Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Задачи исследования 8
1.3. Научная новизна результатов исследования 9
1.4. Практическая ценность 9
1.5. Апробация работы 9
2. Обзор литературы 10
2.1. История изучения РНК-интерференции 10
2.2. Современные представления о механизме РНК-интерференции 15
2.3. Эндогенные короткие РНК у эукариот 21
2.4. ПроцессингдцРНК-образование коротких РНК 22
2.5. Разрезание мРНК и подавление трансляции, направляемое короткими РНК 24
2.6. Репрессия хроматина, направляемая короткими РНК 26
2.6.1. Общие представления о структуре хроматина 26
2.6.2. Короткие РНК и формирование гетерохроматина у дрожжей 27
2.6.3. РНК-интерференция и подавление транскрипции генов у растений 30
2.6.4. Косупрессия у растений 31
2.6.5. Метилирование ДНК и аппарат РНК-интерференции 33
2.6.6. РНК-сайленсинг на уровне хроматина у животных 37
2.7. РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов 40
2.8. Заключение 43
3. Материалы и методы 45
3.1. Биологические материалы 45
3.2. Использованные праймеры 45
3.3. Линии Drosophila melanogaster и генетические скрещивания 47
3.4. Трансформация эмбрионов Drosophila 49
3.5. Гистохимическая окраска органов на активность Р-галактозидазы 51
3.6. Количественное определение активности Р-галактозидазы 51
3.7. Стандартные молекулярно-биологические методы 52
3.8. Создание Ste-lacZ конструкций 52
3.9. Лигирование ДНК и трансформация клеток Е. coli 53
3.10. Выделение плазмидной ДНК 53
3.11. Выделение ДНК из легкоплавких агарозных гелей 54
3.12. Выделение геномной ДНК Drosophila 54
3.13. Выделение тотальной РНК Drosophila 55
3.14. Саузерн-блот гибридизация с геномной ДНК 56
3.15. ОТ-ПЦР 58
3.16. Полуколичественный ПЦР 58
3.17. Анализ доступности хроматина для ДНКазы I 59
3.18. Хроматин иммунопреципитация (Х-СЫР) 60
3.19. Форез ПЦР-продуктов в акриламидном денатурирующем геле 62
3.20. Т7 транскрипция молекул дцРНК 63
3.21. Процессинг дцРНК в лизатах семенников и культуры KneioK Drosophila melanogaster 64
3.22. Форез РНК в акриламидном денатурирующем геле 65
4. Результаты 66
4.1. Мутации в генах РНК-интерференции рШ и spn-E вызывают дерепрессию ретротранспозонов в терминальных тканях 66
4.2. Антисмысловая транскрипция copia не регулируется аппаратом РНК- интерференции 72
4.3. Мутация spn-E вызывает увеличение доступности хроматина ретротранспозонов к ДНКазеІ 73
4.4. Дерепрессия ретротранспозонов сопровождается ацетилированием гистона НЗ и связыванием транскрипционных комплексов с промоторами 77
4.5. Удаление повторов Su(Ste) приводит к возрастанию количества несплайсированных транскриптов Stellate 83
4.6. Повторы Su(Ste) направляет компактизацию хроматина генов Stellate 88
4.7. Регуляция экспрессии гена Stellate повторами Su(Ste) осуществляется при замене собственного промотора Stellate на гетерологичный 90
4.8. Гомология с Su(Ste) в транскрибируемой области генов Stellate необходима для осуществления репрессии 92
4.9. «Неканонический» размер siPHK Su(Ste) не определяется особенностями процессинга дцРНК в семенниках 95
5. Обсуждение результатов 97
5.1. Регуляция экспрессии ретротранспозонов с помощыюРНК- интерференции в терминальных и соматических тканях 97
5.2. Участие РНК-интерференции в репрессии ретротранспозонов на уровне хроматина 101
5.3. Подавление транскрипции генов Stellate за счет дцРНК Su(Ste) 106
5.4. Различная регуляция кластеров ^/еЯя/е^асположенных в эу- и гетерохроматине 108
5.5. Значение транскрибируемой области генов Stellate .для их регуляции 110
5.6. Различные типы коротких РНК у дрозофилы 111
Выводы 115
- Современные представления о механизме РНК-интерференции
- РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов
- Хроматин иммунопреципитация (Х-СЫР)
- Регуляция экспрессии гена Stellate повторами Su(Ste) осуществляется при замене собственного промотора Stellate на гетерологичный
Введение к работе
В последнее время активно изучаются функции некодирующих РНК в регуляции экспрессии генов. Значительная часть генома эукариот транскрибируется с образованием РНК, не являющихся матрицами для синтеза белков. Одной из разновидностей некодирующих РНК являются молекулы двуцепочечной РНК (дцРНК) и образуемые в результате их процессинга «короткие РНК». дцРНК подавляют экспрессию гомологичных по нуклеотидной последовательности генов в ходе процесса РНК-интерференции (Fire et al., 1998). Способность дцРНК специфично репрессировать гомологичные гены широко применяется в настоящее время как метод функциональной геномики. В этом случае используются «экзогенные» дцРНК или короткие РНК, которые могут быть синтезированы in vitro или же транскрибироваться с интегрированных в геном конструкций (Harmon, 2002; Hannon, Rossi, 2004). Регуляторная роль эндогенных молекул дцРНК и коротких РНК долгое время оставалась невыясненной. Работы последних нескольких лет показали, что короткие РНК участвуют в регуляции экспрессии множества генов организма, а также в репрессии мобильных элементов и поддержании функциональной структуры протяженных участков генома (Hannon, 2002; Аравин и др., 2002; Bartel, 2004; Lippman, Martienssen, 2004; Mello, Conte, 2004).
