Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 5
2 Материалы и методы 31
3 Результаты и их обсуждение 53
Выводы 103
Список цитируемой литературы 105
Литературный обзор
Убиквитинирование представляет собой процесс пост-трансляционной ковалентной модификации белков молекулами консервативного полипептида, известного как убиквитин. Наряду с такими модификациями, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, убиквитинирование широко вовлечено в регуляцию генной экспрессии.
Число молекул убиквитина, присоединенных к белку, варьирует. Таким образом различают моно- и поли- убиквитинирование. Так, белки, модифицированные единичными молекулами убиквитиновых остатков, обычно оказываются вовлечёнными в эндоцитоз, в результате чего они моментально протеолизуются в лизосомах/дрожжевых вакуолях [обзор в 17]. Поли-убиквитинированные белки (т.е. модифицированные убиквитиновым полимером) становятся в дальнейшем предпочтительными субстратами многосубъединичной АТФ-зависимой протеазы, известной как 26S протеосома [18]. Классическая и наиболее хорошо изученная функция 26S протеосомалыюго комплекса - это гидролиз полипептидной цепи до коротких пептидов и молекул убиквитина [19-21].
Убиквитинирование обладает высокой селективностью, это очень быстрый и необратимый процесс, хотя и требует больших затрат энергии. Как правило, мутированные или/и короткоживущие белки (например, белки клеточного цикла) подвержены поли-убиквитинированию и последующему разрушению 26S протеосомой, обеспечивая механизм молниеносного ответа на изменения внутренней и/или внешней среды [2, 3]. Однако, как становится ясно на сегодняшний день, убиквитинирование далеко не во всех случаях ведет к разрушению меченного белка. В последнее время начала появляться интересная информация о новой роли убиквитинирования в регулировании генной экспрессии, а так же вероятных альтернативных механизмах функционировании 26S протеосомы. Так, на прошедшей летом 2001 конференции в Вермонте, США, «Убиквитин и Внутриклеточная Деградация Белков» были представлены обширные данные об участии убиквитина и мультиубиквитиновых цепей в сигнализации таких клеточных процессов, как доставка белков в определенные компартменты клетки, активация киназ, транскрипционных и репарационных факторов, а так же сортировка и процессинг белков [обзор конференции и 22] (рис.1). Известны случаи, когда 26 S протеосома гидролизует пептидную связь в четко определенном месте в последовательности специфически убиквитинированного белка-субстрата с образованием функционально активной молекулы последнего [5].
С биохимической точки зрения убиквитинирование представляет собой ковалентное присоединение молекул(ы) убиквитина (эволтоционно консервативного полипептида размером 76 аминокислотных остатков) к белку-субстрату. При этом образуется ковалентная связь между карбокси-концевым глицином (Gly-76) в последовательности убиквитина и -амино группой лизинового остатка белка. Этот процесс катализируется каскадом энзиматических реакций и имеет сложный многоступенчатый механизм [19-21].
Первым этапом в цепи убиквитинирования принято считать активирование молекулы убиквитина ферментом Е1 (так называемым убиквитин-активирующим ферментом). При этом происходит образование тиоэфирной связи между цистеином Е1 и СООН группой глицинового остатка убиквитина (Gly-76). Реакция протекает с формированием промежуточного убиквитинового аденилата при гидролизе молекулы АТФ до АМФ и пирофосфата (Рис.2, ступень 1).
