Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Цели и задачи исследования
Основные положения, выносимые на защиту
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологическая роль, когезии сестринских хроматид
Молекулярная природа когезии сестринских хроматид
Введение
Когезии: структура комплекса и механизм действия
Дополнительные факторы когезии в митотическом цикле
Когсзия в мейозе
Регуляция когезии при сегрегации хромосом
Структура сайтов когезии
Открытые вопросы в когезии МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Стандартные методы
Манипуляции с клетками дрожжей
Антитела
Очистка рекомбинантных белков
Метод торможения фрагментов ДНК в геле (ретардация)
Сборка хроматина in vitro
Эксперименты по связыванию когезина с хроматином
Прочие эксперименты in vitro РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Функциональная характеризация когезина
Исследование структуры сайтов когезии ш vivo
Взаимодействие когезина с ДНК и хроматином in vitro
Исследование вклада составляющих когезина в установление
2. Исследование структурно-функциональных взаимоотношений белков,
участвующих в когезии сестринских хроматид
2.1. Сайт-направленный мутагенез белка Mcdlp
\4
#
Изучение роли белка Pds5p в когезии 62
Изучение роли белка Ecolp в когезии 68 3. Мейотический вариант когезина 70 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 75 ВЫВОДЫ 84 Благодарности 85 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 86
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
БСА -бычий сывороточный альбумин
нп - пара нуклеотидов
тнп — тысяч пар нуклеотидов
ПААГ-Полиакриламидный гель
ЭДТА -Этилендиаминтетрауксусная кислота
ТБЭ - трис-борат-ЭДТА
PBS - (Phosphate buffer saline) фосфатно-солевой буфер
SDS - (Sodium Dodecyl Sulphate) додецилсульфат натрия
SDS-ПААГ — SDS полиакриламидный гель
PBS-Twcen - фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.01 % Tween
а.к. - аминокислоты
PMSF-(PhenyI-Methan-Sulphonil Fluoride) фенилметансульфонилфторид
ПЦР - полимсразная цепная реакция
FACS — (two-parameter Fluorescent-Activated Cell Sorting) метод двухпараметрической
сортировки клеток, меченных йод-дезоксиуридином в протоке
GFP — (Green Fluorescent Protein) зеленый флуоресцирующий белок
ВВЕДЕНИЕ
Клетки всех эукариотических организмов, включая Saccharomyces cerevisiae и человека, наследуют генетическую информацию на ДНК, которая уложена в ДНК-белковый комплекс - хромосому. Для воспроизведения точных копий своего генома, в процессе митоза или мейоза, клетке необходимо правильным образом разделить каждую редуплицировавшуюся хромосому на две хроматиды, чтобы дочерняя клетка получила одну из них. Недостаток или избыток числа хроматид приводит, соответственно, к гибели или дестабилизации генома. Так, человеческие эмбрионы с неправильным хромосомным набором в большинстве случаев погибают, а в случае их выживания приводят к серьезным дефектам у новорожденных. Подобные же нарушения в клетках взрослого человека часто являются причиной злокачественных новообразований (Jallepalli et al. 2001).
История изучения процесса, получившего название «когезия сестринских хроматид» насчитывает немногим более пяти лет, когда было доказано, что хроматиды остаются сцепленными друг с другом при помощи специализированного белкового комлекса, когезина, с момента их синтеза до расхождения. Именно механизм когезии лежит в основе хорошо известного (по данным микроскопии) распределения хромосом в центре митотического веретена и последующего одновременного расхождения хромосом к противоположным полюсам (Tanaka et al. 2000, Toyoda et al. 2002).
Установление когезии происходит строго во время репликации и непосредственным образом зависит от формирования когезина, состоящего из четырех субъединиц : Smcl; Smc3; Mcdl/Sccl/Rad21 и Scc3/SA1,2 (Losada et al. 1998, Toth et al. 1999, Uhlmann et al. 1998). Данные, полученные к настоящему моменту, свидетельствуют о том, что образовавшиеся при этом хроматиды могут удерживаться вместе либо за счет ДНК-связывающей активности когезина (Akhmcdov et al. 1998, Hirano 2000), либо за счет удержания хроматид внутри кольца, образуемого субъединицами когезина (Haering et al. 2002).
