Содержание к диссертации
Введение
1. Регуляция экспрессии генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ответ на изменение состава среды (обзор литературы) 11
1.1. Регуляция транскрипции у дрожжей 11
1.1.1. Семейство транскрипционных факторов GATA 11
1.1.2. Регуляторные некодирующие РНК у дрожжей 15
1.2. Генетический контроль метаболизма азота и фосфора у дрожжей 28
1.2.1. Регуляция метаболизма азота у дрожжей 28
1.2.2. Регуляция метаболизма фосфора у дрожжей 53
1.2.3. Взаимодействия метаболических путей в клетке дрожжей 66
2. Материалы и методы 74
2.1. Основные обозначения 74
2.2. Штаммы дрожжей и бактерий 75
2.3. Плазмиды 76
2.4. Праймеры 78
2.5. Среды и условия культивирования штаммов 80
2.6. Методы 81
3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Влияние источника азота на экспрессию гена РНОЗ и активность фермента КФ РпоЗр 84
3.2. Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена РНОЗ 86
3.3. Получение и анализ мутантов Ure+ у трансформантов YM954[pTLl] и [pSF28] 90
3.4. Анализ последовательности промотора гена РНОЗ 93
3.5. Поиск генов, компенсирующих эффект мутаций giibl и giib7 95
3.6. Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации gubl 99
3.7. Определение нуклеотидной последовательности гена RSP5 у мутантного штамма 5-YM954 104
3.8. Выделение плазмид, содержащих фрагменты ДНК, компенсирующих эффект мутации gubl, из генных библиотек дрожжей 105
4. Заключение 108
Выводы 112
Список литературы 113
- Регуляторные некодирующие РНК у дрожжей
- Взаимодействия метаболических путей в клетке дрожжей
- Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена РНОЗ
- Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации gubl
Регуляторные некодирующие РНК у дрожжей
С конца XX века у многих эукариотических организмов исследователи обнаруживают молекулы некодирующей РНК с регуляторной функцией. Их функция заключается в регуляции экспрессии генов путем воздействия на процессы транскрипции и трансляции генов. Некодируїощие РНК играют важную роль в процессах детерминации и пролиферации клеток, клеточной смерти у многоклеточных животных и растений. Процесс регуляции экспрессии генов с их участием называется РНК-сайленсингом. РНК-сайленсинг - это собирательный термин для обозначения нескольких процессов, в которых короткие молекулы РНК запускают репрессию гомологичных последовательностей. Это очень консервативные механизмы, выявленные у большой группы разных эукариотических организмов. Сперва были описаны «ко-супрессия» у растений (1990 г.) и «квеллинг» (подавление) у N. crassa (1996 г.), которые потом классифицировали как посттранскрипционный генный сайленсинг с участием комплементарных молекул РІЖ, распознающих определенные районы РНК и образующих с ней дуплексы. Родственный механизм был описан у Caenorhabditis elegans как «РНК-интерференция» (KNAi) (1998 г., 2000 г.). Ещё один механизм -это регуляция с помощью миРНК, специализированная ветвь РНК-сайленсинга, отделившаяся от РНК-интерференции. Молекулы миРНК кодируются в ДНК в виде характерных инвертированных повторов. После транскрипции таких повторов синтезируется большая молекула РНК-предшественника, образующая вторичную структуру в виде стебля и петли (Рис. 2). Далее из этого предшественника вырезается зрелая миРНК (2000-2001 гг., С. elegans). миРНК не обнаружены у одноклеточных эукариот (Almeida & Allshire, 2005).
