, вовлеченные в адгезионные взаимодействия. Однако, данные для двух белков, несмотря на общность строения, оказались весьма отличающимися. Тем не менее, одна из предложенных Shapiro L. с коллегами модель для описания взаимодействия между двумя N-концевыми доменами N-кадгерина, получившая название «якорь-карман», получила подтверждение в других работах (Haussinger et al., 2002; Boggon et al., 2002). В настоящее время этот механизм считается одним из основных при образовании адгезионных структур между молекулами кадгеринов. Эта модель заключается в следующем. У большого числа белков, входящих в семейство кадгеринов, в том числе у десмоглеинов и десмоколлинов, имеется очень консервативный остаток Тгр2 во втором положении (Nollet at al., 2000). Замена или удаление этого триптофана приводит к полной потере адгезии между клетками (Chitaev and Troyanovsky, 1998; Tamura et al., 1998; Laur et al., 2002). Образование димера происходит при взаимном обмене N-концевой части (1-7 ак) двух молекул и встраивании остатков триптофана в гидрофобный карман первого домена соседней молекулы. Интересно, что такой обмен наблюдается во многих структурах и разных исследованиях (Haussinger et al., 2002; Boggon et al., 2002). При этом возможно образование димеров как в cis положении (in vivo соответствует ситуации, когда димер образуют соседние молекулы на поверхности одной клетки, неадгезионные взаимодействия), так и в trans положении (in vivo соответствует ситуации, когда димер образуют молекулы, отходящие от соседних клеток, образуется адгезионная единица). По данным Shapiro et al., 1995, размер первого домена составляют 45x25x25 А. Гидрофобный «карман», куда встраивается индольная группа Тгр2, образован алифатическими группами 11е92, Пе24, А1а78, А1а80, ТугЗб, Glu89. Одна из последних работ в этой области (Parisini et al., 2007) позволила уточнить механизм образования димера. Так, при сравнении структуры двух доменов Е-кадгерина человека с ранее полученными структурами N-кадгерина и С-кадгерина было показано, что имеются ряд консервативных взаимодействий между консервативными аминокислотами, которые и обеспечивают образование димера путем обмена и заякоривания N-концевой части двух молекул.
Идентификация эпитопа ДСГЗ, распознаваемого коммерческими моноклональными антителами
Сборка десмосомального контакта довольно сложный процесс. Ему предшествует формирование адгезионных контактов, опосредованных классическими кадгеринами. Блокирование образования адгезионных контактов антителами к Е-кадегерину предотвращало формирование десмосом (Gumbiner et al., 1998). Было также показано, что существует перекрестная связь между образованием адгезионных контактов и формированием десмосом (Lewis et al., 1997). Важную роль играют также 0-4 ионы Са , которые сильно влияют на образование как адгезионных, так и десмосомальных контактов. При концентрации в среде ионов Са 0,1 мМ, человеческие и мышиные кератиноциты растут без дифференцировки и формирования десмосом. Повышение концентрации выше 0,1 мМ индуцирует образование адгезионных контактов (в течение 5 минут), а затем и десмосом в течение 2 часов (Hennings and Holbrook, 1983). Таким образом, при переносе клеток из среды с низкой ( 0,1 мМ) концентрацией кальция в среду с высокой концентрацией кальция ( 0,5 мМ) можно наблюдать последовательные стадии формирования десмосом. Согласно данным группы британских ученых (Burdett and Sullivan, 2002), изучавшим формирование десмосом в клетках MDCK при резком повышении концентрации ионов кальция (т.н. «кальциевый сдвиг»), формирование десмосом происходит в два этапа. На первом этапе (30 мин после сдвига) от сети аппарата Гольджи к мембране направляются пузырьки диаметром до 60 нм, в которых содержится преимущественно десмоколлин 2, а десмоглеин и Е-кадгерин присутствуют в меньшем количестве. Транспорт пузырьков происходит во всех направлениях одинаково. Вероятно, что в везикулах, при повышении концентрации ионов Са2+, происходит протеолитический процсссипг и конформационные перестройки в экстраклеточных доменах кадгеринов. При слиянии этих везикул с мембраной, вероятно, образуются протяженные участки из способных к адгезии молекул. Если эту способность к адгезии заблокировать, например, антителами к Е кадгерину или Дск2 (Gumbiner et al., 1988; Cowin et al., 1984), то формирование десмосом будет блокировано. Поэтому, Е-кадгерин, а также, очевидно, Дск2 играют важную роль на ранних стадиях межклеточной адгезии. На возможное сходство в функциях этих двух белков указывает и сходство в аминокислотных последовательностях десмоколлинов типа «а» и классических кадгеринов (Buxton. 1992; Collins, 1996). И, напротив, десмоглеины сильнее отличаются по последовательности от классических кадгеринов и принимают участие в формировании десмосом на более поздних стадиях, что все вместе говорит о различных ролях, которые играют Дек и Дсг в формировании десмосом. На потенциальную важность Дек на ранних стадиях образования десмосомального контакта указывают эксперименты, выполненные на клетках линии НаСаТ с ДскЗ и ДсгЗ. Десмоколлин 3, имеющий делецию нескольких экстраклеточных доменов (ДскЗАЭД), нарушал процесс образования, как плотных контактов, так и десмосом. В то же время, экспрессия делетированного по N- концу ДсгЗ влияла только на образование десмосом. Также было показано, что ДскЗАЭД взаимодействует как с (3 катенином, так и с плакоглобином в НаСаТ (Hanakawa et al., 2000).
