Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1. Приоиы млекопитающих 7
1.1. История открытия прионного белка PrPSc 7
1.2. Доказательства прионных свойств белка PrPlt: 8
1.3. Свойства белка РгРс и его прионной изоформы PrP с 9
1.4. Молекулярные механизмы прионного перехода 10
1.5. Существование межвидового барьера. Штаммы приоиов 11
2. Амилоиды и амилоидозы 13
2.1. Амилоидозы человека 13
2.2. Структура амилоидных фибрилл 16
2.3. Любой ли белок может стать амилоидом 17
2.4. Чем обусловлено различие в иифекционности прионов и амилоидов 18
3. Прионы низших эукариот 20
3.1. Цитоплазматический детерминант [HET-s] гриба Podospora anserina 21
3.2. Нехромосомный детерминант [URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae 22
3.3. Детерминант [Р5Ґ]: генетические проявления и молекулярная основа 23
3.3.1. Доказательства прионных свойств Sup35. Изучение прионного перехода белка Sup35 in vitro 24
3.3.2. Структура и функции белка Sup35 26
3.3.3. Приониый домен Sup35: роль аминокислотного состава и олигопептидных повторов в определении прионных свойств 27
3.3.4. Двухуровневая структура прионных агрегатов Sup35 28
3.4. Нехромосомный детерминант [РЛ^Ґ] дрожжей Saccharomyces cerevisiae 29
3.5. Роль inanepoi-raHspl04 в поддержании [PSf] 31
3.6. Варианты [PSf] 33
3.7. Феномен мультикопийной супрессии 34
4. Исследование болезни Хантингтона в дрожжевой системе 35
4.1. Факторы, влияющие на агрегацию полиглутаминовых белков 36
4.1.1. Зависимость агрегации от экспрессии и количества остатков глутамина 36
4.1.2. Взаимодействие шаперонов с полиглутаминовыми белками 36
4.1.3. Способность прионных и амилоидных белков инициировать полимеризацию гетерологичных белков 38
5. Биологическое значение и распространенность в природе прионов и амилоидов 44
6. Заключение. Постановка задачи исследования 48
2 Материалы и методы 50
1. Среды, штаммы, условия культивирования 50
2. Генетические методы. Трансформация микроорганизмов 54
3. Конструирование плазмид и другие генно-инжеиериые манипуляции 57
4. Определение эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов в клетках дрожжей бб
5. Флуоресцентная микроскопия 67
6. Экспрессия в Е. соїі и аффинная очистка белка -Rnql-Hise 68
7. Получение и очистка антител к белку Rnql 69
8. Приготовление и фракционирование дрожжевых лизатов 70
9. Белковый гель-электрофорез, иммуиоблоттинг 71
10. Прионный переход белка Sup35 in vitro 73
11. Выделение амилоидных полимеров белка Sup35 73
3 Результаты 75
1. Изучение амилоидного состояния белка SUP35 75
1.1. Большая часть белка Sup35 при его сверхпродукции в клетках [psf^PIN*] находится в амилоидной форме 75
1.2. Полимеры белка Sup35 содержат Rnql 84
1.3. Агрегация белка Sup3 5 приводит к супрессии нонсенс-мутаций 87
2. Изучение прионных и амилоидных свойств гибридных полиглутаминовых белков 92
2.1. Полимеризация гибридного белка Q66-Sup35MC ненаследуема 92
2.2. Полиглутаминовые и полиглутамин/тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуются in vivo 96
2.3. Влияние inanepOHaHspl04 на полимеризацию гюлиглутаминовых белков 102
2.4. Способность белков polyQ к полимеризации в клетках ArnqJ зависит от длины полиглутаминовой последовательности 105
2.5. Кополимеризация полиглутамин-содержащих белков с другими глутамин-богатыми белками 111
4 Обсуждение 116
1. Свойства неприонных амилоидов белка Sup35 116
2. Белки polyQ и polyQY эффективно образуют полимеры in vivo 119
3. Полимеры белков polyQ фрагментируются и могут быть прионами 122
4. Добавление тирозиновых остатков улучшает фрагментацию полиглутаминовых полимеров 124
5. Фрагментация полимеров polyQY в отсутствие Hspl04 125
6. Взаимное ускорение полимеризации между различными амилоидогенными белками 127
7. Межвидовой барьер в передаче прионного состояния 130
8. Прионы и неприогшые амилоиды: два типа наследования (поддержания) 131
Заключение 134
Выводы 137
- Доказательства прионных свойств белка PrPlt:
- Прионы низших эукариот
- Конструирование плазмид и другие генно-инжеиериые манипуляции
- Полиглутаминовые и полиглутамин/тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуются in vivo
Введение к работе
Более 20 болезней человека связаны с аномалиями в формировании пространственной структуры белков, что приводит к образованию амилоидов, представляющих собой агрегаты фибриллярной структуры, состоящие из растворимых в норме клеточных белков. Такие заболевания называют амилоидными или амилоидозами. Из амилоидозов наиболее известны болезни Альцгеймера и Паркинсона, веевма распространенные среди пожилого населения развитых стран. Значительное количество данных указывает на то, что к амилоидозам относятся и прионные заболевания. В отличие от прочих амилоидозов, прионные заболевания инфекциоииы. Уникалвность прионов состоит в том, что их инфекционность связана не с ДНК или РНК, а с белком. К прионным заболеваниям относят болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Герстманна-Штрауселера-Шейнкера, куру, а также фатальную семейную бессонницу человека, скрейпи у овец и коз, бычью губчатую энцефалопатию (коровье бешенство), и другие энцефалопатии, встречающиеся у кошек, оленей и других животных. Все эти прионные болезни связаны с единственным белком, называемым РгР.