Одна из ключевых функций РНК-сайленсинга - это формирование гетерохроматина, в котором гены «выключаются» из транскрипции. Такой механизм, названный транскрипционным генным сайленсингом (TGS), был показан в 2005 году у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. У этих микроорганизмов гетерохроматин находится в центромерных областях и содержит множественные повторы ДНК. Эти области важны для нормальной сегрегации хромосом в митозе. Большое количество когезиновых комплексов, связанных с молчащим хроматином, удерживают вместе сестринские хроматиды в области центромер после репликации вплоть до начала анафазы. Белки РНК-интерференции требуются для поддержания гетерохроматина в перицентромерной области. Кроме этого, такой же механизм репрессии действует в локусе типа спаривания. Считается, что в перицентромерной области и в локусе типа спаривания есть гомологичные участки. Если плотная структура гетерохроматина нарушена, с этих участков происходит транскрипция, в результате чего синтезируемые РНК образуют дуплексы и запускают механизм РНК-сайленсинга, что приводит к гетерохроматизации участков с гомологичными последовательностями. Образование гетерохроматина связано с привлечением белковых комплексов RITS (РНК-индуцированного транскрипционного сайленсинга). Этот комплекс обладает метилтрансферазной и деацетилазной активностями (Almeida & Allshire, 2005).
В 2008 году у дрожжей S. pombe были также выявлены короткие нкРНК, синтезируемые в промоторе гена Jbpl при удалении глюкозы из среды. Эти нкРНК запускают перестройки хроматина в промоторе, необходимые для связывания с ДНК двух транскрипционных активаторов (Hirota et al., 2008). Таким образом, показана позитивная регуляция экспрессии, в основе которой лежат процессы, противоположные TGS: РНК-полимераза II синтезирует «смысловую» нкРНК, которая вызывает раскрытие хроматина в области промотора и активацию транскрипции.
У дрожжей S. cerevisiae нет РНК-интерференции (нет аналогичных и гомологичных белков, участвующих в этом процессе) в том виде, в котором этот феномен был открыт и описан у высших эукариот. Но позже, чем у высших эукариот, были найдены некодирующие РНК, влияющие на экспрессию генов. Обстоятельный филогенетический анализ в 2008 году показал, что система РНК-интерференции - очень древняя, так что дрожжи изначально имели, но потом вторично потеряли гены, кодирующие компоненты этой системы. Те защитные механизмы, выполняемые системой интерференции, эволюционировали и превратились в разного рода регуляторные и защитные механизмы, внешне никак не схожие с оригиналом. Аналогичные механизмы у дрожжей, конечно, остались или же появились заново (Harrison et al., 2009). Выделяют следующие источники нкРНК у дрожжей:
1) Двунаправленная транскрипция. Многие промоторы могут запускать транскрипцию в обоих направлениях; выявлено большое количество кластеров недлинных нкРНК (около 250 нуклеотидов); большинство таких РНК считывается или начинает считываться в межгенной области между двумя тандемно расположенными генами, тогда обычно промотор второго гена работает в обоих направлениях, получается нкРНК в прямой ориентации (также далее - сенс-нкРНК, с-нкРНК) для второго гена и РНК в обратной ориентации для первого гена (также далее - антисенс-РНК, ас-нкРНК).
2) Синтез коротких сенс-нкРНК с альтернативных точек старта транскрипции, расположенных выше точки начала синтеза мРНК. Такие нкРНК не стабильны, они распознаются и уничтожаются.
3) Транскрипция сенс- и антисенс-нкРНК с разных скрытых внутренних элементов инициации транскрипции. Регуляция скрытой транскрипции, аналогично альтернативному сплайсингу, может быть механизмом синтеза альтернативных белковых продуктов. Сами альтернативные транскрипты могут влиять на экспрессию гена.
Наиболее распространен у дрожжей первый способ синтеза нкРНК. При этом в случае если нкРНК перекрывает соседний локус, то наблюдается обратная корреляция уровней экспрессии мРНК и этой нкРНК, что указывает на наличие регуляции со стороны нкРНК. В 2009 году обнаружили, что у одной трети всех рамок считывания сахаромицетов в З -области, свободной от гистонов, инициируются ас-нкРНК. Это означает, что большое число локусов имеет свои ас-нкРНК. Тем не менее, среди таких локусов существует не так много сходств в механизмах регуляции с участием этих перекрывающих ас-нкРНК (Xu et al, 2009).