Молекулярный механизм РНК-интерференции представляется следующим образом. Длинные молекулы дцРНК нарезаются в клетке нуклеазами семейства Dicer на короткие РНК длиной около 20-25 нуклеотидов (siPHK — short interfering RNA). Затем siPHK могут включаться в состав РНП комплекса RISC (RNA induced silencing complex), который обеспечивает взаимодействие одной из цепей короткой РНК с комплементарными молекулами РНК, присутствующими в цитоплазме клетки, в частности, мРНК (Hannon, 2002; Аравин и др., 2002; Meister, Tuschl, 2004). Комплекс RISC осуществляет разрезание молекул мРНК-мишени в участках, полностью комплементарных коротким РНК, в результате чего мРНК деградирует. Механизм разрезания мРНК с помощью коротких РНК показан у большинства групп эукариот, включая животных, растения и микроорганизмы (Hannon, 2002; Аравин и др., 2002). Наряду с постгранскрипционной репрессией мРНК в цитоплазме, короткие РНК могут подавлять транскрипцию гомологичного гена в ядре. РНП комплекс, содержащий siPHK, обозначемый в этом случае как RITS (RNA-induced initiation of transcriptional silencing) (Verdel et al., 2004), вызывает локальное изменение структуры хроматина (Stevenson, Jarvis, 2003; Lippman, Martienssen, 2004). У делящихся дрожжей S. pombe короткие РНК индуцируют метилирование лизинов К9 гистона НЗ в хроматине гомологичных генов (Volpe et al., 2002). У растений короткие РНК вызывают репрессию хроматина комплементарных им генов, происходящую как за счет метилирования гистонов, так и в результате метилирования цитозинов в ДНК (Mette et al., 2000). Возможность воздействия коротких РНК на хроматин гомологичных генов у животных остается мало изученной.
Центральным компонентом всех РНП комплексов, содержащих короткие РНК (RISC, RITS), являются белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004; Verdel et al., 2004). Помимо Ago, в формировании этих комплексов участвует РНК-хеликазы и другие РНК-связывающие белки (Meister, Tuschl, 2004).
У эукариот обнаружены эндогенные siPHK, соответствующие последовательностям мобильных элементов и гетерохроматиновых повторов (Djikeng et al., 2001; Llave et al., 2002a; Ambros et al., 2003; Aravin et al., 2003; Sijen, Plasterk, 2003; Xie et al., 2004). Мобильные элементы часто могут транскрибироваться как в прямом, так и в обратном направлении, что приводит к образованию ддРНК. Противоположенное направление транскрипции может определяться собственными «антисмысловыми» промоторами транспозонов или находящимися рядом с инсерцией элемента внешними промоторами (Lankenau et al., 1994). Источником дцРНК является также гетерохроматин, в котором мобильные элементы накапливаются в больших количествах и могут располагаться во взаимопротивоположенной ориентации (Lippman et al., 2004). Наличие дцРНК, гомологичных мобильным элементам, позволяет клеточному аппарату РНК-интерференции подавлять их экспрессию, которая зачастую вредна для организма, поскольку приводит к транспозициям и, как следствие, мутациям и хромосомным перестройкам (Tijsterman et al., 2002; Гвоздев, 2003). Нарушение системы РНК-интерференции у различных организмов, приводит к дерепрессии мобильных элементов, в том числе, ретротранспозонов у Drosophila melanogaster (Aravin et al., 2001). Однако остается невыясненным, участвует ли аппарат РНК-интерференции в репрессии хроматина ретротранспозонов у дрозофилы, или подавление экспрессии происходит исключительно на посттранскрипционном уровне — в результате деградации транскриптов.
Помимо подавления экспрессии мобильных элементов, эндогенные siPHK участвуют в регуляции собственных генов D. melanogaster. В семенниках самцов дрозофилы дцРНК, образующаяся в результате симметричной транскрипции повторов Su(Ste), направляет репрессию гомологичных повторов генов Stellate (Aravin et al., 2001). Удаление повторов Su(Ste) вызывает гиперэкспрессию генов Stellate и накопление в клетках сперматоцитов белковых агрегатов, представляющих, по-видимому, продукт трансляции Stellate, что приводит к стерильности самцов (Palumbo et al., 1994; Bozzetti et al., 1995). Дерепрессия генов Stellate, происходящая в результате делеции локуса Su(Ste), сопровождается исчезновением коротких РНК Su(Ste) (Aravin et al., 2001). Данных о том, каким образом короткие РНК Su(Ste) подавляют экспрессию генов Stellate: на посттранскрипционном уровне, или же на уровне транскрипции, не было получено.
1.2. Задачи исследования
Целью настоящей работы являлось исследование возможной роли аппарата РНК-интерференции в подавлении транскрипции и формировании репрессивной структуры хроматина ретротранспозонов и повторенных генов Stellate. Были поставлены следующие задачи: 1. Сравнить уровень экспрессии ретротранспозонов при мутациях в генах РНК-интерференции в терминальных и соматических тканях D. melanogaster. 2. Сравнить структуру хроматина ретротранспозонов в норме и при нарушении аппарата РНК-интерференции. 3. Проверить возможную роль повторов Su(Ste) в регуляции транскрипции генов Stellate. 4. Выяснить значение промотора и транскрибируемой области генов Stellate для осуществления их репрессии повторами Su(Ste).
1.3. Научная новизна результатов исследования
Показана роль гена piwi, кодирующего консервативный белок семейства Argonaute, в регуляции экспрессии ретротранспозонов D. melanogaster. Обнаружено, что механизм РНК-интерференции направлен на репрессию ретротранспозонов, преимущественно, в клетках зародышевого пути, но не в соматических тканях. Впервые продемонстрировано участие аппарата РНК-интерференции в формировании «молчащей» структуры хроматина ретротранспозонов у животных. Показано, что повторы Su(Ste), транскрибируемые с образованием дцРНК, подавляют транскрипцию гомологичных генов Stellate. В то же время обнаружено, что репрессия генов Stellate может происходить в отсутствии их собственного промотора, тогда как наличие гомологии с повторами Su(Ste) в транскрибируемой области Stellate необходимо для осуществления регуляции. Полученные данные впервые показывают роль «естественной» РНК-интерференции в регуляции транскрипции генов у животных.
1.4. Практическая ценность Полученные в работе данные позволяют приступить к детальному исследованию механизма модификации структуры хроматина, индуцируемой короткими РНК в терминальных тканях дрозофилы. Результаты исследования механизмов РНК-интерференции на D. melanogaster могут быть распространены на клетки человека и использованы в биомедицинских исследованиях.