Хотя главная функция когезина состоит в обеспечении правильной сегрегации хромосом, он, по-видимому, принимает участие в других важных процессах в клетке и играет роль в структурной организации хроматина. Кроме того, он принимает участие в ответе клетки на повреждение ДНК (Kim et ai 2002а, Kim et al. 2002b, Yazdi et al. 2002), в репарации двунитевых разрывов (Pasierbek et al. 2001, Sjogren et al. 2001, Walowsky et al. 1999) и регуляции образования гстерохроматина (Donze et al. 1999, Ishii et al 2002, Nonaka et
al 2002). При этом, в силу того, что когезии был до сих пор практически не охарактеризован с точки зрения его ферментативной активности, остается неизвестным, заложена ли многофункциональность когезина в его способности «скреплять» хроматиды, или же у данного комплекса много различных молекулярных функций.
Хотя центральная роль в обеспечении когезии сестринских хроматид отводится когезину, этот процесс зависит от ряда других белковых факторов, многие из которых остается к настоящему моменту плохо изученными. К их числу относятся белки Pds5p и Ecolp, роль которых в когезии, а также взаимоотношения с когезином, до сих пор не известны.
В настоящий момент молекулярный механизм установления когезии практически не изучен. Центральным вопросом здесь является то, каким образом когезин физически взаимодействует с хромосомой, а также, чем обусловлена пространственная и временная специфичность этого взаимодействия in vivo. Принимая во внимание тот факт, что когезин связывается с хромосомами в локусах с различной структурой, включая такие как эу- и гетерохроматин, центромерные области и двунитсвые разрывы хромосом, для исследования функции когезина, необходимо разработать экспериментальные системы, моделирующие когезию in vitro.
Представленная работа посвящена исследованию молекулярных механизмов когезии сестринских хроматид в различных условиях. Главной целью данного исследования было выделить четырехсубъединичный когезин из S. cerevisiae и установить его субстратную специфичность.
Задачи исследования Целью данного исследования было выделение четырехсубъединичного когезина из Sacchcromyces cerevisiae и установление его субстратной специфичности. Для ее достижения были поставлены следующие задачи
Определить особенности связывания когезина с хромосомами S. cerevisiae in vivo.
Клонировать, экспрессировать и очистить рекомбинантный когезин S. cerevisiae.
Охарактеризовать ДНК-связывающую активность когезина in vitro.
Охарактеризовать хроматин-связывающую активность когезина ш vitro.
Определить факторы, влияющие на взаимодействие когезина с хроматином in vitro.
Основные положения, выносимые на защиту
Активный рекомбинантный комплекс когезин дрожжей S. cerevisiae может быть выделен из клеток насекомых.
Взаимодействие рекомбинантного когезина хроматином ш vitro является специфическим и характеризуется высокой аффинностью.
3. Взаимодействие когезина с хроматином происходит не через хвостовые домены гистонов
и не через межнуклеосомную (линкер ную) ДНК.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биологическая роль когезии сестринских хроматид
Недавно была опубликована последовательность генома человека. Кажется невероятным, что в ядре каждой клетки хранится генетическая информация объемом около 3 Гигабайт. Тотальная длина геномной ДНК человека в 23 хромосомах достигает I метра. Таким образом, упаковка этого материала в ядре, диаметром около 10 мкм представляет собой нетривиальную задачу. Еще более поражает то, каким образом в таком маленьком объеме происходит дупликация и расхождение хромосом в дочерние клетки.
Механизм наследования дочерними клетками полных копий генома при делении клетки является одним из наиболее фундаментальных вопросов биологии. Открытие структуры ДНК и репликации генома, а также исследования белков цитоскелета и механизма их действия при цитокинезе, создали представление о том, что происходит с хроматидами после дупликации в митотическом и мейотическом циклах. Однако из-за структурной сложности многоуровневой организации хромосомы до последнего времени не было информации о механизмах, обеспечивающих взаимное удержание сестринских хроматид, а затем, при переходе метафазы в анафазу, определяющее их синхронное расхождение к противоположным полюсам. Действительно, несмотря на происходящие с ними морфологические изменения после репликации, сестринские хроматиды пребывают в контакте друг с другом до перехода от метафазы к анафазе. Оказалось, что в основе этого процесса лежит сложный механизм, получивший название когезии сестринских хроматид. Этот феномен проявляется в наличии физических контактов или «мостиков» между хроматидами, предотвращающих перемещение хроматид друг относительно друга до начала анафазы. Места этих контактов на хромосомах получили название «сайтов когезии».