Помимо животных и человека, белки с прионными свойствами были обнаружены у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. У дрожжей «инфекционность» этих прионных белков проявляется как не-Менделевское наследование соответствующих фенотипов. Прионное состояние белка Sup35 дрожжей (фактор терминации трансляции eRP3) приводит к трансляционной супрессии нонсенс-код он ов. Этот фенотип, называемый [PSI ], стабильно наследуется и передается всем потомкам при скрещивании или цитодукции (обмен клеток цитоплазмой). [PSf] может спонтанно возникать с низкой частотой и может теряться при росте на определенных средах,
Можно полагать, что феномен прионов и амилоидов гораздо шире распространен в природе, чем это известно на сегодняшний день, и может быть использован в биологически значимых механизмах. Наличие белков с прионными свойствами показано не только для дрожжей S. cerevisiae, но и для Schizosaccharomyces pombe, а также гриба Podospora anserina, а также предположительно для улитки Aplysia californica. Для трансляционного регулятора СРЕВ, который играет ключевую роль в механизмах, связанных с долговременной памятью, были показаны прионоподобные свойства в дрожжах. Более того, у млекопитающих найдены амилоидные белки, выполняющие в норме важные физиологические функции. Так, было показано, что амилоидные полимеры белка Pmell7 являются матрицей для полимеризации предшественника меланина. Предшественник меланина токсичен, в то время как его полимеры защищают клетки от различных вредный воздействий, в частности, ультрафиолета и окислительного стресса. Множество белков, структурно сходных с уже известными прионными белками у дрожжей, было выявлено у различных организмов при поиске в банках генов. Это может говорить о том, что белки, способные формировать амилоидную структуру, широко распространены и могут играть важную роль в регуляции физиологических процессов в клетке.
Вопросы о том, чем отличаются прионы и амилоиды, и действительно ли они имеют принципиально сходную основу, достаточно значимы для данной темы. Это важно и для понимания особенностей прионных и амилоидных заболеваний, и для понимания свойств полезных механизмов связанных с амилоидами, и для выявления новых таких механизмов.
Представленная здесь работа началась с наблюдения полимеров белка Sup35, по свойствам более близких к неинфекционным прионам, чем к амилоидам. Это показало принципиальное сходство прионов и амилоидов и дало удобную модель для
изучения их отличий. В работу также вошел систематический анализ зависимости прионных и амилоидных свойств от первичной последовательности белка, выполненный на искусственных белках, содержащих полиглутаминовые фрагменты.
Доказательства прионных свойств белка PrPlt:
В 1982 году Стэнли Прузинер сформулировал прионную концепцию, состоящую в том, что прионная форма белка PrPSc является патогенным агентом и стимулирует конформационный переход нормальной формы РгРс (С, cellular ) в PrPSc (Sc, scrapie), что и определяет его инфекционность. Спорадические формы приоыных заболеваний обусловлены спонтанным переходом РгР в РгР с, приобретенные формы вызываются попаданием в организм РгР с извне, наследственные формы определяются мутациями в гене Ргпр. К настоящему моменты накоплены экспериментальные данные, подтверждающие прионные свойства белка PrPSc. Так, было показано, что трансгенные мыши, гомозиготные по делеции гена Ргпр, не развивали скрейпи при введении им гомогената мозга зараженных мышей (Bneler et а/., 1992). Это согласуется с тем, что появление патологической формы РгР с происходит путем передачи этой конформации на молекулы нормальной формы РгРс, а в отсутствие гена Ргпр заражения быть не может. В той же работе было показано, что трансгенные мыши с геном Ргпр хомяка становятся чувствительными к заражению хомячьим агентом скрейпи. Окончательным доказательством прионных свойств РгР вляется тот факт, что рекомбииантиый мышиный РгР, экспрессированный в Е. coli, вызывал скрейпи у экспериментальных животных при его введении (Legnamc et а!., 2004). 1.3. Свойства белка РгРс и его приоппой шоформы РгРНс Прионный белок РгР человека является мембранно-связанным белком, экспрессируется в основном в клетках нервной системы и локализуется в синапсах (Simons and Ehehalt, 2002). В форме РгРс его С-концевой домен структурирован и содержит несколько a-спцральных участков, N-концевая часть белка неструктурирована и содержит несколько стоящих подряд аминокислотных повторов {PHGGGWGQ), которые могут принимать участие в образовании прионной формы белка (Hetz et al., 2003). Прионная изоформа белка РгР отличается от нормальной вторичной структурой. Так, форма РгРс обогащена а-спиральиыми участками (40% а-спиралей) и почти не содержит р-слои, в то время как форма РгР с имеет в основном J3- складчатую структуру (50% [3-слоев и 20% а-спиралей) (Ран etal, 1993). Характерной особенностью агрегатов РгР является наличие протеазоустойчивого "ядра": при обработке препаратов протеиназой К белок, имеющий в норме массу 33-35 кДа, превращался в белок с молекулярной массой 27-30 кДа (Prusiner et al, 1982). PrPSc отличается от РгРс плохой растворимостью в детергентах и склонностью к агрегации (Prusiner et al, 1983; Oesch et al, 1985). Функция белка РгР до сих пор неизвестна.