1.5. Апробация работы Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и на кафедре Молекулярной биологии МГУ им. М.В. Ломоносова. Данные, представленные в работе, докладывались на 44 и 45 конференциях по дрозофиле (США, 2003, 2004), на конференциях, посвященных механизмам РНК-интерференции (Keystone symposia, США, 2002, 2003, 2004), на конференции «Современные проблемы молекулярной генетики» (ИМГ, 2002), на конференции по изучению гетерохроматина (Италия, 2003), на 3-ом Биохимическом Съезде (Санкт-Петербург, 2002) и на других конференциях (Киев, 2003: Пушино, 2003; Москва, 2004).
Современные представления о механизме РНК-интерференции
Общая модель механизма РНК-интерференции предполагает существование двух основных стадий (рис. 1). На первой стадии длинные молекулы дцРНК подвергаются в цитоплазме клеток процессингу нуклеазами семейства Dicer с образованием коротких РНК-дуплексов длиной 20-25 нт. (размер коротких РНК варьирует в зависимости от организма и типа коротких РНК). Короткие РНК-дуплексы, как уже упоминалось, имеют структурные особенности, которые задаются белком Dicer и строго необходимы для функциональной активности коротких РНК: одноцепочечные выступающие динуклеотидные 3 ОН концы и фосфорилированные 5 концы (Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001a). На второй стадии происходит расплетание дуплекса коротких РНК и одна из цепей включается в состав эффекторных РНП-комплексов. Короткая РНК в составе РНП-комплекса обнаруживает в клетке комплементарные ей нуклеиновые кислоты (мишени), после чего эффекторный комплекс катализирует ту или иную реакцию, направленную на подавление экспрессии мишени (рис. 1). Можно выделить 3 основных разновидности эффекторных РНП-комплексов, содержащих короткие РНК: - комплекс RISC, осуществляющий разрезание РНК-мишени (которой может быть как мРНК, так и любая другая одноцепочечная РНК); - комплекс, направляющий подавление трансляции мРНК - также обозначается как RISC; а в том случае, если содержит микроРНК, обозначается как микроРНП; - комплекс RITS, осуществляющий подавление транскрипции и репрессию хроматина. Комплексы RISC и микроРНП функционируют в цитоплазме, а комплекс RITS -в ядре (рис. 1). Во всех случаях специфичность действия эффекторных комплексов определяется спариванием комплементарных нуклеиновых кислот. При посттранскрипционном механизме репрессии (комплексы RISC и микроРНП) спаривание происходит между короткой РНК и комплементарным участком в РНК-мишени. В случае же комплексов RITS, обнаруживающих гомологичный локус в геноме, природа комплементарного взаимодействия остается невыясненной. Возможны два варианта того, как короткая РНК в составе RITS комплекса может «узнать» гомологичный ген (Verdel et al., 2004). Первый механизм предполагает гибридизацию молекулы короткой РНК непосредственно с ДНК. Второй возможный способ состоит в том, что короткая РНК взаимодействует с новообразованной (насцентной) РНК в ходе ее транскрипции или сразу после. Если в этот момент насцентная РНК находится в пространственной близости от кодирующего ее гена, то RITS комплекс может привлекать белки, осуществляющие репрессию хроматина этого гена и, следовательно, подавление транскрипции.
Причины, определяющие, в какой из трех типов эффекторных комплексов будет включаться короткая РНК после образования, остаются мало изученными. Мультибелковые эффекторные комплексы (RISC, микроРНП и RITS) различны по составу входящих в них белков, однако все они содержат белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Okamura et al., 2004; Sigova et al., 2004; Verdel et al., 2004; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004). Гены, кодирующие белки этого семейства, были идентифицированы в первых генетических скринингах компонентов РНК-интерференции, косупрессии и других процессов подавления генной экспрессии с участием дцРНК («РНК сайленсинга») у эукариот (Tabara et al., 1999; Fagard et al., 2000; Carmell et al., 2002; Catalanotto et al., 2002). На настоящий момент консервативные белки семейства Argonaute обнаружены у архей и практически у всех эукариот, за исключением почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Мутации в генах, кодирующих Argonaute, нарушают дцРНК-зависимую деградацию мРНК (Hammond et al., 2001; Liu et al., 2004; Williams et al., 2002; Tabara et al., 1999; Okamura et al., 2004; Sigova et al., 2004), подавление трансляции при помощи коротких РНК (Bartel, 2004; Okamura et al., 2004; Grishok et al., 2001), а также вызванное короткими РНК подавление транскрипции (Fagard et al., 2000; Volpe et al., 2002; Zilberman et al., 2003). Различные группы эукариот имеют свои уникальные особенности аппарата РНК-интерференции. В частности, различия состоят в присутствии тех или иных эффекторных комплексов (таблица 1). Механизм разрезания мРНК с участием комплекса RISC показан у всех основных эукариотических модельных объектов (Tuschl et al., 1999; Elbashir et al., 2001a; Sigova et al., 2004). Механизм подавления трансляции обнаружен у большинства эукариот, но не у делящихся дрожжей S. pombe. Возможность подавления транскрипции генов с помощью дцРНК прямо показана, на данный момент, лишь для растений, S. pombe и на культуре клеток человека. На этих объектах было продемонстрировано, что образование коротких РНК, соответствующих активно транскрибируемому гену, приводит к снижению транскрипции, которое коррелирует с увеличением количества метилированных гистонов и, в случае растений и человека, с метилированием ДНК (Schramke, Allshire, 2003; Zilberman et al., 2003; Kawasaki, Taira, 2004). Прямой индукции транскрипционной репрессии при помощи гомологичной дцРНК у нематоды и дрозофилы показано не было. Тем не менее, ряд косвенных данных свидетельствует о том, что аппарат РНК-интерференции у этих организмов может влиять на структуру хроматина некоторых типов последовательностей (Pal-Bhadra et al., 2004; Grishok et al., 2005; Robert et al., 2005). Существуют некоторые другие аспекты механизма РНК-интерференции, характерные лишь для некоторых групп эукариот. Так, у С. elegans было обнаружено явление распространения сигнала РНК-интерференции, состоящее в том, что подавление экспрессии гена может происходить в любой ткани независимо от того, в какую ткань исходно была инъецирована дцРНК (Winston et al., 2002; Feinberg, Hunter, 2003). Например, введение в мышечную ткань дцРНК, соответствующей последовательности мРНК зеленого белка GFP, приводит к подавлению экспрессии трансгена в нервной ткани. Явление распространения сигнала РНК-сайленсинга известно также у растений (Voinnet, Baulcombe, 1997; Baulcombe, 2004). У С. elegans был идентифицирован трансмембранный белок SID-1, формирующий, по-видимому, активные межклеточные каналы для транспорта дцРНК (Winston et al., 2002). В то же время, у D. melanogaster такого механизма обнаружено не было, то есть у дрозофилы РНК-интерференция происходит «автономно» - только в тех клетках, в которых присутствует дцРНК, инициирующая репрессию (Roignant et al., 2003). Интересно, что введение в геном дрозофилы трансгена, кодирующего белок SID-1 из С. elegans, позволяет осуществлять транспорт дцРНК между клетками и обеспечивает распространение сигнала РНК-интерференции у дрозофилы (Feinberg, Hunter, 2003). При РНК-интерференции у S. ротЪе, С. elegans и растений показана возможность амплификации сигнала, осуществляемой клеточными РНК-зависимыми РНК-полимеразами (RdRp - RNA-directed RNA polymerase), кодируемыми в геномах этих организмов (Smardon et al., 2000; Dalmay, et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Volpe et al., 2002). RdRp способна синтезировать дцРНК на матрице однонитевой РНК. В некоторых случаях в качестве затравки для синтеза RdRp может использовать антисмысловую короткую РНК (Sijen et al., 2001а; Vaistij et al., 2002).