На втором этапе формирования межклеточных контактов (60 мин после сдвига) наблюдается транспорт больших и более сложноорганизованных пузырьков до 200 нм в диаметре. Они содержат относительно большее количество десмоглеина, Е кадгерина, плакоглобина и меньше десмоколлина. Эти пузырьки сливаются с латеральной мембраной и, очевидно, образуют участки сборки будущих десмосом. Места слияния пузырьков с мембраной могут определяться уже находящимися на поверхности Дск2, ассоциированного с Р-катенином. Присутствуют также простые пузырьки, содержащие десмоглеин и плакоглобин. Однако их происхождение может быть связано с интернализацией и эндосомальным транспортом. Последующая кластеризация молекул Дск2 и Дсг, ассоциированногос плакоглобином, приводит к формированию десмосомального контакта. На поверхности клеточной мембраны в это время (90 мин) присутствуют Е-кадгсрин, связанный с Р-катенином. Однако почти не отмечается колокализация везикул, содержащих Дек 2 или плакоглобин с р катенином, который также присутствует в 100 нм везикулах в цитоплазме. Спустя 4 часа после начала транспорта белков из транс-Гольджи сети к мембране наблюдается колокализация Дек 2 и электронно-плотных бляшек и образование морфологически различимых десмосом. Таким образом, сборка десмосом происходит за счет постоянного притока синтезированных de novo кадгеринов и встраивания их в десмосомальный контакт, а не за счет предварительной сборки полудесмосом в цитоплазме. Ранее такие полудесмосомы были обнаружены в клетках, инкубируемых при низкой концентрации кальция (Demlehner et al., 1995). Ряд экспериментов, в которых использовались слитые с GFP белки, входящие в состав десмосом, позволили наблюдать динамику уже сформированных десмосомальных контактов. Наблюдение за flcr2-GFP или ПГ-GFP показало, что десмосомы изменяют свое местоположение на поверхности клетки. Десмосомальные контакты постоянно обновляются за счет притока и слияния в более крупные структуры небольших «незрелых» десмосомоподобных образований. Наблюдалось также разделение одной большой структуры на две и более (Gloushankova et al., 2003) Подобная динамика означает, что происходит постоянная перестройка, перераспределение и изменение числа и размера десмосом, что, очевидно, может являться механизмом, регулирующим стабильность и силу десмосомальных контактов, в том числе локально. Другой аспект динамики десмосомальных контактов касается скорости обмена десмосомальных белков. Наблюдения за Дск2 GFP химерным белком в клетках линий MDCK и PLC показали, что, несмотря на большую стабильность во времени отдельно взятых десмосом (несколько часов), в них постоянно и очень интенсивно происходит обмен компонентов. Появление новых молекул Дск2а-СРР в предварительно засвеченном участке мембраны с десмосомами происходит в течение 30 минут, что позволяет предположить, что время жизни отдельных молекул в составе десмосомального комплекса немногим отличается от получаса (Windoffer et al., 2002). Это также может быть одним из механизмов, локально регулирующих силу десмосомального контакта без его полного разрушения. Возможно, что в регуляции обмена между разными пулами (десмосомального и синтезированного de novo) белков различные внутриклеточные регуляторные механизмы, в том числе концентрация ионов Са24
Плотность десмосом на мембранах гиперадгезивных и адгезивных кератиноцитов
При формировании димеров между кадгеринами одну из основных ролей играет кальций. Показано, что в отсутствии внеклеточного кальция формируются только цис-димеры и полностью теряется способность клеток формировать траис димеры (Mattey et al., 1986а; Chitaev et al., 1998; Windoffer et al., 2002). С другой стороны, известно явление гиперадгезии между кератиноцитами, когда зависимость от кальция становится значительно меньше, а в предельном случае даже полное удаление кальция не приводит к полному исчезновению десмосом, хотя их количество и снижается (Mattey et al., 1986b). Это явление показано как для клеточных линий кератиноцитов, так и для эпидермиса кожи (Wallis et al., 2000; Garrod et al., 2005; Kimura et al., 2007). Кератиноциты линии HaCaT переходят в состояние гиперадгезии постепенно и на 6 сутки инкубации все клегки находятся в таком состоянии (Kimura et al., 2007). Добавление антител к ДСГЗ частично нарушает состояние адгезии гиперадгезивного слоя, увеличивая его «хрупкость» (Рис.3.10).