Трансгегшые мыши, содержащие делецию гена Ртр в гомозиготе, не проявляют видимой нейропатологии (Bueler et al, 1992). Есть данные в пользу того, что гибель нейронов происходит путем апоптоза, а белок РгРс обладает антианоптотическим действием и, следовательно, выполняет нейропротекторную функцию. Рассматриваются также другие предполагаемые роли РгР - это его участие в метаболизме ионов меди, предположительная супероксид-дисмутазная активность (Brown et al, 1999), а также участие в обновлении стволовых кроветворных клеток (Zhang et al, 2006). 1.4. Молекулярные механизмы прионного перехода Существуют две основные модели, которые описывают превращение клеточного белка в его прионную изоформу. «Гетеродимерная» модель (рис.1) говорит о том, что прионное состояние является свойством мономера белка, и при взаимодействии с таким мономером нормальной изоформы РгР происходит ее конформационный переход в форму PrPSi: (Prusiner et al, 1991; Cohen et al, 1994). Такой димер диссоциирует и две освободившиеся молекулы PrPSc могут снова участвовать в инициации конформационных переходов. Агрегация прионной формы белка рассматривается как вторичное явление, не связанное с конформационной перестройкой. Межвидовой барьер на пути передачи прионной инфекции состоит в том, что прионные заболевания передаются между особями одного вида или близкородственных видов (Pattison, 1965). Так, мыши заболевали только при введении им гомогената мозга больных мышей, но не хомячков. Скрейпи может передаваться от овец к козам, но не к шимпанзе. Болезнь Крейцфельда-Якоба передается от человека человеку, и от человека шимпанзе. Межвидовой барьер не является абсолютным, в некоторых случаях передача прионной инфекции между различными видами животных все-таки происходит, хотя и с пониженной эффективностью: увеличивается инкубационный период заболевания, заболевают не все зараженные экспериментальные животные (Clarke et al, 2001). Известны факты заражения людей, употреблявших в пищу мясо больных коров после эпидемии "коровьего бешенства": были обнаружены случаи т.н. нового варианта болезни Крейцфельда-Якоба, причем заболевание имело патоморфологическую картину, характерную для споыгиформной энцефалопатии крупного рогатого скота (Aguzzi, 1996). Существование межвидовых барьеров может быть связано с различиями первичных структур РгР, что приводит к различию их коиформаций (Collinge et al, 1995). Данная работа позволила сформулировать дополнительные причины, приводящие к барьерам передачи прионной инфекции. ,, Одно из самых удивительных свойств прионов - это существование различных штаммов. Болезнь может различаться по течению на генетически однородном материале, причем эти различия воспроизводятся и у вновь инфицированных животных (Kasksak et al, 1991). Свойства штаммов отличаются по времени инкубации, распределению вакуолярных повреждений и степени агрегации РгР с (Pmsiner et al, 1998), а также эффективностью конверсии in vitro (Bessen and Marsh, 1992b; Bessen et al, 1995). Протеазоустойчивые «ядра», характерные для разных штаммов РгР с, различаются по своим размерам, что выявляется по электрофоретической подвижности белка после его инкубации с протеиназой К (Bessen and Marsh, 1992; 1994).
Амилоидами называют белковые нерастворимые отложения фибриллярной структуры, образующиеся при некоторых болезнях человека, называемых амилоидозами (Jarrett et а!., 1993). Эти отложения имеют сходную структуру (Обзор литературы, п.2.2.) и обнаруживаются в основном во внеклеточном пространстве органов и тканей локально и/или систематически, в зависимости от белка, вовлеченного в патологию. Клинические симптомы обычно не проявляются вплоть до последних стадий этих заболеваний, которые приходятся на средний или пожилой возраст. Амилоидозы обычно являются следствием повышения количества секретируемых и циркулирующих в крови белков, способных формировать внеклеточные амилоидные отложения в различных органах и тканях. Например, во время острой фазы туберкулеза или ревматоидного артрита, сопровождающейся воспалением, резко увеличивается содержание сывороточного амилоида А, что приводит к его отложению в селезенке, почках и печени. При множественной миеломе в плазматических клетках происходит сверхэкспрессия легких цепей иммуноглобулинов, которые образуют отложения в различных тканях. Существуют амилоидозы, характеризующиеся накоплением амилоидогенного белка только вблизи того места, где он синтезируется. Это, например, амилин в поджелудочной железе при диабете II типа, атриальный натриуретический фактор при атриальном амнлоидозе сердца. Существует группа заболеваний, характеризующаяся амилоидными отложениями внутри или вне клеток центральной нервной системы - это нейродегенеративные заболевания. Самые известные из них - болезнь Альцгеймера, Хантингтона, Паркинсона, семейная спиноцеребральная атаксия, амиотрофический латеральный склероз. Эти заболевания характеризуются в основном малозаметным началом в пресенильном или старческом возрасте, неуклонным прогрессированием расстройств памяти и высших корковых функций вплоть до тотального распада интеллекта и психической деятельности. Развитие болезни Альцгеймера происходит в результате внеклеточного накопления амилоида р (Ар) и внутриклеточного отложения гиперфосфорилированого белка тау (tau). Трансмембранный белок-предшественник АРР (Amyloid Precursor Protein), локализованный в обогащенных холестерином микродоменах плазматической мембраны синапсов, расщепляется сначала 0-секретазой, а после - внутри мембраны у-секретазой с образованием амилоидогенного Ар. Ранее считалось, что Ар секретируется из клетки, однако при высокой концентрации он может агрегировать и накапливаться в цитоплазме (Coughlan and Brodsky, 2005).