Продукты реакции удлинения сами также представляют собой дцРНК. В соответствии с этим, они должны подвергаться дальнейшему процессингу с образованием "вторичных" молекул коротких РНК. Действительно, образование вторичных коротких РНК, не гомологичных исходной дцРНК, было показано при РНК-интерференции у С. elegans (Sijen et al., 2001a). При этом было отмечено, что вторичные короткие РНК соответствуют исключительно 5 области относительно исходного сегмента дцРНК, что полностью соответствует модели праймирования мРНК первичными короткими РНК. Существование вторичных коротких РНК было доказано в элегантных экспериментах на С. elegans (Sijen et al., 2001a; Alder et al., 2003). Была обнаружена способность дцРНК осуществлять деградацию некомплементарньгх последовательностей. При наличии в организме трансгена, состоящего из двух сегментов, инъекция дцРНК к одному из них приводила к деградации мРНК гена, содержащего только один из сегментов, который не соответствовал по последовательности инъецированной дцРНК. Этот феномен был назван транзитивной (transitive) РНК-интерференцией (Sijen et al., 2001а; Alder et al., 2003). Транзитивная РНК-интерференция имеет определенную направленность: деградации подвергается только сегмент, расположенный 5 (upstream), относительно исходной дцРНК, но не 3 (downstream). В то же время гены, кодирующие RdRp, не обнаружены в геномах дрозофилы и млекопитающих. Для этих организмов показано отсутствие возможности амплификации сигнала и транзитивной РНК-интерференции (Schwarz et al., 2002)
РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов
Говоря о репрессии мобильных элементов, нужно отметить, что в некоторых случаях коэволюция мобильного элемента и хозяина может приводить к доместикации мобильных элементов и их использования. Так, у дрозофилы транспозоны НеТ-А и TART используются для поддержания длины концов хромосом, выполняя функцию аналогичную теломеразе млекопитающих (Pardue, DeBaryshe, 1999; Pardue, DeBaryshe, 2000; Pardue, DeBaryshe, 2003). Однако, в большинстве случаев, активная экспрессия мобильных элементов неблагоприятна для организма. Мобильные элементы при перемещениях в новые сайты генома могут изменять эффективность транскрипции близлежащих генов; случайно встраиваться в клеточные гены и приводить к мутациям; вызывать хромосомные перестройки, например, гомологичную рекомбинацию между копиями мобильного элемента (Kazazian, 2004). Разумеется, активность мобильных элементов, приводящая в результате к уменьшению жизнеспособности хозяина, с эволюционной точки зрения не выгодна ни хозяину-клетке, ни самому мобильному элементу. Таким образом, для клетки и, собственно, для самого мобильного элемента, как «эгоистичного» генетического элемента, встает проблема регуляции его экспрессии. Представления о роли РНК-интерференции в подавлении транспозиций мобильных элементов основываются на факте, что мутации в генах, идентифицированных в первых скринингах на РНК-интерференцию у С. elegans, приводили к возрастанию частоты перемещений ДНК-транспозонов (Tabara et al., 1999; Ketting et al., 1999). Впоследствие было обнаружено, что мутации, нарушающие РНК-интерференцию у различных животных сопровождаются дерепрессией мобильных элементов, причем как ДНК-транспозонов, так и ретроэлементов (Stapleton et al., 2001; Aravin et al., 2001; Svoboda et al., 2004; Vagin et al., 2004; Kalmykova et al., 2005). Та же закономерность была обнаружена у растений (Zilberman et al., 2003; Xie et al., 2004) и микроорганизмов (Shi et al., 2004, Wu-Scharf et al., 2000). идентифицировано 7 генов, 5 из которых отвечают и за контроль перемещений ДНК- транспозона Tel (Tabara et al., 1999; Ketting et al., 1999; Sijen, Plasterk, 2003). Эти данные показывают, что искусственно индуцированная РНК-интерференция и репрессия мобильных элементов происходят по схожему, но не идентичному механизму.