Далее, активированная уже молекула убиквитина переносится на цистеин, расположенный в активном сайте фермента Е2 (т.н. убиквитин конъюгирующего фермента), снова с образованием тиоэфира (Рис.2, ступень 2). На третьем, как правило последнем этапе, катализируемом ферментом ЕЗ (т.н. убиквитин-лигазой), карбоксильный конец молекулы убиквитина образует амидную изопептидную связь с є-амино группой лизина белка-субстрата (Рис.2, ступень 3). Для осуществления переноса убиквитина с молекулы-носителя (Е2) на лизин белка-мишени необходимо, чтобы убиквитин и его субстрат находились в одном активном центре в оптимальной конформации. Считается, что именно ЕЗ координируют правильную сборку белков-участников реакции, выполняя роль фактора специфичности. Убиквитин-лигазы взаимодействует с одной стороны с Е2, содержащим активированный убиквитин; с другой стороны, непосредственно узнают и связывают белок-мишень, вовлекая его в каскад реакций убиквитинирования, и обеспечивают, таким образом, высокую специфичность этому уникальному процессу пост трансляционной модификации белков в целом. На основе накопленных данных считается, что ЕЗ узнают субстрат на основе наличия и доступности специфических последовательностей или мотивов, известных как сигналы убиквитинирования [обзор в 23].
Рассмотренный выше механизм убиквитинирования демонстрирует, что убиквитин-лигазы обладают двумя основными функциями: они узнают белок-субстрат и переносят на него молекулу(ы) убиквитина, осуществляя лигирование. Если механизмы катализа изучены достаточно подробно, то реальная информация, описывающая алгоритм узнавания белка-субстрата функцией ЕЗ на сегодняшний день ещё отсутствует. Поэтому, в настоящее время убиквитин-лигазы классифицированы на основе структурно-функциональных особенностей. Выделяют два основных класса ЕЗ: RING-finger- и hect- содержащие убиквитин-лигазы. Помимо наличия характерных функциональных доменов (RING-finger или hect), эти два класса ЕЗ имеют принципиально разные механизмы осуществления переноса молекулы убиквитина с Е2 на белок-субстрат. hect-ЕЪ непосредственно вовлечены в реакцию переноса, так как образует ковалентную связь между СООН-концом убиквитина и собственной аминокислотой цистеином (Рис.3-1), в то время как RING-finger-ЕЗ играют роль «посредников» в специфическом пространственном сближении Е2-Ub и белка-субстрата (Рис.3-2).
Материалы и методы
Для получения экспрессионных плазмидных ДНК были использованы стандартные методики реакций рестрикции, дефосфорелирования и лигирования. Реакция рестрикиии проводилась в объеме 100 мкл и содержала 5мкг рекомбинантной ДНК, очищенной на ионообменной колонке "Qiagen" (США), 20 единиц рестриктазы ("NEB", США) в присутствии стандартных компонентов, рекомендованных фирмой. Реакция проводилась в течение 2 часов при температуре 37 С (рестрикция ферментом Smal проводилась при 25С). Реакция останавливалась прогреванием, с последующей фенол/хлороформной экстракцией. Реакиш дефосфорелирования 5 концевых фосфатных групп ДНК проводилась в объеме 20мкл и содержала линейную ДНК, 50мМ трис НС1 (рН=9.3), 1мМ MgCh, ЮОмкМ ZnCb, 1мМ сперимидин и 1 единицу щелочной фосфатазы теленка CIP ("Promega", США). Реакция дефосфорелирования велась на протяжении 30 минут при 37С, затем 30 минут при 56С. Реакция останавливалась прогреванием, с последующей экстракцией смесью фенол-хлороформ. Реакция лигирования проводилась в объеме Юмкл, содержала ЗОмМ трис НС1 (рН=7.8), 1 ОмМ MgCI2,1 ОмМ ДТТ, 1мМ АТР, 1 единицу Т4 ДНК лигазы ("Promega \ США), а так же 1:10 молярное соотношение вектора и вставки. Реакция лигирования проводиоась на протяжении 16 часов при температуре 1 вС. Используемые экспрессгюнные вектора В работе были использованы следующие плазмидные вектора: 1. ТА линейный вектор ("Invitrogen", США), обладает липкими 5 (dT) концами, сконструирован для клонирования продуктов ПЦР; 2. pSKJI-bbv вектор был получен на основе pBluescriptll-SK ("Stratagene", США) и любезно предоставлен Марком Бойдом (Allegheny University, Philadelphia, USA). Этот вектор содержит последовательность сайта связывания с рибосомой RBS; З.Дрожжевой экспрессирующий вектор pYes ("Clontech", США) представляет собой кольцевую эписомальную плазмиду; несет селективный маркер ген игаЗ дикого типа. Содержит регулируемый галактозо-индуцируемый промотор GAL1; 4.