Прионы низших эукариот
Параллельно с развитием представлений о прионной природе различных нейродегенеративных заболеваний человека и животных накапливались все новые данные о сходном феномене в совсем другой области исследований - дрожжевой генетике. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружен ряд прионных белков, из которых лучше всего исследованы Sup35, Ure2 и Poiql, соответствующие детерминантам [PSf], [URE3] и [Р/ЛЛ]. В 1994 г. Рид Уикнер высказал гипотезу, которая объяснила экспериментальные данные, накопившиеся к этому времени (Wickner, 1994). Она связывает эти детерминанты с существованием определенных белков в клетке, которые по своим свойствам сходны с прионами млекопитающих. Уикнер предложил генетические критерии оценки их прионных свойств: 1) обратимость потери и способность возникновения de novo; 2) увеличение частоты возникновения приона de novo при его сверхэкспрессии; 3) наличие гена приоиного белка дикого типа в геноме; 4) не-Менделевский тип наследования. У мицелиального гриба Podospora anserina известен детерминант [Het-s] (Coustou et al, 1996), который регулирует образование гетерокарионов при скрещивании различных штаммов этого гриба. Колония гриба P. anserina - это синцитий, в котором клетки могут обмениваться цитоплазмой и даже ядрами. Гифы двух колоний гриба могут сливаться с обменом цитоплазмой и образованием гетерокарионов, только если у них идентичны по крайней мере девять het локусов (Saupe et al, 2000). Если колонии отличаются хотя бы по одному het локусу, то при слиянии гифов происходит реакция программированной клеточной гибели - несовместимости гетерокарионов. Локус het-s обладает необычными свойствами. Он представлен двумя аллелями: het-s и het-S, продукты которых отличаются на 14 аминокислот (белки HET-s и HET-S). Аллель het-s имеет два различных фенотипа - [Het-s] и [Het-s ]. При фенотипе [Het-s] колонии одного гриба несовместимы с колониями гриба, несущими het-S аллель (НБТ-S белок), а при фенотипе [Het-s ] реакции несовместимости с такими колониями нет. Фенотипа [Het-s] может спонтанно возникать из [Het-s ] с низкой частотой. Этот переход происходит также при смешивании цитоплазмы двух клеток, одна из которых проявляет фенотип [Het-s]. Экспериментальные данные указывают на приоиный механизм перехода между двумя фенотипами: [Het-s] ведет себя как нехромосомный генетический элемент, a [Het-s ] - как его отсутствие (Coustou et al, 1997).
Для возникновения [Het-s] необходимо наличие функционального het-s гена, а значит, и белка, кроме того, амплификация het-s гена увеличивает частоту перехода из [Het-s ] в [Het-s]. Прионная форма [Het-s] ответственна за проявление несовместимости, поскольку делеция гена het-s приводит к формированию колоний, совместимых и с het-s, и с het-S партнерами. Прионные свойства этого белка были подтверждены и биохимически: сверхэкспрессия белка HET-s в клетках [Het-s] приводит к его агрегации (Coustou-Linares el al, 2001); белок HET-s образует амилоидные фибриллы in vitro (Dos Reis et al, 2002), которые устойчивы к обработке протеиназой К (Balguerie et al, 2003) и связывают краситель Конго красный; состояние [Het-s] может быть получено введением полимеров HET-s, полученными in vitro (Maddelein et al, 2002). О биологической роли этого детерминанта будет сказано ниже (обзор литературы, п. 5.1.). 3.2. Нехромосомпый детерминант \URE3] дрожжей Saccharomyces cerevisiae Детерминант [URE3] был обнаружен Франсуа Лакру при исследовании генетики метаболизма азота у дрожжей (Lacroute, 1971). Исследования основывались на наблюдении, что в присутствии богатых азотом соединений (ионов аммония, глутамина, аспарагина) клетки дрожжей перестают усваивать бедные азотом соединения (уреидосукцииат и мочевину). Если в среде присутствуют "богатые" источники азота, активируется путь их утилизации, при этом путь утилизации бедных источников репрессируется. Открытие приона [URE3] произошло благодаря обнаружению мутантов, способных к поглощению уреидосукцината из среды, богатой солями аммония (Lacroute, 1971). Большинство мутаций были рецессивными, а одна «мутация» - [URE3] оказалась доминантной. Так, мутанты дрожжей S. cerevisiae, дефектные по активности аспартат-транскарбомоилазы, могут расти на среде с уреидосукцинатом только в отсутствие ионов аммония, так как аммоний подавляет его перенос из среды в клетку. Оказалось, что рост мутантов на этой среде может быть восстановлен за счет мутаций в гене Ure2 или за счет появления нехромосомно наследуемого детерминанта [URE3].