Тем не менее, плоть до 2004 года отсутствовали какие-либо свидетельства о наличии некодирующих регуляторных РНК у дрожжей S. cerevisiae, которые, тем не менее, считаются модельным объектом для изучения клеточных процессов для всех эукариот. В то время по мере изучения транскриптома дрожжей, анализа библиотек кДНК и картирования сайтов связывания РНК-полимеразы II в геноме дрожжей накапливались данные о большом количестве некодирующих РНК, в частности антисмысловых РНК, функции которых ещё предстояло выяснять и ещё предстоит в будущем.
На тот момент единственным примером некодирующей РНК с известной функцией была SRG1 (SER3 regulatory gene 1), которая транскрибируется в межгенной области с альтернативного ТАТА-бокса (-558) выше промотора гена SER3 (ТАТА-бокс для мРНК в точке -108), кодирующего фосфоглицератдегидрогеназу, фермент биосинтеза серина (Martens et al., 2004). Эта РНК в присутствии серина препятствует связыванию активаторов с промотором, тем самым подавляя транскрипцию гена SER3. Это г/мс-регуляция, т.к. SRG1 транскрибируется с той же нити ДНК, где расположена мишень - промотор гена SER3, при этом нет гомологии между РНК и её мишенью. Этот механизм не соответствует РНК-интерференции, хорошо изученной у эукариот, когда есть гомология участков ДНК и РНК, а также /и/?анс-регуляция. Такое взаимодействие было называно транскрипционной интерференцией.
Взаимодействия метаболических путей в клетке дрожжей
Дрожжи S. cerevisiae, как все одноклеточные организмы, значительно зависят от состава среды и вынуждены стремительно реагировать на изменения окружающих условий. Качественные и количественные изменения среды приводят к координированному ответу метаболизма, изменению скорости роста и деления клетки, отбору наиболее приспособленных форм. Отсутствие в среде одного из макроэлементов — углерода, азота или фосфора - в короткий срок приводит к истощению его внутриклеточных резервов и появлению сигнала к запуску определенных метаболических путей. Активаторы таких путей могут воспринимать информацию от разных сигнальных каскадов, равно как и гены, кодирующие ключевые регуляторные белки, могут иметь в промоторных областях сайты связывания для активаторов или репрессоров разных метаболических путей и воспринимать сигналы о наличии или отсутствии разных биогенных элементов. В то же время одни и те же регуляторы могут быть активаторами одних путей и репрессорами других (Pina et al., 2003; Попова и др., 2000). У дрожжей изучена экспрессия практически всех генов в ответ на недостаток в среде отдельных биогенных элементов, таких как азот, углерод или фосфор. Анализ этих данных, а также генетических данные о механизмах регуляции метаболических путей позволили создать модель интегрального ответа клетки на изменение количества того или иного компонента среды (Самбук, 2005). Тем не менее, даже у столь хорошо изученного объекта, как дрожжи, после секвенирования генома остается ещё около половины идентифицированных ДНК-связывающих транскрипционных факторов, для которых не выявлены сайты связывания и/или не установлены физиологические функции (Chua et al., 2006). Можно предположить, что в дрожжевой клетке существует гораздо больше регуляторных каскадов и сетей, чем известно сейчас.
У дрожжей важную роль в передаче информации об условиях среды играют специфические сигнальные каскады, в центральных узлах которых располагаются протеинкиназы: киназы Torlp и Тог2р передают сигнал о типах источника азота в среде, киназа Snflp - о качестве источников углерода, киназа Pho85p - об уровне неорганического фосфата. Поскольку эти киназы имеют широкий набор субстратных белков для фосфорилирования, в этих узлах возможно перенаправление поступающего извне сигнала на различные транскрипционные факторы и гены-мишени (Cardenas et al., 1999; Gancedo, 1998; Johnston & Carlson, 1992).
В 2006 году был проведён анализ транскриптома дрожжей с помощью ДНК-биочипов, и была выявлена большая группа генов, уровень экспрессии которых каким-либо образом реагировал на изменение источника азота в среде, обработку клеток рапамицином на фоне дикого типа и двойного мутанта gln3 gatl (Scherens et al., 2006). В геноме S. cerevisiae были идентифицированы 392 гена, экспрессия которых зависела от качества источника азота в среде. Авторы распределили эти гены на четыре группы.