Вектор pYesHA был получен на основе вектора рYes путем лигирования с ним последовательности, кодирующей НА эпитоп (TyrProTyrAspValProAspTyrAla). Для этого, pYes расщепляли рестриктазами Hindlll и BamHl; олигонуклеотиды, содержащие последовательность НА, отжигали и обрабатывали рестриктазами Hindlll и BamHl. 5. Дрожжевой экспрессирующий вектор PESC ("Stratagene", США) представляет собой кольцевую эписомальную плазмиду; несет селективный маркер ген 1еи2 дикого типа и содержит регулируемый галактозо-индуцируемый промотор GAL10. MCS этого вектора содержит последовательность, кодирующую FLAG эпитоп; 6. Дрожжевой экспрессирующий вектор Yeplscl81 (любезный подарок доктора Дженча, Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Gennany) представляет собой кольцевую эписомальную плазмиду; несет селективный маркер ген 1еи2 дикого типа; , 7. Вектор, экспрессирующий в клетках млекопитающих РСЕР ("Invitrogen", США), представляет собой эписомальный кольцевой вектор, несет CMV промотор. Получение рекомбипантных тазмидных ДНК Фрагмент ДНК, содержащий Nedd4wt ген, получали методом ОТ ПЦР, он обладал липкими 3 (dA) концами и был лигирован с векторной ДНК ТА плазмиды с использованием стандартной методики лигирования. Затем плазмиду TA-Nedd4\vt расщепляли рестриктазами Smal и Spel и полученные фрагменты фракционировали электрофоретически с использованием агарозного геля с последующей элюцией ДНК фрагмента размером 3 т.п.о. (содержит последовательность Nedd4wt). Полученный ДНК фрагмент лигировали с ДНК вектора pSKJI-bbv, обработанного EcoRV и Xbal и дефосфорелированного с использованием стандартных методик. Липкий конец вектора, обработанного Xbal, совместим с липким концом вставки, обработанной Spel; рестриктазы Smal и EcoRV образуют тупые концы. Обработка фосфатазой была проведена для того, чтобы предотвратить циклизацию вектора без вставки в процессе лигирования. На следующем этапе, полученную плазмидную RWlpSKII-bbv Nedd4\vt расщепляли ферментами рестрикции Hindlll и Notl. Продукты реакции фракционировали электрофоретически с использованием агарозного геля и ДНК фрагмент размером 3 т.п.о.элюировали. Полученный ДНК фрагмент соответствовал последовательности, кодирующей Nedd4wt и нес на 5 конце последовательность bbv. Этот фрагмент лигировали с ДНК векторов pYes и РСЕР, обработанных рестриктазами Hindlll и Notl и дефосфорелированных. Таким образом, были получены рекомбинантные плазмиды р YesNedd4wt и PCEPNedd4wt. ПлазмидыpYesNedd4WW1 иpYesNedd4c/a (несущие мутированный ген Nedd4) бьши получены при помощи метода сайт-направленного мутагенеза на основе плазмиднои ДНКpYesNedd4wt (см. далее).