При этом фенотип мутантных клеток и клеток, несущих детерминант, проявляется одинаково. В 1994 году Викнер предположил, что детерминант [URE3] имеет прионную основу. Так, [URE3] может быть обратимо изгнан при росте в присутствии низкой концентрации гидрохлорида гуаыидина (GuHCl; Guanidme Hydrochloride), при которой не происходит денатурации белков. При этом после изгнания [URE3] может возникать cle novo с такой же частотой, как и в исходном штамме. При сверхэкспрессии белка Ure2 частота возникновения [URE3] возрастает в 20-200 раз (Wickner, 1994). Присутствие гена URE2 необходимо для поддержания детерминанта [URE3]. [URE3] передается при цитодукции - процессе копуляции клеток с обменом цитоплазмой, но без слияния ядер (из-за дефекта кариогамии), что подтверждает его не-Менделевский тип наследования (Aigle and Lacroute, 1975). Кроме того, in vitro было показано, что Ure2 способен олигомеризоваться и формировать амилоидные фибриллы. [URE3] может быть передан дрожжевым клеткам при трансформации фибриллами Ure2, сформированными in vitro (Brachmann et al, 2005). Поддержание [URE3] зависит от шаперонов Hspl04 и Ssa2 (шаперона из семейства Hsp70) (Scbwiirmier and Masison, 2002). Делєция гена HSP104 вызывает изгнание [URE3] (MoriyamaeM/., 2000). 3.3. Детерминант [РЯҐ]: генетические проявления и молекулярная основа В 1965 году Брайан Кокс описал необычный наследственный фактор неядерной природы, не связанный с митохондриями, и назвал его фактором [Р8Ґ]. В присутствии этого фактора слабый oxp-cynpeccop SUQ5 (кодирует серин-специфичную тРНК с антикодоном, комплементарным нонсеис-кодону UAA) становился более эффективным, а сильные супрессоры становились летальными (Сох, 1965; Сох, 1971; Сох et al, 1988). Позже было показано, что [PSt] оказывает влияние на супрессию всех трех стоп-кодоиов, а не только охр (UAA). Незадолго до открытия [PSt] были описаны мутации в гене SUP35, которые приводили к аналогичному «омнипотеитному» супрессореому фенотипу (Hawthorne et al, 1968; Инге-Вечтомов, 1970). Мутанты sup35 были способны супрессировать все типы нонсенс-мутаций, так же, как и [PSt], однако на тот момент связь между SUP35 и [Р$Ґ] не была очевидной. Детерминант [PSP ] был доминантен и наследовался по неменделевскому типу, в отличие от рецессивных супрессорных мутаций. Позже было показано, что делеции 5 -концевой части гена SUP35 приводят к исчезновению [РіїҐ] (Ter-Avanesyan et al, 1994). Высокий уровень белка Sup35, а не просто амплификация гена SUP35 во много раз увеличивала вероятность возникновения [PSf] de novo у штаммов, не содержащих этого фактора (Chemoffet al, 1993). В 1995 году было показано, что белок Sup35 вместе с белком Sup45 являются факторами терминации трансляции, гомологичными eRF3 (eucaryotic Release Factor 3 - фактор, который стимулирует гидролиз пептидил-тРНК в присутствии GTP) и eRFl (eucaryotic Release Factor 1 - фактор, узнающий все три нонсенс кодона) соответственно (Zhouravleva et al, 1995). По аналогии с [URE3] Викнер предположил, что детерминант [PSF] также существует благодаря способности белка Sup35 переходить в самоподдерживающееся приониое состояние (WIckner, 1994).
Конструирование плазмид и другие генно-инжеиериые манипуляции
Рестрикцию (обработку ферментами рестрикции) плазми дной ДИК, электрофорез фрагментов ДНК в агарозном теле и процедуру конструирования плазмид при помощи Е. сой выполняли в соответствии с (Sambrook et ai, 1989а). Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli также проводили в соответствии со стандартным протоколом (Sambrook et ai, 1989а), Когда это было необходимо, "туплеиие" "липких" концов фрагментов ДНК производили с помощью фрагмента Кленова. ДНК-полимеразы. Секвенирование ДНК производили в соответствии с (Sanger et al., 1977). Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли при помощи набора реактивов QIAEX II (Qiagen) в соответствии, с инструкцией производителя. Обработку кииазой проводили согласно протоколу производителя (SibEnzyme). Плазмиды, использованные в работе, представлены в таблицах 2 и 3. Плазмида yex4Sup35NM6His была получена из плазмиды yex4-SUP35 (Тег-Avanesyan et ai, 1993) удалением фрагмента Clal, несущего ген LEW, а также заменой фрагмента Bcll-Xbal, кодирующего С-домен белка Sup35, олигонуклеотидами, кодирующими последовательность из 6 гистидинов (предоставлена Д. Крындушкиыым). Плазмида Yex4MetQ66M.C35 была также получена из плазмиды yex4-SUP35. Промотор гена SUP35, начиная с сайта MluJ (позиция -383) был замещен промотором гена МЕТІ 7, амплифицировашюго с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) начиная с позиции -429 (олигонуклеотиды для ПЦР D: ACGCGTCAGATTTAGGTGGA; R: CCCGAAATGAGATGGCATTG) (предоставлена Д. Крындушкииым). N-домен Sup35 был замещен па последовательность из 66 глутаминов. Олигонуклеотиды, использованные для получения такой последовательности, те же, что и при получении плазмид, кодирующих белки polyQ(Y) новой серии, за исключением последовательности элонгатора, которая не содержала нуклеотидов TCTGGC после первого ATG. кодирующих серии и глицин. Аминокислотная последовательность белка представлена на рис.8. Плазмида Yex4MetQ66MC35AS была получена из плазмиды Yex4MetQ66MC35 удалением фрагмента Sail, кодирующим аминокислоты Sup35 с 483 по 685 (предоставлена Д. Крындушкииым).