В первую группу, обозначенную 1-1, были объединены 91 ген, экспрессия которых была значительно индуцирована и после переноса клеток на среду с пролином, и после обработки рапамицином. Эти гены являются хорошо изученными NCR-чувствительными генами, кодирующими ферменты катаболизма азотистых соединений, транскрипционные регуляторы генов азотного метаболизма, белки-переносчики, белки протелиза и другие (GLN1, GDH2, PUT1, гены DAL, DUR; GAT1/GAT1, DAL80; CAN1, GAP1, МЕР2; РЕР4, PRB1 и другие). Кроме них, сюда были отнесены 28 генов с неизвестными пока функциями.
Вторая группа 1-2 также включает только гены, индуцируемые при азотном голодании, но степень их дерепрессии на пролине значительно меньше, чем генов группы 1-1. Было выявлено 20 таких генов, из которых пять - это известные гены ответа на стресс (DDR2, HSP104, HSP12, HSP26, TTR1).
Третья группа, R-1, объединяет 124 гена, экспрессия которых снижается в ответ на азотное голодание. В основном, сюда относятся гены аминокислотного и нуклеотидного метаболизма (гены семейств ADE, ILV, MET, HIS, LYS и других), белкового синтеза и транспорта.
Группа R-2 состоит из 157 генов, также подавляемых во время роста на среде с бедным источником азота. 119 генов задействованы в белковом синтезе, формировании рибосом. Среди остальных генов наиболее интересно присутствие в списке гена изозима рКФ РИ011.
Анализ промоторных областей всех выявленных генов показал, что только гены группы 1-1 обладают характерными для генов азотной регуляции последовательностями GATAAG и GAT(T/A)A. Это означает, что гены только этой группы являются прямыми мишенями для активаторов Gln3p и Gatlp, тогда как гены групп 1-2 и R-1, вероятно, лишь косвенно контролируются GATA-факторами. Это предположение было подтверждено при работе со штаммом gln3 gat J. В качестве варианта регуляторного фактора, через который передаётся репрессирующий сигнал от GIn3p и Gatlp к генам R-1, называется основная пермеаза Gaplp, активно синтезируемая при азотном голодании, росте на среде с пролином, а также аммонием. Показано, что мутация gapl приводит к ослаблению репрессии (Scherens et al., 2006). Для генов группы R-2 было достоверно показано, что их репрессия при азотном голодании никак не зависит от активности Gln3p, Gatlp и Ure2p (Scherens et al., 2006). Результаты этого эксперимента наглядно демонстрируют ключевую роль регуляторов метаболизма азота в координации клеточных процессов.
При изучении изменения уровней экспрессии 5690 генов дрожжей при использовании 21 типа источника азота были выявлены 506 генов, среди которых много генов азотного метаболизма, биосинтеза аминокислот, метаболизма серы и стресс-генов. 506 генов делятся на 8 кластеров. (1) 140 генов - из них 71 ген подвержен NCR. (2) и (3) 37 и 21 генов - объекты GAAC и транскрипционного фактора Gcn4p. Другие кластеры: 14, 119, 23, 6 и 30 генов. Замечено, что чем меньше кластер, тем специфичнее механизм регуляции генов. Из 506 генов 22 кодируют транскрипционные факторы, 15 -другие регуляторные белки. Из этих 37 регуляторов 7 участвуют в контроле метаболизма глюкозы, 8 вовлечены в контроль клеточного цикла, филаментозного и псевдогифального роста. 4 гена участвуют в стресс-ответе. 8 генов кодируют регуляторы метаболизма азота: пять регуляторов NCR-генов, GCN4, UGA3, ARO80. Последние два транскрипционных фактора активны при росте дрожжей на средах с ГАМК и триптофаном соответственно (Godard et al., 2007).
Метаболизм фосфора имеет другие известные точки пересечения регуляторных путей с метаболизмом азотсодержащих соединений. Показано, что на экспрессию генов метаболизма фосфора влияет количество доступного азота в среде. При недостатке азота нарушается транспорт фосфата в клетку, так как подавлена транскрипция генов некоторых пермеаз, активных при большой концентрации фосфора в среде. Уровень экспрессии генов РНОЗ и РН05 КФ S. cerevisiae также уменьшается при азотном голодании (Hardwick et al„ 1999; Gasch et al., 2000; Bradley et al, 2009). Механизмы такой регуляции подробно не изучены.
