Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1. Прионы высших эукариот 8
Прионы - инфекционные агенты нового типа 8
Прионная гипотеза Прузинера 10
Доказательства прионной гипотезы 11
Межвидовая передача прионной инфекции 13
Штаммы прионов 14
Механизмы прионного перехода 15
Структура и функция белка РгР 18
2. Прионы низших эукариот 23
Введение 23
Прион [URE3] S. cerevisiae 24
Прион [Het-s] Podospora anserina 27
Прион [PSt] S. cerevisiae 29
Структура и функция белка Sup3 5 29
Доказательства прионных свойств Sup35 32
Возникновение [PSt] de novo, прион [PIN*] 35
Роль шаперонов в возникновении и наследовании прионов у дрожжей 37
Межвидовая передача прионных свойств Sup35 и механизмы
изгнания [PSt] 43
Варианты [PSt] 47
Структура амилоидных фибрилл 51
3. Распространённость прионов в природе 55
Перспективы лечения прионных заболеваний 57
Биологическое значение прионов 59
Заключение. Постановка задачи исследования 62
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64
Среды, штаммы, условия культивирования 64
Плазмиды 65
Генетические методы 66
Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 70
Белковый гель-электрофорез, иммуноблоттинг 71
РЕЗУЛЬТАТЫ 73
1. Совместная экспрессия полноразмерного белка Sup35 и белков Sup35 с
укороченными областями NR прионного домена приводит к вариант-
специфичным эффектам по отношению к [Р57*] 75
Введение аллелей гена SUP35, кодирующих белки с укороченными областями NR прионного домена, в штаммы [PSf], несущие аллель SUP35 дикого типа, приводит к изменению супрессорного фенотипа и потере [PSt] 75
Эффективность встраивания мутантных белков Sup35 в прионные полимеры, образованные полноразмерным Sup35, зависит от длины области NR прионного домена и от варианта [РБҐ] 83
1.2.1.Разделение агрегированной и растворимой форм белка Sup35 с помощью
ультрацентрифугирования 83
1.2.2.Электрофоретический метод разделения полимерной и мономерной форм белка
Sup35 84
1.2.3.Анализ включения мутантных белков Sup35 в прионные полимеры 85
1.3. Встраивание мутантных белков Sup35 в прионные полимеры полноразмерного
белка Sup35 приводит к увеличению их размера 88
4 2. Двух аминокислотных повторов области NR PrD Sup35 достаточно для
поддержания [РЯҐ] 91
2.1. Эффективность передачи прионного состояния от полноразмерного белка
Sup35 к мутантному варианту Sup35 зависит от длины области NR прионного
домена белка и от варианта [PSt] 91
2.2. Замена полноразмерного белка Sup35 мутантными вариантами Sup35
приводит к ослаблению супрессорного фенотипа [PSf] и уменьшению его
стабильности 94
3. «Сильный» вариант [PSt] не поддерживается белком Sup35 с четырьмя
аминокислотными повторами в прионном домене 99
4. Термостабильность прионных полимеров белка Sup35 различается у
вариантов [PSt] 100
ДИСКУССИЯ 104
Минимальная длина прионного домена Sup35, необходимая для поддержания [PSI*] 104
Аминокислотные повторы области NR прионного домена белка Sup35 формируют детерминанты узнавания шапероном Hspl04... 106
Области NR и NQ белка Sup35 переходят в прионную форму независимо друг от друга... 110
Сворачивание прионного домена белка Sup35 у «сильных» и «слабых» вариантов [PSt] 114
5. Заключение 115
ВЫВОДЫ 118
ПРИЛОЖЕНИЕ 119
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120
БЛАГОДАРНОСТИ 143
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
а. к. - аминокислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
об/мин - обороты в минуту
РгР - прионный белок;
РгРс - нормальная форма прионного белка
PrPSc - инфекционная форма прионного белка
PrPres - инфекционная форма прионного белка, образуемая in vitro
Prnp - ген, кодирующий РгР
[PSt] - цитоплазматический детерминант, соответствующий прионному состоянию
белка Sup35
PrD - прионный домен
ГХГ - гидрохлорид гуанидина
DTT - дитиотреитол
EDTA - этидендиаминтетрауксусная кислота
SDS - додецил сульфат натрия
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
ОРС - открытая рамка считывания
SDS-PAGE - электорофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS
SDD-AGE - полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле в присутствии SDS
в/о - вес/объём
Введение к работе
Термин «прион» появился при исследовании ряда нейродегенеративных заболеваний животных и человека, таких как скрэйпи овец, бычья губчатая энцефалопатия и болезнь Крейцфельда-Якоба человека. Несмотря на то, что эти болезни были известны уже довольно давно, их природа оставалась загадкой вплоть до последнего времени. В частности, долгое время было непонятно, каков механизм возникновения этих нейродегенеративных заболеваний. Этиология этих заболеваний весьма разнообразна. Эти болезни могут наследоваться, возникать инфекционным путём а также спорадически. Такое разнообразие путей возникновения а также очень длительный инкубационный период, характерный для инфекционных форм этих заболеваний, долгое время не давали возможность исследователям выяснить, что же является инициирующим фактором таких болезней. Изначально предполагали, что эти нейродегенеративные болезни вызываются вирусом, однако впоследствии оказалось, что инфекционный агент не содержит ДНК. В 1967 году была выказана «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент представлял собой изменённую форму одного из клеточных белков, поддерживающуюся за счёт аутокаталитического механизма (Griffith, 1967). Позднее этот агент был назван «прионом» (Prusiner, 1982). Его необычные свойства обусловлены способностью белка находиться в особом конформационном состоянии, которое может передаваться другим молекулам того же типа путём белок-белковых взаимодействий.
В начале девяностых годов прошлого века прионы были обнаружены и у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В отличие от млекопитающих у дрожжей феномен прионов не связан с какой-либо патологией и имеет, скорее всего, адаптивное значение. Переход белков дрожжей в прионную форму определяет наследование фенотипов, связанных с агрегацией и функциональной инактивацией этих белков. Таким образом, прионные свойства белков дрожжей обуславливают особый механизм
7 эпигенетического наследования признаков, а также регуляцию экспрессии генов на посттрансляционном уровне.
В настоящее время у млекопитающих известен один прионный белок, в то время как у дрожжей S. cerevisiae найдено три таких белка. Ещё один прионный белок выявлен у гриба Podospora anserina. Однако, результаты анализа геномов разных организмов, направленного на поиск последовательностей, гомологичных таковым уже известных прионных белков, позволяют предполагать, что прионы распространены в природе и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке. Возможно, феномен прионов имеет гораздо большее значение, чем известно сейчас.
Одним из фундаментальных и наименее изученных свойств прионов является существование их наследуемых вариантов (штаммов). Это свойство проявляется как у прионов млекопитающих, так и у прионов дрожжей. Белок, обладающий прионными свойствами, способен не только к конформационному переходу из неприонного состояния в прионное. По всей видимости, он способен приобретать множество прионных конформаций, которые и определяют существование вариантов приона. Данная работа посвящена исследованию молекулярных основ возникновения разных вариантов прионного состояния белка Sup35 дрожжей S. cerevisiae. Более конкретно, работа представляет собой попытку изучения роли аминокислотных повторов белка Sup35 в существовании вариантов приона, образованного этим белком.