Плазмида pBC-mql::HIS3 была получена вставкой фрагмента Nsl-ВатШ (1260 п.н.) из плазмиды рВС-ДШЛ (получена и предоставлена Г.Фоминовым, иеопубликовано), содержащей маркер для делеции гена RNQl HI83, в плазмиду рВС-RNQ1 (получена и предоставлена И. Икундиной, неопуоликовано), разрезанную по сайтам Nsi-Bglll внутри гена RNQL Плазмида pET30a-Rnq 1 -Hisf, была подучена вставкой фрагмента Bgl/1-SnaBI из плазмиды pBC-Rnql (получена и предоставлена И. Шкундиной. иеопубликовано) в вектор рЕТЗОа (Novagen). разрезанный по сайтам ЕсПЗбП-ВатШ. Илазмида pRS313-3ATG была получена вставкой фрагмента Xhol-Xbal из плазмиды pRS315-3ATG, кодирующим ген SUP35. в вектор pRS3I3, содержащий маркер HIS3 (Sikorski and Hieter, 1989) и разрезанный по сайтам Xhol-Xbal. Илазмида pRS313-HSP104 была получена вставкой фрагмента ВатШ-Ира! из плазмиды YEplacl81 -Hsp 104-Rnq 1 (получена и предоставлена И. Шкуядиной, неопубликовано), кодирующей ген HSP104, в вектор pRS313 (Sikorski and Hieler, 1989). разрезанный по сайтам Smal-Bamtll. Плазмиды y35SBSEQ70dSalI и y35SBSEQY76dSalI были получены из плазмид y35SBSEQ70 и y35SBSEQY76 соответственно путем удаления фрагмента Sail, кодирующим аминокислоты Sup35 483 - 685. Молекулы ДНК, кодирующие полиглутаминовые и полиглутамин-тирозиновые последовательности, были получены с использованием трех пар комплементарных олигонуклеотидов (рис. 7). Пара «терминаторов»1 кодировала участок начала трансляции и содержала сайты для клонирования Sau3A и Seal. Пара «элонгаторов»2 кодировала 5 глутаминовых остатков (QQQQQ) или последовательность QQQYQ. Каждая пара элонгаторов смешивалась с парой терминаторов в соотношении 10:1. Смесь обрабатывали киназой, затем лигировали. В результате получали длинные поли-олигомеры со случайным расстоянием между фрагментами терминаторов. Лигированную ДНК резали рестриктазами Sau3A и Seal, разделяли по размеру на агарозном геле и лигировали с вектором pSBSE (В. Кушниров, неопубликовано)3, разрезанным рестриктазами BamHI и Eel 13611. Лигазной смесью трансформировали штамм E.coli DH5a. длину полиглутаминовой вставки в клонах трансформантов анализировали с помощью ПЦР. Клоны, в которых обнаруживали вставку желаемого размера, наращивали для препаративного выделения плазмидной ДНК. Полученными плазмидами трансформировали дрожжевой штамм 5V-H19-GST-SUP35, который позволял заранее оценить, идет ли экспрессия гибридного белка с данной плазмиды. Этот штамм имел супрессорный (белый) фенотип благодаря мутации upf2. При экспрессии гибридного белка, который имел функциональный С-домен Sup35, клетки становились розовыми. Клетки оставались белыми в 2 случаях: при отсутствии экспрессии (в частности, при отсутствии вставки) или при экспрессии белка с очень длинным фрагментом polyQ(Y), который сразу полимеризовался. Полученных трансформантов анализировали на наличие экспрессии гибридного белка с помощью SDS-PAGE и последующего иммуноблоттинга с антителами против Sup35C. Белок GST-Sup35C имел значительно большую молекулярную массу, чем белки polyQ(Y), что позволяло нам отличить эти 2 формы по подвижности. В тех плазмидах, с которых шла экспрессия, точную длину вставки определяли секвенированием . Кроме того, секвенирование показало, что в некоторых конструкциях полиглутаминовая последовательность оканчивалась как ...Q-PQGA-(Sup35MC), вместо ...Q-QSGA-(Sup35MC). Такие конструкции мы также использовали в нашем исследовании, поскольку такое отличие не кажется значимым.