Анализ экспрессии всех генов дрожжей в зависимости от концентрации фосфата в среде был проделан в 2000-2001 годах (Ogawa et al., 2000). Было показано, что большое число генов активируется при недостатке фосфата. В первую очередь активируются гены метаболизма фосфора, условно объединенные в .РЯО-регулон, активатором транскрипции которых является Pho4p. Низкая концентрация фосфата ведет к активации генов оксидативного стресса, генов, продукты которых участвуют в укладке и деградации белков (HSP26, HSP42, HSP104 и другие). Были выявлены гены, уровень экспрессии которых снижается при недостатке фосфата. К их числу относятся гены, продукты которых участвуют в транскрипции {RP021), формировании рибосом, транспорте метаболитов, в том числе фосфатов (РН087), секреции и споруляции. Известно, что низкая концентрация фосфатов в клетке, активирующая экспрессию гена PHOS, приводит к репрессии генов азотного метаболизма, таких как GDH1, GDH2, GLN1 (Gasch et al., 2000; Ogawa et al, 2000). Механизмы этой репрессии не выяснены. Можно только предположить, что в роли репрессора выступает фактор Pho4p, активатор гена РН05 рКФ. Было показано, что в регуляцию экспрессии генов PUT на среде с пролином вовлечены киназа Pho85p и активатор Pho4p и что мутации в гене РН085 приводят к отсутствию роста штаммов на среде с пролином, тогда как двойные мутанты pho85 pho4 растут (Попова и др., 2000). То есть, по-видимому, фактор Pho4p прямо или опосредованно, регулируя экспрессию промежуточного гена, выступает в качестве репрессора генов PUT. Важно, что в этом случае в качестве циклина функционирует не Pho80p, а Рсібр (Huang & Brandriss, 2000).
Разработка системы селективного отбора мутантов с нарушенной регуляцией гена РНОЗ
Для изучения механизмов регуляции гена РНОЗ в ответ на изменение источника азота в среде и селекции регуляторных мутантов гораздо удобнее использовать не сам ген РНОЗ, который не даёт селективного преимущества, а репортерный ген ADE2, кодирующий фермент биосинтеза пуринов, фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилазу, под контролем промотора гена РНОЗ. При этом об уровне экспрессии гена РНОЗ будет свидетельствовать не только рост или отсутствие роста на среде без аденина, но и цвет колонии: красный или белый. Рост трансформантов на селективных средах разного состава, в том числе с разными источниками азота, может служить показателем активности промотора гена РНОЗ.
Поскольку копийность плазмиды может влиять на уровень синтеза белка, необходимо учитывать количество белков-регуляторов. В работе мы использовали два типа плазмид: мультикопийную плазмиду рТЫ, созданную ранее и содержащую репортерный ген ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ (Останин и др., 1988); а также центромерную плазмиду pSF28, полученную в ходе работы.
Схема конструирования плазмиды pSF28 представлена на рисунке 16-А. Для создания новой плазмиды был получен фрагмент ДНК «промотор РНОЗ - ген ADE2 - терминатор РН05» размером 2700 п.о. после обработки плазмиды рТЫ эндонуклеазой рестрикции PstI, который затем был встроен в вектор pFL36, обработанный этой же эндонуклеазой. Плазмида pSF28 имеет размер 9099 п.о. и содержит ген ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ.
На рисунке 16-Б представлены электрофореграммы (а) вектора и вставки после обработки эндонуклеазой рестрикции PstI, а также (б) плазмиды pSF28.