Интересно, что Tel может перемещаться в соматических тканях даже при интактном аппарате РНК-интерференции. Однако в терминальных тканях, где обнаружены гомологичные ему siPHK (Sijen, Plasterk, 2003), Tel активируется только при нарушении системы РНК-интерференции. Подавление экспрессии Tel с помощью коротких РНК происходит исключительно на посттранскрипционном уровне - в результате деградации РНК (Ketting, Plasterk, 2000; Sijen, Plasterk, 2003), но не путем репрессии хроматина (Grishok et al., 2000; Sijen, Plasterk, 2003). Процесс посттранскрипционного подавления экспрессии мобильных элементов был также продемонстрирован у хламидомонады (Wu-Scharf et al., 2000). Мутация в гене, кодирующем DEAH-box РНК-хеликазу, увеличивает частоту перемещений ретротранспозона ТОСІ и ДНК-транспозонов. Кроме того, эта мутация приводит к дерепрессии одиночного трансгена. Как для трансгена, так и для ТОС1 были обнаружены антисмысловые РНК. Это позволяет предполагать, что репрессию инициирует дцРНК. Посттранскрипционный характер подавления экспрессии трансгена и ТОС1 был показан при использовании ингибитора транскрипции — актиномицина D. В отличие от С. elegans и хламидомонады, репрессия мобильных элементов у растений и делящихся дрожжей происходит преимущественно на уровне транскрипции. Инсерции транспозонов, зачастую интегрированных друг в друга (Lippman et al., 2004), составляют значительную часть гетерохроматина у Arabidopsis, который располагается в центромерных и теломерных районах хромосом. Помимо этого, в хромосомах растений гетерохроматин образует небольшие сильно красящиеся интеркалярные участки — вздутия (knobs). Около 90 процентов клонированных эндогенных siPHK Arabidopsis соответствуют последовательностям транспозонов и участкам гетерохроматина (Xie et al., 2004; Llave et al., 2002). Такие siPHK имеют размер 24-26 нт. и принадлежат к классу «длинных siPHK», которые, как уже упоминалось, участвуют в подавлении экспрессии генов на уровне транскрипции. Количество siPHK, соответствующих определенным участкам интеркалярного гетерохроматина, положительно коррелирует со степенью метилирования как ДНК, так и гистонов (наличие МеШз(К9)) в этих районах (Lippman et al., 2004). Показано, что мутация в гене DDM1 приводит к исчезновению siPHK интеркалярного гетерохроматина, уменьшению количества метилированных цитозинов ДНК и гистонов МеШз(К9), а также к возрастанию количества МеНз(К4) модификации, характерной для активного хроматина (Lippman et al., 2004). Сайленсинг транспозонов на уровне хроматина у растений поддерживается не только с помощью РНК-интерференции, но и в результате наследуемого в ряду клеточных поколений метилирования ДНК, не зависящего от коротких РНК. Мутации в генах, кодирующих белки Argonaute, приводят к дерепрессии и снятию метилирования лишь некоторых мобильных элементов у Arabidopsis (Zilberman et al., 2003; Lippman et al., 2003; Xie et al., 2004). Вызванное дефектом Dicer 3 или RdRp отсутствие siPHK, соответствующих последовательностям транспозонов, может не сопровождаться их активацией (Xie et al., 2004). Мутации в генах белков хроматина (DDM1, МЕТІ) приводят к более масштабной дерепрессии транспозонов, чем мутации по белкам РНК-интерференции (Lippman et al., 2003; Lippman et al., 2004; Hirochika et al., 2000; Gendrel et al., 2002). Механизм РНК-интерференции, направленный на подавление экспрессии мобильных элементов, может регулировать также транскрипцию собственных генов организма. Это реализуется в тех случаях, когда репрессированный при участии siPHK мобильный элемент располагается в регуляторной области гена или вблизи от него. Так, у S. pombe мутации Argonaute, Dicer и RdRp, приводят к активации группы генов, ответственных за мейоз при спорообразовании в стрессовых условиях, но репрессированных при росте на обильной питательной среде (Schramke, Allshire, 2003). Рядом с каждым из генов этой группы были обнаружены инсерции LTR ретротранспозонов. Были детектированы соотвествующие последовательностям LTR эндогенные siPHK.
Предполагается, что siPHK индуцируют метилирование К9 гистонов НЗ в районе LTR (аналогично тому, как это происходит в центромерной области), а затем репрессивная структура хроматина распространяется при участии RdRp от LTR к рядом расположенному гену. Делеции LTR приводят к деметилированию гистонов и активации соседних генов (Schramke, Allshire, 2003). Таким образом, ретротранспозоны у S. pombe используются в качестве «контролирующих элементов генома». Участие коротких РНК ретротранспозонов в регуляции транскрипции уникальных белок-кодирующих генов показано также у Arabidopsis. Уже упоминавшийся ген FWA содержит в промоторе тандемные повторы SINE-подобного ретроэлемента. Кодируемый геном FWA гомеобелок экспрессируется исключительно в эндосперме и участвует в регуляции цветения (Soppe et al., 2000; Kinoshita et al., 2004). В вегетативных тканях siPHK, гомологичные элементу SINE, направляют метилирование гистонов и ДНК в промоторе FWA (Lippman et al., 2004). 2.8. Заключение Различные примеры подавления экспрессии генов с участием коротких РНК, позволяют предположить, что этот механизм возник на ранних этапах эволюции эукариот как способ защиты генома от экспансии мобильных элементов и вирусов. С эволюционной точки зрения представляет особый интерес возможность «приручения/доместикации» мобильных элементов и использования механизма их транскрипционного сайленсинга и для обеспечения клеточных функций самого организма-хозяина. Такая тенденция просматривается на примерах поддержания компактизованного функционального состояния центромерных районов дрожжей, состоящих из транспозон-подобных повторов, а также случаев репрессии генов, регуляторные участки которых содержат ретротранспозоны или их фрагменты. У S. pombe молекулы дцРНК, соответствующие последовательностям ретротранспозонов, регулируют транскрипцию генов, обеспечивающих переход от митотических делений к мейозу и спорообразованию (Schramke, Allshire, 2003). Следовательно, короткие РНК могут направлять репрессию негомологичных генов, рядом с которыми расположены длинные концевые повторы ретроэлементов, контролируя дифференцировку дрожжевой клетки. Короткие РНК, соответствующие ретротранспозонам, функционируют и у растений, обеспечивая репрессию в соматических тканях гена FWA, контролирующего цветение у Arabidopsis (Lippman etal.,2004).