Клетки дрожжей выращивали до экспоненциальной фазы роста. (ОД;оо = U5) в объеме 2 мл, собирали центрифугированием, промывали в буфере Z (Stansfield et al, 1995), и ресуспеидировали в 100 мкл буфера Z. Далее клетки подвергали двум циклам замораживания/оттаивания, используя при этом жидкий азот и водяную баню на 30UC. Эта процедура ослабляла клеточные стенки дрожжевых клеток, позволяя на следующем этапе проникать внутрь клеток субстрату Р-галактозидазы (ONPG). После этого суспензию клеток смешивали с 0,7 мл буфера Z с 40 мМ р-меркаптоэтаиола. Затем к клеткам добавляли 200 мкл ONPG (4 мг/мл в буфере Z) и выдерживали их на 30С при постоянном помешивании до появления характерного желтого оттенка (для разных трансформантов и условий роста от 20 мин до нескольких часов). После этого реакцию останавливали добавлением 400 мкл 1 М Na2C03. Клетки осаждали центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 10 минут. Далее определяли OD420 У супернатанта, после чего (3-галактозидазная активность клеток рассчитывали по формуле А = 1000 OD4io/(t;KV ODjoo), где t (мин) - время инкубации с ONPG, V (мл)- объем дрожжевой культуры, взятой в реакцию. Для каждого измерения в работе брали три независимые дрожжевые колонии, причем измерения проводили независимо 2 раза для каждой колонии. Окончательное значение получали после усреднения 6 результатов. Для определения эффективности сквозного прочтения нонсенс-кодонов использовали плазмиды серии pUKC815 - pUKC819 (Stansfield et al., 1995a). pUKC815 несет химерный ген PGKl-lacZ. в то время как pUKC817, pUKC818 и pUKC819 имеют встроенные в рамке в месте стыка, генов PGK1 и lacZ стоп-кодоны UAA (ochre), UAG (amber) и UGA (opal), соответственно. Таким образом, об интенсивности сквозного прочтения этих ранних стоп-кодонов можно судить по активности 3-галактозидазы, измеряемой в лизатах клеток. Уровень ноисеис-супрессии определи как отношение (%) активности р1 -галактоз идазы в трансформантах, несущих pUKC817, pUKC818 или pUKC819, к активности 3-галактозидазы в трансформантах, имеющих плазмиду pUKC815.
Полиглутаминовые и полиглутамин/тирозиновые последовательности длиной более 45 остатков полимеризуются in vivo
Для решения поставленной задачи мы сконструировали 2 серии плазмид, кодирующих потенциальные прионобразующие домены (ППД), сшитые с М- и С- доменами белка Sup35 (см. Материалы и методы, п.З и рис. 7). Sup35MC начинался с серина-125 нативной последовательности, чтобы исключить возможную экспрессию белков, лишенных ППД, с метионина-124 (Dagkesamanskaya et. at, 1997). Такая экспрессия нарушала бы. зависимость фенотипа клеток от степени полимеризации гибридного Sup35. Плазмиды первой серии (poiyQ) кодировали белки с гомополимерными полиглутаминовыми последовательностями вместо приош-юго домена белка Sup35 (MSG-Qsn-QSQGA). Плазмиды второй серии (polyQY) кодировали белки с полиглутаминовыми последовательностями, в которые были добавлены остатки тирозина в соотношении 4:1 (MSG-(QQQYQ),,-QSQGA). Длину Q и QY фрагментов можно представить формулой 5п+1. В некоторых случаях полиглутаминовый фрагмент оканчивался последовательностью PQGA вместо QSQGA (см. Материалы и методы), и его длина составляла 5п. Кодируемые белки Ш1Д-8ир35МС мы обозначим как Qm и QYm, где m обозначает длину Q(Y) фрагмента, например, Q70 и QY76. Несмотря на то, что кодируемые белки были экспрессироваиы под контролем промотора гена SUP35, экспрессия этих белков на генную копию была значительно ниже, чем для Sup35 дикого типа. Так, экспрессия Q70 с центромерной плазмиды в достаточной мере ие комплементировала функцию Sup35 в терминации трансляции, что приводило к ингибированшо роста и суирессорному фенотипу (данные не приведены). Однако экспрессия белков Q/QY с мыогокопийньгх плазмид превышала обычный уровень экспрессии дикого Sup35 в 2-3 раза (рис. 16А). Эти плазмиды и были использованы в работе, поскольку они определяют уровень экспрессии гибридных белков, наиболее близкий к обычному уровню Sup35. Следует отметить, что определение тотального уровня экспрессии полиглутаминовых белков было затруднено, поскольку кипячение в SDS не растворяет полностью глутаминовые полимеры и может приводить к вторичной агрегации мономеров (данные не приведены). Для изучения свойств белков polyQ(Y) был получен штамм 74-D694/Asup35 [PIN ] с делецией гена SUP35, жизнеспособность которого поддерживалась за счет экспрессии аллеля SUP35-C, находящегося на центромерной плазмиде (Материалы и методы, п.1).