Эти плазмиды расщепляли рестриктазами Hindlll и Notl, и фрагмент ДНК, соответствующий Nedd4 гену, выделяли как описано раннее. Полученный фрагмент лигировали с ДНК вектора РСЕР, обработанного Hindlll и Notl и дефосфорелированного. Таким образом бьши получены рекомбинантные плазмиды PCEPNedd4WWl, PCEPNedd4c/a. Рекомбинантные плазмиды PESC и pYesNedd4WWl расщепляли рестриктазами BamHl и Hindlll, соответственно. Образованные в результате гидролиза ДНК липкие , концы «затупляли» при помощи реакции полимеризации фрагментом Кленова. Затем, плазмиды обрабатывали Xhol. Линейный вектор PESC обрабатывался фосфатазой. с использованием стандартной методики дефосфорелирования. Продукты гидролиза плазмиднои ДНКpYesNedd4WWl фракционировали в агарозном геле, фрагмент ДНК размером 3 т.п.о. (содержит Nedd4W\Vl) элюировали и лигировали с линейной ДНК вектора PESC. Таким образом была получена рекомбинантная плазми да PESCNedd4WWl. Для получения рекомбинантной плазмидыpYesNedd4Л WW1. несушей ген Nedd4 с делецией WW1 домена, был использован метод ПЦР. Последовательности Nedd4, фланкирующие WW1 домен, были амплифицированы с использованием специфичных для Nedd4 праймеров (см. далее). Для формирования липких концов у полученных продуктов ПЦР. ДНК фрагменты бьши рестрицированы ферментами Hindlll и BamHl. либо BamHl и Notl (последовательности сайтов рестрикции были введены в последовательности праймеров. см. таблицу 1). Полученные фрагменты были последовательно лигированы с ДНК векторарYes, обработанного сначала Hindlll и BamHl, а затем BamHl и Notl.
Результаты и их обсуждение
При скринировании экспрессионной кДНК библиотеки человека в поисках белка-партнера по взаимодействию с онкопротеином MDM2 (исследованием которого занималась лаборатория последние пять лет) был найден фрагмент убиквитин-лигазы человека Nedd4. Для получения полноразмерной кДНК копии Nedd4 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной деакции (ОТ-ПЦР), в реакции амплификации ДНК была исспользована термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus (Taq), известная неточностью синтеза ДНК копии с ДНК матрицы (=2 ошибки на геном на цикл репликации). Поэтому, предполагая образование мутаций в последовательности, кодирующей Nedd4, мы отобрали несколько клонов рекомбинантной ДНК для исследований взаимодействия с MDM2 в дрожжевых клетках и идентификации клона дикого типа (wt). Несмотря на то, что взаимодействий между MDM2 и полноразмерной формой Nedd4wt обнаружено не было, один из отобранных клонов Nedd4, будучи экспрессированным в дрожжах, проявлял сильный токсичный эффект на клеточный рост. Установление , нуклеотидной последовательности этого «летального» клона выявило присутствие нескольких мутаций, одна из которых располагалась в функциональном домене WW1 фермента.
Согласно литературным данным, первичная аминокислотная последовательность Nedd4 человека имеет высокий уровень гомологии с убиквитин-лигазой Rsp5 из Saccharomyces cerevisiae. Более того, обе лигазы принадлежат к одному и тому же семейству Nedd4-подобных йес/-содержащих убиквитин-лигаз и имеют одинаковую структурно-функциональную организацию. Рисунок 6А представляет схему аминокислотных последовательностей WW доменов Nedd4 (мутированная аминокислота WW1 домена подчеркнута) и Rsp5. Интересно то, что мутированный тирозин, входящий в состав WW1 домена Nedd4, является высоко консервативным аминокислотным остатком в ряду других WW доменов не только убиквитин-лигаз Nedd4 и Rsp5, но и WW-содержащих белков в целом, и играет критическую роль в вьшолнении функции белок-белковых взаимодействий этих модулей [180]. Принимая во внимание высокую степень идентичности и гомологии между Rsp5 и Nedd4, а так же схожие функциональные характеристики в клетках эукариот, мы сформулировали рабочую гипотезу, способную объяснить наблюдаемый летальный фенотип дрожжевых клеток, экспрессирующих мутантную форму человеческой убиквитин-лигазы Nedd4. Мы предположили, что убиквитин-лигаза человека Nedd4, экспрессированная в дрожжах, вероятно, способна регулировать некий жизненно важный ІІ5р5-зависимьш клеточный процесс, заменяя или ко-функционируя с природной убиквитин-лигазой Rsp5. Это означает, что, по крайней мере, один природный субстрат Rsp5, участник упомянутого процесса, будет также узнаваться и регулироваться человеческой формой фермента. При этом спонтанно полученая мутация в WW1 домене Nedd4, способна подавлять функционирование субстрата Rsp5, что приводит к торможению прогрессии жизненно важного процесса и к клеточной смерти.