Хроматин иммунопреципитация (Х-СЫР)
Яичники изолировали из самок в возрасте 1-5 дней и помещали в раствор С39 на льду. Осаждали органы на микроцентрифуге 3500 т. об. 1-2 мин. Удаляли раствор С39, взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -60С. Для одной реакции Х-СЫР использовали в среднем 10 мг яичников (сухую массу яичников рассчитывали, вычитая треть массы из результата взвешивания). К замороженным яичникам добавляли 1 мл буфера А1 с добавлением 0.5% Triton Х-100 и 1.8% формальдегида для осуществления ДНК-белковых сшивок. Гомогенизировали материал в процессе размораживания с помощью Potter гомогенизатора при комнатной температуре. Инкубировали 15 мин. на механической руке, затем добавляли глицин до 225 тМ, крутили на руке 5 мин., затем пробирку помещали на лед. Центрифугировали 1 мин. на 14000 т.об., убирали супернатант, добавляли 1 мл буфера А1, ресуспендировали осадок и снова откручивали. Промывку буфером А1 повторяли 3 раза. Затем добавляли 1 мл буфера для лизиса с протеазным ингибитором без SDS, ресуспендировали и осаждали. Ресуспендировали фиксированный материал в 0,5 мл буфера для лизиса с добавлением 0,1% SDS и 0.5% саркозилата, икубировали 10 мин. при 4С на руке. Затем обрабатывали фиксированный материал ультразвуком на приборе Branson Sonifier450 для расщепления хроматина на фрагменты размером 200-300 п.н. Обработку проводили на льду 4 раза по 30 сек. с интервалами по 2 мин при силе 2. Затем материал крутили 10 мин. на руке, осаждали на микроцентрифуге 5 мин. на максимальной скорости и переносили супернатант, содержащий короткие фрагменты хроматина, в новый эппендорф. К осадку снова добавляли 0,5 мл буфера для лизиса, крутили 10 мин., осаждали, после чего объединяли оба супернатанта. Полученный хроматиновый экстракт переносили затем на колонки Centricon YM-100 (предварительно промытые PBS) и центрифугировали 3 раза по 40 мин. (или больше) при 4С, каждый раз добавляя буфер для лизиса. Таким образом промьгоали, по крайней мере, 3-мя объемами буфера для лизиса. Экстракт хроматина, который задерживался на мембране колонки, собирали затем с колонки в конечном объеме 1 мл буфера для лизиса. К экстракту добавляли 100 мкл суспензии протеин А сефарозы (PAS) для прединкубации. Инкубировали несколько часов или ночь при 4С. На этой стадии хроматин может храниться несколько дней при 4С или более долго при - 70С. Затем экстракт разделяли на аликвоты (по 100 мкл), каждая из которых соответствовала количеству материала, полученному из примерно 10 мг яичников, и добавляли антитела. В одну из аликвот антитела не добавляли, в дальнейшем с этой пробой (-АТ) проводили те же процедуры, что и с остальными.
Использовали поликлональные кроличьи антитела фирмы Upstate к различным формам гистонов: АсН3(К9), МеН3(К4), diMetH3(K9), АсН4(К12) и ЬМАс (тетраацетилированный по К5, К8, К12 и К16 гистон Н4), а также к фактору TAF250. Инкубировали хроматин с антителами 4 часа при 4С на руке, затем добавляли 50 мкл суспензии PAS и инкубировали при тех же условиях еще 4 часа или ночь, после чего суспензию осаждали. Осадок промывали 4 раза буфером для лизиса (по 1 мл, 5 мин. при 4С) и 2 раза ТЕ (без протеазных ингибиторов). Затем элюировали преципитат с PAS, для чего добавляли буфер для элюции 1, перемешивали и инкубировали 10 мин. при 65С. Осаждали PAS и переносили супернатант в новую пробирку. Осадок PAS ресуспендировали в 150 мкл буфера для элюции, снова осаждали, объединяли два элюата. Материал на этой стадии представляет собой преципитат хроматина. Для расшивания ДНК-белковых связей преципитат инкубировали 6 часов (или ночь) при 65С. Затем добавляли 250 мкл раствора протеиназы К и инкубировали при 50С 2-3 часа, после чего очищали ДНК. Добавляли 55 мкл 4М LiCl и 500 мкл смеси фенол- хлороформ. Перемешивали, центрифугировали 10 мин. на микроцентифуге на максимальной скорости. ДНК из водной фазы высаживали этанолом. На одну реакцию ПЦР брали в среднем 1/20 часть ДНК, полученной в результате преципитации. ПЦР ставили с dATPP32 или dATP1 33. Продукты радиоактивного ПЦР разделяли в акриламидном денатурирующем геле. Параллельно проводили ПЦР пробы -AT. Обогащение преципитата какими-либо последовательностями рассчитывали по формуле С1 (-АТ)2/ С2 (-АТ)1, где С1 -интенсивность полосы интересующей последовательности, С2 - реперной последовательности, (-АТ)1, (-АТ)2 - интенсивности полос в пробе -AT интересующей последовательности и репера, соответственно. Буфер А1: 60 mM КС1, 15 тМ NaCl, 4 тМ MgC12, 15 тМ HEPES (рН7.6), 0,5% Triton Х-100, 0.5 тМ DTT, 10 тМ бугират натрия, IX смесь протеазных ингибиторов (Roche). Буфер ТЕ: 10 mM Tris-HCl рН 8.0,1 тМ EDTA Буфер для лизиса: 140 тМ NaCl, 15 тМ HEPES рН 7.6,1 тМ EDTA, 0.5 тМ EGTA, 1% Triton Х-100,10 тМ бугират натрия, IX смесь протеазных ингибиторов (Roche). Буфер для элюции 1: 10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM Tris-Cl рН 8 Буфер для элюции 2: ТЕ+0.67% SDS Подготовка суспензии PAS: 100 мг протеин А сефарозы CL-4B (Amersham) ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса с добавлением протеазных ингибиторов и 0,1 мг/мл BSA. Промывали буфером для лизиса 2-3 раза в течение 1 часа. Такая суспензия может храниться при 4С в течение недели. 3.19. Форез ПЦР-продуктов в акриламидном денатурирующем геле Препараты радиоактивно меченых продуктов ПЦР смешивали с буфером для нанесения в соотношении 3:2, использовали 2/5 ПЦР смеси на 1 форез. Инкубировали пробы в течении 5 мин. при 65С, после чего наносили на денатурирующий 5% гель. Электрофорез проводили при 25V/cm, в 1ХТВЕ до выхода бромфенолового синего. Гель после фореза переносили на лист ЗММ бумаги, сушили до полного исчезновения следов влаги и экспонировали на экран фосфоимиджера. Интенсивность полученных сигналов рассчитывали с использованием программы Image Quant. Состав буфера для нанесения: 95% формамид, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол, 0,025% SDS, 18mM EDTA. Состав акриламидного геля: 5% раствор акриламид/бисакриламид (в соотношении 19/1) на бидистилированной воде, 7М мочевина, 1ХТВЕ. 3.20. Т7 транскрипция молекул дцРНК