Штамм YM954 (фенотип Leu Ade") трансформировали плазмидами рТЫ и pSF28 и отбирали трансформанты на среде без лейцина. Суспензии трансформантов в исходной концентрации примерно 1х104 клеток/мл и в 10-кратном разведении (1x103 клеток/мл) высевали на твёрдые минеральные среды без аденина и лейцина и с разными источниками азота: глутамином, сульфатом аммония, глутаматом, пролином и мочевиной, - для качественной оценки уровня экспрессии репортерного гена ADE2 под контролем промотора гена РНОЗ на среде без аденина. В качестве контроля использовали исходный штамм YM954, который высевали на среды с добавлением аденина и лейцина. Оказалось (Рис. 17), что рост всех типов трансформантов замедляется на среде с мочевиной, в то время как рост дрожжей на средах с хорошими источниками азота (глутамин, аммоний), а также с глутаматом, не отличался от роста штамма YM954. При росте на среде с пролином, плохим источником азота, трансформанты, содержащие мультикопийную плазмиду, и трансформанты, содержащие центромерную плазмиду, демонстрировали нормальный рост, сравнимый с исходным штаммом YM954. Однако колонии трансформантов с центромерной плазмидой pSF28 были окрашены в розовый цвет вследствие накопления аминоимидазолрибозида.
По-видимому, рост дрожжей на среде с пролином и без аденина может обеспечиваться небольшим количеством фермента АИР-карбоксилазы, продукта гена ADE2. Таким образом, на среде с пролином мы видим зависимость активности АИР-карбоксилазы от дозы гена. Трансформанты с плазмидой pTL 1 не окрашены вследствие большого числа копий гена ADE2 в клетке. К сожалению, нам не удалось обнаружить существенную разницу в росте трансформантов на всех типах сред. По-видимому, для роста дрожжей достаточно минимального уровня экспрессии гена ADE2. Однако ослабленный рост на среде с мочевиной в качестве единственного источника азота предоставляет возможность использовать эту среду для поиска регуляторных мутантов.
Видно, что экспрессия гена РНОЗ зависит от типа источника азота. При этом ген РНОЗ не подвержен азотной катаболитной репрессии. В последнем случае на бедных источниках азота происходит активация соответствующих генов (Magasanik & Kaiser, 2002). Для гена РНОЗ показана специфическая регуляция: усиление экспрессии на среде с глутаматом и снижение уровня транскрипции на среде с пролином и мочевиной.
Идентификация гена, компенсирующего эффект мутации gubl
Мутанты комплементационной группы giibl не растут на среде с глутаматом, и это нарушение роста не компенсируется введением в клетки дополнительных копий генов транскрипционных факторов азотного метаболизма, а также введением гена GZF3 в составе центромерной плазмиды.
Для локализации мутации gubl в геноме дрожжей был использован метод гаплоидизации. Штамм YM954 несет ряд мутаций, которые являются удобными селективными маркерами разных хромосом. Мутации ade2 и his3 расположены в хромосоме XV, игаЗ - в хромосоме V, 1еи2 - в хромосоме III, lys2 - в хромосоме II, trpl - в хромосоме IV. Для выяснения возможной локализации мутации gubl в данных хромосомах провели скрещивание мутантов 1, 4, 5, 6-YM954 (Glu") со штаммом 203-D579 (Glu+). Генотип штамма представлен в таблице 1. У диплоидов, гетерозиготных по мутации gubl и мутациям ade2, игаЗ, his3, Ieu2, lys2, trpl, индуцировали гаплоидизацию с помощью беномила, и высевали их на селективные среды, чтобы отобрать ауксотрофные клоны, потерявшие какую-либо одну хромосому или весь гаплоидный набор хромосом. Анеуплоидные колонии отпечатывали на среду с глутаматом в качестве источника азота и анализировали частоту появления у анеуплоидов признака Glu" на фоне ауксотрофностей. Колонии отбирали также на среде с фтороротовой кислотой (Ura"), а также по красному цвету колоний (Ade).
Высокая частота совместного появления клонов Ura"Glu" (0,904±0,067; р = 0,95; / — 3; ts, = 3,182) свидетельствует о том, что мутация gubl локализована в хромосоме V (Рис. 23). Напротив, частота появления клонов Ade Glu" ничтожно мала: из 124 отобранных клонов Ade" ни один не оказался Glu", что указывает на отсутствие сцепления gubl и маркера ADE2 (в хромосоме XV).