Происходить это может при ингибировании активности природной убиквитин-лигазы Rsp5 активностью экзогенного человеческого фермента, несущего мутацию в WW1 домене. Другими словами, мы предполагаем, что рассматриваемая мутация в функционально важном домене WW1 убиквитин-лигазы человека Nedd4 должна иметь доминантно-негативную природу. Следует напомнить, что под доминантно-негативными подразумевают те мутации, которые преимущественно (доминантно) влияют на фенотип клетки посредствам производства дефектного белка или РНК, мешающего функционированию природного генного продукта (в нашем случае дрожжевой убиквитин-лигазы Rsp5) в той же самой клетке [174]. Полноразмерная кДНК копия Nedd4 дикого типа (Nedd4wt) была получена ОТ-ПЦР методом с использованием мРНК человеческих лимфоцитов и специфических праймеров, комплементарных 5 - и 3 - районам, кодирующим Nedd4. Полученная последовательность ДНК, была секвинирована (здесь и в дальнейшем: последовательности всех рекомбинантных плазм-ид. использованных в этой работе, были подтверждены севинированием) и клонирована в дрожжевой экспрессирующий вектор pYes под галактоза-индуцируемый промотор. Надо отметить преимущества использования такой векторной системы для изучения регуляции экспрессии генов в клетках Saccharomyces cerevisiae. При выращивании дрожжевых трансформантов в глюкозо-содержащей среде, изучаемый ген «молчит»; при замене сахара на галактозу, как источник углеводов, происходит индукция промотора, что приводит к включению транскрипции изучаемого гена. Таким образом, путем простой замены ростовой среды в дрожжевых культурах клеток, можно легко регулировать время индукции и, соответственно, уровень экспрессии изучаемого гена(ов). Примененный затем метод ПЦР-зависимого сайт-направленного мутагенеза позволил нам генерировать единичную аминокислотную замену структурно важного тирозина (Тугго8) на аланин (Ala2og) в составе WW1 домена убиквитин-лигазы Nedd4. В качестве матрицы мы использовали рекомбининтную плазмиду pYesNedd4wt; в качестве праймеров - комплементарные Nedd4 олигонуклеотиды с нуклеотидными заменами, соответствующими Туг208-»А1а208 (этот мутант мы будем обозначать как Nedd4WWl). Клетки дрожжевого штамма дикого типа InvScl были трансформированы плазмидами: pYesNedd4wt, pYesNedd4WWl и пустым вектором (pYes) в качестве негативного контроля. После трансформации, индивидуальные колонии были наработаны в глюкозо- содержащей жидкой среде и высажены при различной плотности клеток на глюкозо- и галактозо-содержащие агаризованные чашки. Клетки выращивались в течении 3-5 дней при температуре 30С. Как показано на рисунке 6В (линии 1-3), все трансформанты растут с одинаковой скоростью в отсутствие экспрессии Nedd4 (глюкозо-содержащая среда), что говорит об одинаковой эффективности трансформаций. Как и ожидалось, экспрессия pYesNedd4WWl драмматически замедляет дрожжевой рост по сравнению с клетками, содержащими pYesNedd4wt или вектор-контроль.