Для получения двухцепочечных РНК использовали ДНК-матрицы, ограниченные двумя противоположено ориентированными Т7 промоторами для синтеза смысловой и антисмысловой цепей РНК. ДНК-матрицу для синтеза дцРНК Su(Ste) получали с помощью ПЦР с праймерами DSS1, DSS2 с плазмиды, содержащей последовательность Su(Ste). ДНК-матрицу для дцРНК lacZ получали с помощью праймеров DSG1, DSG2, содержащих на 5" концах последовательности Т7 промотора. Условия реакции: в реакционную смесь добавляли 0,5 мкг ДНК-матрицы, по 1 мкл ЮмМ рибо-АТФ, ЦТФ, ГТФ, 1 мкл 1мМ УТФ, 2 мкл а-32Р-УТФ (5,4 рМ/мкл), 2 мкл 0,1М DTT, 2ц1 10хбуфера для транскрипции (Gibco BRL), 2-5 ед. Т7-РНК-полимеразы (Gibco BRL), объем реакции доводили DEPC ЩО до 20ц1, перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при 37С. После чего производили отжиг дцРНК. Для этого транскрипционную смесь инкубировали 5 мин. при 60С с последующим медленным охлаждением пробы до комнатной температуры в течение 30 мин. 3.21. Процессинг дцРНК в лизатах семенников и культуры клеток Drosophila melanogaster Клетки линии Schneider 2 культивировали при 25С в среде С-46, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной сыворотки теленка. На одну реакцию использовали экстракт, полученный из 5-7 мл культуры клеток с плотностью 8,5 млн. клеток/мл. клеточной среды или из 100 пар семенников, выделенных из самцов в возрасте 1-2 дня. При получении экстрактов все процедуры проводили при 4С на льду. Клетки суспендировали в культуральной среде со дна чашки Петри при помощи пипетки. Культуральную среду затем переносили в эппендорфы и центрифугировали при 3,5 - 4 тыс. об. 2 мин. Супернатант отбирали, а осадок клеток ресуспендировали пипеткой в 100-200 мкл 1XPBS с 5мМ EGTA (рН 8), суспензии объединяли в один эппендорф и центрифугировали при тех же условиях. Супернатант отбирали, а осадок 2 раза промывали Iх PBS (1мл). Затем к осадку добавляли 200 мкл буфера SB, клетки ресуспендировали, затем осаждали при 4 - 4,5 тыс. об. 1 мин, добавляли к осадку клеток равный объем SB и гомогенизировали пестичным гомогенизатором. Затем лизат центрифугировали 20 мин. при 14 тыс. об. Отбирали супернатант, добавляли к нему равный объем буфера АВ. Меченую дцРНК добавляли в лизат до конечной концентрации 0,5-3 ng/мкл. РНК в экстракте инкубировали при 25 С в течение 1-4 часов, после чего выделяли РНК с тризолом и разделяли короткие продукты РНК в 15% денатурирующем акриламидном геле.
Регуляция экспрессии гена Stellate повторами Su(Ste) осуществляется при замене собственного промотора Stellate на гетерологичный
С помощью создания репортерных конструкций исследовали, какие участки в последовательности Stellate необходимы для осуществления их репрессии повторами Su(Ste). Гены Stellate и Su(Ste) гомологичны как в области промотора, так и в транскрибируемой области (рис. 18). Для проверки возможного значения гомологии промоторов Stellate и Su(Ste) в процессе репрессии, были созданы конструкции, содержащие большую часть открытой рамки считывания Stellate под контролем гетерологичного промотора (рис. 22). Конструкция hsp70-Ste-lacZ содержала индуцибельный промотор теплового шока hsp70 и кодирующую область Stellate, слитую с репортерным геном Р-галактозидазы (lacZ) (рис. 22). Путем Р-элементной трансформации было получено несколько линий трансгенных мух, несущих конструкцию hsp70-Ste-lacZ. При Р-элементной трансформации инсерции конструкции происходят в случайные геномные сайты (хотя существуют предпочтение к встраиванию в 5 области генов), что приводит к различиям в экспрессии между линиями с инсерциями в различные сайты вследствие эффекта положения - влияния окружающих сайт инсерции последовательностей. Анализ трансгенных линий включал определение хромосомы, в которую произошла инсерция, а также определение числа инсерции в каждой линии с помощью Саузерн-гибридизации. Одиночные инсерции конструкции hsp70-Ste-lacZ были обнаружены в различных сайтах (табл. 2). Во всех линиях hsp70-Ste-lacZ наблюдалась экспрессия Р-галактозидазы в ответ на тепловой шок. Экспрессия происходила преимущественно в соматических тканях, а в семенниках не детектировалась у самцов XY, но появлялась в некоторых клетках семенников у самцов с делецией повторов Su(Ste) на Y-хромосоме XYcry (рис. 23А). Низкий уровень экспрессии Р-галактозидазы в семенниках определяется, по-видимому, свойствами промотора hsp70. В связи с этим была клонирована аналогичная конструкция (fi2tub-Ste-lacZ), содержащая промотор семенник-специфического гена р2-тубулина (рис. 22). Использование семенник-специфического промотора обеспечивало транскрипцию конструкции в терминальных клетках семенников, где происходит транскрипция эндогенных Stellate и Su(Ste) (рис. 23Б), что позволяло более корректно моделировать естественную регуляцию. При делеции повторов Su(Ste) на Y-хромосоме происходило увеличение активности (3-галактозидазы в 7-10 раз (рис. 23Б). Таким образом, повторы Su(Ste) осуществляют репрессию Stellate в отсутствие собственного промотора Stellate - при его замене на гетерологичный.