Штамм 74-D694/Asup35 [PIN ] трансформировали плазмидами, кодирующими гибридные poIyQ(Y) белки, с последующей потерей центромерной поддерживающей плазмиды с SUP35C (Материалы и методы, п.2). В отличие от [PSf], полимеризация гибридных белков происходила без всякой селекции клеток с супрессорный фенотипом. Клетки штаммов, синтезирующие белки polyQ(Y), сразу проявляли супрессорный фенотип, интенсивность которого зависела от степени полимеризации соответствующего белка (рис. 16Б) (см. ниже). Для анализа растворимой фракции Sup35 мы воспользовались методом разделения полимерной и моыомсрной форм в SDS-PAGE без предварительного кипячения образцов (Kushnirov el al, 2006). Уменьшение количества растворимого гибридного Sup35 коррелировало с усилением супрессорного фенотипа, что говорит о том. что супрессия нонсенс-мутации adel-I4 происходила вследствие полимеризации белков polyQ(Y) (рис. 16В). Следует отметить, что супрессия в случае polyQY белков была эффективнее и возникала при меньшем истощении мономеров гибридных белков, чем в случае белков polyQ. Рацее было показано, что супрессорный фенотип возникает при уменьшении количества растворимого, функционального Sup35 до менее чем 25% от его нормального уровня (Kochneva-PervLikhova et al, 2001). В данном же случае супрессия достигалась при уровне растворимого polyQY 33% и даже более (рис. 16А). Кроме того, для всех полученных штаммов, посеянных истощающим штрихом, наблюдалась гетерогенность по фенотипу в виде вьтщепления более антисупрессорных секторов (рис. 16Г). Вероятно, супрессорный фенотип достигался, с одной стороны, благодаря полимеризации ППД-домеиов гибридных белков, а с другой стороны, за счет иных факторов, не связанных с их полимеризацией. Причины такой нестабильности в данной работе не были установлены, однако, известно, что белок Sup35 имеет неканонические функции, не связанные с терминацией трансляции (Valouev el al, 2002). Возможно, замена N-домена на фрагмент polyQ(Y) направляла его в иные процессы, уменьшая его трансляционную активность . Таким образом, мы полагались более на биохимические подходы при изучении полимеризации гибридных белков, а генетические данные имели вспомогательный характер и мы ими пользовались как качественными тестами на эффективность процесса полимеризации гибридных белков. Для изучения процесса полимеризации polyQ(Y) белков различной длины был использован метод SDD-AGE. Полимеризация polyQ(Y) белков начиналась быстро и не требовала дополнительной, селекции клеток: полимеры появлялись в течение 30 поколений с момента начала экспрессии4. Было обнаружено, что минимальная длина последовательности polyQ(Y), приводящая к полимеризации гибридного белка, составляла 51 аминокислоту для серии polyQ и 46 аминокислот для серии polyQY (рис.ІбД). Поскольку белок QY46 на 5 аминокислотных остатков короче белка Q51. можно заключить, что добавление тирозиновых остатков к полиглутамш-ювой последовательности улучшает способность таких белков полимеризоваться.
Кроме того, размеры полимеров polyQ оказались значительно больше размера полимеров polyQY (рис. 16Д). что указывает на улучшенную фрагментацию последних, как мы исходно и предполагали. Известно, что шаггерон Hspl 04 необходим для наследования [PSf] (Cheraoff et al, 1995), поскольку он выполняет фрагментацию полимеров Sup35 (Kushnirov and Ter-Avanesyan, 1998; Kryndushkin et al, 2003; Shorter and Lindquist, 2006). Агрегация полиглутаминовых белков также требует наличия этого шапероиа. что было показано отсутствием светящихся точек полиглутаминовых белков, сшитых с белком GFP, а также ультрацентрифугированием (Krobitsch and Lindquist, 2000 Meriin et al, 2002). В настоящей работе предполагалось более детально изучить влияние Hspl04 на полимеризацию полиглутаминовых белков. Было показано, что делеция гена HSPI04 блокировала полимеризацию белков Q70, Q85, Q131 (рис. 17 Б, В), что отражалось в усилении антисупрессорнош фенотипа (рис. 17А). При восстановлении экспрессии Hspl04 путем введения в такие клетки ценгромерной плазмиды с геном HSP104, по прошествии примерно 60 поколений полимеризация Q85 восстановилась полностью, а полимеры Q70 были едва различимы, Видимо, полимеризация Q70 восстанавливается медленнее при меньшей длине фрагмента polyQ (рис. 17Б). Склонность к полимеризации увеличивалась с удлинением фрагмента polyQ(Y), что отражалось в меньшей зависимости от шапероиа Hspl04. Так, небольшое количество полимеров Q131 возникало через 60 поколений после начала экспрессии соответствующего гена (рис. 17В), Делеция. гена HSP104 влияла и на полимеризацию polyQY белков. Через 30 поколений после делеции полимеры QY76 не наблюдались или их количество было сильно уменьшено, однако примерно через 60 поколений полимеризация восстанавливалась. При этом размер полимеров QY76 был значительно больше исходного (рис, 17Б). Эффективность поддержания полимеров снижалась с уменьшением длины фрагмента polyQY: QY50 не пол имерш овал ся в клетках AhspI04 даже через 150 клеточных поколений (рис. 17Г). Полученные данные говорят о том, что Hspl04 являлся основным фрагментиругощим фактором для полимеров polyQ и polyQY. Был также обнаружен фрагментирующий фактор, действующий на полимеры QY76 в отсутствие Hspl04. Подробнее это будет рассмотрено в разделе «Обсуждение», п. 4.2.