Для идентификации мутации giibl штамм 5-YM954 трансформировали плазмидами генной библиотеки «Yeast Genomic Tiling Collection», покрывающими всю последовательность хромосомы V дрожжей S. cerevisiae. Были использованы 59 плазмид библиотеки: №№ 385, 387-391, 393-398, 401-412, 415, 418-420, 422-438, 440-446, 449, 452-457. Трансформанты отбирали на селективной среде без лейцина и анализировали восстановление фенотипа Glu+ на минеральной среде с глутаматом в качестве единственного источника азота. Было показано, что восстановление роста на среде с глутаматом у штамма 5-YM954 происходило при трансформации плазмидой № 434. Эта плазмида содержит фрагмент хромосомы V с генами: YCK3, DSE1, RSP5, NSA2, LCP5, YER128W, РАК1.
Ген YCK3 кодирует мембранную протеинкиназу, участвующую в регуляции слияния вакуолей. Ген DSE1 кодирует белок, специфичный для дочерних клеток, делеция которого приводит к нарушениям цитокинеза после деления. Ген NSA2 кодирует белок, участвующий в созревании молекул 27S пре-рРНК. Ген LCP5 кодирует белок, необходимый для созревания 18S рРНК. Рамка считывания YER128W кодирует белок неизвестной функции. Ген РАК1, представленный на плазмиде без 3 -области, кодирует серин-треониновую протеинкиназу, участвующую в регуляции метаболизма углерода. (Saccharomyces Genome Database, URL: http://www.yeastgenome.org).
Ген RSP5 кодирует убиквитин-лигазу ЕЗ, участвующую в большом количестве внутриклеточных процессов: от модификации гистонов до убиквитин-опосредованного эндоцитоза и деградации белков. В этом ряду генов RSP5 представляет для нас особый интерес, поскольку известно, что фактор Rsp5p вовлечен в передачу сигнала о типе источника азота транскрипционному GATA-фактору Gln3p (Tate et al., 2006). Rsp5p регулирует уровень мембранных пермеаз аммония и аминокислот в зависимости от типа источника азота в среде. Лишние белки убиквитинируются и удаляются из мембраны эндоцитозом. Известно, что убиквитин-лигазный комплекс Rsp5/Bull/Bul2 участвует в активации белка Gln3p при его ядерной локализации (Crespo et al.,2004). Кроме того, мутации в гене RSP5 приводят к нарушению морфологии клеток дрожжей (Hardwick et al., 1999; Сох et al., 2004). Поэтому из всех перечисленных генов плазмиды № 434 наиболее вероятным местом локализации мутации gubl является ген RSP5, кодирующий убиквитин-лигазу дрожжей S. cerevisiae.
Для доказательства этой гипотезы мы клонировали ген-кандидат RSP5 в центромерный вектор pRS316 (Рис. 13) и создали плазмиду pRSP321 [RSP5 CEN URA3]. Схема конструирования плазмиды pRSP321 представлена на рисунке 24-А. На рисунке 24-Б представлена электрофореграмма плазмиды после обработки эндонуклеазами рестрикции.
Плазмидой pRSP321 трансформировали штамм 5-YM954 с мутацией gubl. Трансформанты 5-yM954[pRSP321] отбирали на среде без урацила с сульфатом аммония в качестве источника азота и отпечатывали для проверки восстановления фенотипа Glu+ на среду с глутаматом. Одновременно высевали на твёрдую минеральную среду без урацила с глутаматом суспензии трансформантов в исходной концентрации примерно 1x10 клеток/мл и в 10-кратном разведении (1x103 клеток/мл). Было показано, что присутствие в клетках штамма 5-УМ954 плазмиды pRSP321 с дополнительной копией гена RSP5 приводит к восстановлению способности роста на середе с глутаматом у штамма с мутацией gubl (Рис. 25). Таким образом, мы подтвердили, что ген RSP5 компенсирует мутацию gubl и, возможно, мутация затрагивает последовательность гена RSP5 убиквитин-лигазы ЕЗ дрожжей-сахаромицетов.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