Следовательно, для осуществления регуляции достаточно гомологии в транскрибируемой части между генами Stellate и Su(Ste). Ранее было показано, что репортерная конструкция Stel34-lacZ, содержащая 134 н.п. из 5 -области гена Stellate, слитые с геном lacZ (рис. 22), обладает семенник-специфической экспрессией и подвергается регуляции повторами Su(Ste) (Aravin et al, 2001). Фрагмент Stellate, находящийся в конструкции Stel34-lacZ, включает около 100 п.н. из нетранскрибируемой области промотора, расположенной до старта транскрипции, и 30 п.н. 5 транскрибируемого нетранслируемого района (рис. 22). Длина гомологичного повторам Su(Ste) транскрибируемого участка (30 п.н.) в конструкции Stel34-lacZ примерно соответствует размеру коротких РНК. Чтобы проверить, насколько гомология с Su(Ste) в транскрибируемой области Stellate важна для репрессии, была получена конструкция Stel34mut-lacZ, отличающаяся от Stel34-lacZ заменой 3-х п.н. (AGT на ТСА) в середине 30-нуклеотидного транскрибируемого участка (рис. 22). Методом Р-элементной трансформации была получена одна линия трансгенных мух, несущих одиночную инсерцию Stel34mut-lacZ в хромосоме 3. Затем путем скрещивания с линией, экспрессирующей транспозазу Р-элемента, Р-элементный вектор был мобилизован и в результате были отобраны 7 линий, несущих инсерции конструкции Stel34mut-lacZ в новых сайтах генома (схема мобилизации приведена в материалах и методах). При этом 2 инсерции располагались в Х-хромосоме и 5 - во 2-ой хромосоме (табл. 3). Были получены указания на то, что длина эндогенных siPHK Su(Ste) находится в диапазоне 25-27 нт. (Aravin et al, 2001). В то же время, размер siPHK, образующихся при процессинге экзогенных дцРНК нуклеазой Dicer в клетках дрозофилы, составляет 20-23 нт., что было показано как при детекции радиоактивно меченых продуктов процессинга, так и в результате клонирования коротких РНК после инкубации дцРНК в эмбриональных экстрактах (Zamore et al., 2000; Hammond et al., 2000; Elbashir et al., 2000a; Bernstein et al., 2001). Данная часть работы была нацелена на выявление причин, определяющих «необычный» размер коротких РНК Su(Ste). С помощью Т7 транскрипции синтезировали меченую сс-32Р-УТФ дцРНК, имеющую последовательность Su(Ste) или lacZ. При инкубации дцРНК Su(Ste) в лизате культуральных клеток дрозофилы Schneider 2, наблюдали образование siPHK длиной 21-23 нт., также как и в случае дцРНК lacZ (рис. 25А). Таким образом, какие-либо особенности нуклеотидной последовательности или структуры дцРНК Su(Ste) не могут служить объяснением «неканонического» размера siPHK Su(Ste). Можно предполагать, что образование siPHK длиной 25-27 нт. определяется особенностями процессинга молекул дцРНК в семенниках, поскольку во всех ранее проведенных экспериментах были использованы эмбрионы или культура клеток дрозофилы (Zamore et al., 2000; Hammond et al., 2000; Elbashir et al., 2000a; Bernstein et al., 2001). Однако в лизате, полученном из семенников, дцРНК также нарезается на фрагменты размером 21-23 нт. (рис. 25Б). Мутации в генах РНК-интерференции spn-E и aub, которые вызывают дерепрессию Stellate, приводят к исчезновению siPHK Su(Ste) в семенниках, что показано при помощи Нозерн гибридизации (Aravin et al., 2004). Однако, в лизатах семенников мух spn-E и aub, процессинг дцРНК с образованием siPHK длиной 21-23 нт., не нарушается (рис. 25Г). С помощью ОТ-ПЦР и анализа регуляции репортерной конструкции LTRcopia-lacZ было показано, что увеличение экспрессии ретротранспозонов при нарушении аппарата РНК-интерференции происходит преимущественно в терминальных тканях. Конструкция LTRcopia-lacZ активируется при мутациях в генах spn-E и piwi исключительно в ооците и питающих клетках яичников, но не в соматических фолликулярных клетках. Дерепрессия конструкции наблюдается также в терминальных клетках семенников, но не детектируется в соматических органах. Возможно, это является следствием низкого уровня экспрессия генов spn-E и piwi в соматических тканях. Для гена spn-E действительно была показана преимущественная экспрессия в яичниках (Gillespie, Berg, 1995). В этом случае можно предполагать существование различных групп белков РНК-интерференции, одна из которых включает PIWI и SPN-E и осуществляет репрессию мобильных элементов в терминальных тканях, в то время как другая группа, включающая не идентифицированные пока белки, репрессирует ретротранспозоны в соматических тканях.
Хотя эффективная репрессия генов с помощью дцРНК показана практически во всех тканях и типах клеток дрозофилы (Kennerdell, Carthew, 2000; Lam, Thummel, 2000; Roignant et al., 2003; Ivanov et al., 2004; Kuttenkeuler et al., 2004), однако тканеспецифичность белкового аппарата РНК-интерференции остается не исследованной. Другое возможное объяснение полученных результатов состоит в том, что механизм подавления активности ретротранспозонов с помощью РНК-интерференции вообще характерен только для терминальных тканей, поскольку транспозиции, произошедшие в клетках зародышевого пути, в отличие от соматических, могут наследоваться. Стратегия многих мобильных элементов направлена на экспрессию и осуществление перемещений именно в клетках зародышевой линии (Rio, in Mobile DNA II, 2002; Busheton et al., in Mobile DNA II, 2002). В связи с этим предотвращение активности мобильных элементов в терминальных тканях имеет предпочтительное значение для организма. Тот факт, что нарушение системы РНК-интерференции вызывает не только увеличение экспрессии мобильных элементов, но и увеличивает частоту транспозиций был показан для ДНК-транспозона Tel у С. elegans (Tabara et al., 1999; Ketting et al., 1999). Причем, в норме (при интактном аппарате РНК-интерференции) перемещения Tel происходят исключительно в соматических тканях, а при мутациях в генах РНК-интерференции Tel начинает транспозироваться в клетках зародышевого пути (Sijen, Plasterk, 2003). Ретротранспозон-подобный элемент ТОСІ у хламидомонады Chlamydomonas reirihardtii начинает активно перемещаться при мутации в гене, кодирующем РНК-хеликазу, вовлеченную также в посттранскрипционную репрессию трансгенов (Wu-Scharf et al., 2000). А. Калмыковой было недавно продемонстрировано, что мутация piwi вызывает перемещения LTR-ретротротранспозона mdgl в стволовых герминальных клетках семенников дрозофилы (Kalmykova et al., 2005). Частота транспозиций mdgl у потомков самцов, гомозиготных по мутации piwi, составляет 19%, в то время как в норме транспозиции mdgl не детектируются (Kalmykova et al., 2005).