Почему клетке необходим механизм, обеспечивающий когезию сестринских хроматид? Способность эукариотических клеток предотвращать сегрегацию хромосом до завершения репликации и начала клеточного деления отличает их клеточный цикл от клеточного цикла у бактерий, где расхождение хромосом начинается вскоре после инициации репликации. Эта разнесенность во времени, возможно, сыграла ключевую роль в эволюции эукариотических хромосом (Nasmyth et al 2000). В отсутствие разделенных фаз синтеза ДНК (S) и митоза (М) была бы невозможна митотическая конденсация хромосом, без которой большие геномы эукариот было бы нельзя поделить между дочерними клетками. Для мейоза, где за репликацией следуют два раунда сегрегации хромосомного
материала, разделение во времени фаз S и М, абсолютно необходимо. Кроме того, когезия сестринских хроматид в мейозе играет важную роль в биологии развития, позволяя задерживать момент сегрегации до поступления внеклеточного сигнала (до 50 лет в случае ооцитов человека).
Структуры, удерживающие сестринские хроматиды вместе, отвечают за билатеральную симметрию хромосом в митозе. Такая симметрия лежит в основе строения всего аппарата митотического веретена, что обеспечивает симметричное и точное разделение хромосом, а также распределение остального содержимого материнской клетки при цитокинезе примерно поровну. Кроме того, когезия лежит в основе ориентировки кинетохоров сестринских хроматид к противоположным полюсам, что в свою очередь позволяет контролировать натяжение микротрубочек, соединяющих соответствующие кинетохоры и полюса веретена, и корректировать положение хромосом в метафазе (Nicklas etal 1994).
Последствия нарушения когезии сестринских хроматид являются катастрофическими для клетки. Если бы сестринские хроматиды могли разделяться и свободно диффундировать до формирования веретена, для клетки было бы невозможно определить, являются ли они действительно сестринскими (которые должны сегрегировать к противоположным полюсам в митозе и мейозе II). Это приводило бы к массовым ошибкам сегрегации. Дефекты разрешения когезии при переходе к анафазе в свою очередь приводят к нерасхождению хроматид, а следовательно к повреждениям хромосом, неправильному хромосомному набору, зачастую с потенциальным летальным исходом для клетки. Все больше данных свидетельствуют о непосредственной связи когезии сестринских хроматид с онкогенезом (Jallepalli et al. 2001). Несмотря на всю биологическую важность процесса когезии, молекулярный механизм, с помощью которого осуществляется связывание сестринских хроматид между собой, до сих пор плохо изучен.
2. Молекулярная природа когезии сестринских хроматид
2Л. Введение
Какие клеточные факторы обеспечивает сложный процесс установления когезии сестринских хроматид и его регуляцию? Несмотря на важность апарата когезии для поддержания генетического гомеостаза до недавнего времени не было известно практически ничего о самом механизме когезии. Одним из господствующих предположений было то, что главным фактором, сдерживающим расхождение хроматид, является поздняя дупликация центромерного хроматина.! Однако в дальнейшем выяснилось, что к митозу репликация на всех участках генома завершена (Comings 1966). Другая идея выделяла роль катенации сестринских молекул ДНК, вызванной движением репликационных вилок. В соответствие с этой идеей, повышение активности топоизомеразы II, высвобождает хроматиды из хромосомы с наступлением анафазы (Murray et ah 1985). Хотя активность Торо II очевидно необходима для конденсации хроматина и для того, чтобы распутать хроматиды, когезию нельзя объяснить только наличием катенанов. Во-первых, дрожжевые минихромосомы сцеплены в метафазе без какой-либо катенации сестринских минихромосом (Koshland et ah 1987). Во-вторых, центромеры дрожжей правильно ориентируются и начинают движение к полюсам в отсутствие топоизомеразной активности (Fimabiki etah 1993).
К пониманию того, что в процессе когезии сестринских хроматид задействованы специальные белки, привели генетические исследования мутантов, в которых хроматиды разделяются раньше положенного времени в мейозе. Например, ген дрозофилы MEJ332 критически важен для когезии в мейозе, но не является необходимым для митоза (Goldstein 1980). По всей видимости, белок MeiS332 играет специфическую роль в мейозе и не задействован в универсальном аппарате когезии. Недавние генетические исследования в Xenopus laevis выявили многосубъединичный белковый комплекс, когезин, который актуален для когезии сестринских хроматид не только у позвоночных (Losada et ah 1998), но и у дрожжей (Toth et ah 1999). Исследования мутантов дрожжей с нарушенной когезиеЙ сестринских хроматид сыграли ключевую роль в идентификации субъединиц когезина и дополнительных белковых факторов, участвующих в когезии (Guacci et ah 1997, Toth et ah 1999).
Другой важной стороной когезии сестринских хроматид является необходимость разрешения когезии при входе в анафазу, поэтому процесс разделения хроматид в анафазе также представляет большой биологический интерес. Ранее было показано, что процесс