Согласно опубликованным данным состояние стабильности гиперадгезивного монослоя кератиноцитов можно нарушить при добавлении активаторов серин/треонин киназы С (Wallis et al., 2000), при механическом повреждении эпителия (ранении кожи, пипетировании или механическом покачивании пластов клеток). И, наоборот, добавление ингибиторов серин/треонинкиназы С переводит десмосомы в состояние гиперадгезии. Интересно, что ингибирование таких ферментов, как тирозинкиназа, фосфолипаза С, кальмодулин и серин/треониы киназа С подавляет акантолиз in vivo в неонатальных мышах (Sanchez-Carpintero, 2004). При этом гуморальные сигналы такие, как факторы, продуцируемые раневыми клетками, цитокины, ростовые факторы, оказались не способны нарушить состояние гиперадгезии. Можно предположить, что связывание аутоантител с ДСГЗ вызывает трансдукцпю сигнала внутрь клеток эпидермиса кожи у больных пузырчаткой, но не в культурах клеток кератиноцитов. Различия между кератиноцитами многослойного эпителия эпидермиса и монослоя культивируемых клеток не вполне ясны. Поскольку ключевым звеном является кальциті, то целью данной главы является изучение влияния кальция на гиперадгезивный монослой клеток кератиноцитов человека НаСаТ и роли антител к ДСГЗ в нарушении этой адгезии.
Показано, что клетки конфлюэнтного слоя кератиноцитов могут находиться в различных состояниях адгезии в зависимости от длительности инкубирования. При инкубации уже имеющегося монослоя в течение 6 дней количество кератиноцитов увеличивается мало (до 10%), но устойчивость к удалению кальция увеличивается пропорционально времени инкубации (Kimura et al., 2007). Такой 6-ти дневный монослой называется гиперадгезионным. Он сохраняет адгезию даже при полном удалении кальция. Механизмы гиперадгезии, а точнее независимости адгезионных взаимодействий между десмосомальными кадгеринами от ионов кальция не известны.
Можно предположить, что в основе механизма гиперадгезии лежат два интерферирующих явления: контактное торможение пролиферации и увеличение плотности десмосом на клетках, находящихся в состоянии контактного торможения. Для проверки этой гипотезы получали монослойную и гиперадгезивную культуры НаСаТ для чего клетки по достижению монослоя инкубировали в течение суток показал, что, действительно, на клетках гиперадгезивной культуры количество десмосом значительно возрастало (Рис.4.1). Соответственно, можно предположить, что при определенной плотности десмосом создается барьер, препятствующий удалению ионов кальция из десмосом. Полученные данные показывают, что формирование десмосом является постоянным процессом в кератиноцитах, что связано с дифференцировкой клеток и последующим процессом их грануляции для создания плотного барьера кожи.
Одна из гипотез, объясняющих возникновение гиперадгезионнго состояния десмосом, предложена Дэвидом Герродом и коллегами (David Garrod and Tomomi E. Kimura, 2008). При формировании десмосом, молекулы кадгеринов со временем образуют плотную упаковку в межклеточном пространстве и ионы кальция в такой упаковке экранированы от внешней среды и не удаляются даже хелатирующими соединениями. Плотная упаковка десмосомальных кадгеринов стабилизирует весь комплекс, препятствуя нарушению контакта даже при снижении концентрации ионов кальция во внеклеточной среде. Кроме десмосом клетки эпидермиса соединяются также с помощью кадгеринов, формирующих небольшие адгезионные пояски между клетками. Адгезия между кадгеринами также является кальций-зависимым процессом. Известно, что без первичного адгезивного контакта между кадгеринами нет формирования десмосом (Gumbiner et al., 1988; Burdett et al., 2002). Ионы кальция в составе кадгеринов в значительной большей степени открыты для окружающей среды. Снижение концентрации ионов кальция в среде приводит к потере адгезии опосредованной классическими кадгеринами, вне зависимости от времени инкубации клеток. Показано, что при концентрации кальция 0,1 мМ классические кадгерины полностью теряют способность к адгезионным взаимодействиям (Klingelhofer et al., 2002). Для определения предельных значений концентрации кальция, при которой теряется состояние гиперадгезии в десмосомах, мы проинкубировали гиперадгезивный монослой клеток НаСаТ в фосфатном буфере с понижением концентрации кальция от 1 мМ до 0,001 мМ, что на 2 порядка меньше предельной концентрации для классических кадгеринов. Инкубация в течение 4 часов при 37С не вызывала значительного нарушения адгезии (Рис.4.2).
