Содержание к диссертации
Введение
1. Импорт тРНК в митохондрии 9
1.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших 10
1.1.1. Импорт тРНК в митохондрии Tetrahymena 10
1.1.2. Импорт тРНК в митохондрии трипаносоматид 12
1.1.2.1. Отряд Kinetoplastidae 12
1.1.2.2. Отряд Leishmania 14
1.1.3. Другие представители простейших 19
1.2. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей 19
1.3. Импорт тРНК в митохондрии растений. 25
1.4. Импорт тРНК в митохондрии животных 28
2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков 30
2.1 Введение 30
2.2. Функции УПС в клетке 31
2.3. Убиквитинилирующая система в S. cerevisiae 32
2.4. 26S протеасома: строение и функционирование 35
2.4.1.20S субчастица, или каталитическое ядро 36
2.4.2. 19S регуляторная субчастица 39
2.5.Где локализованы протеасомы в клетке? 40
2.6. Узнавание полиубиквитиновых цепей 41
2.6. Протеасомиые субъединицы, узнающие пояиубиквитиновые цепи 41
2.6.2. ЕЗ и Е4 ферменты в направлении субстратов к протеасоме 42
2.6.3. Доставка субстратов к протеасоме посредством Cdc48 и его кофакторов43
2.6.4. Шапероны и их кофакторы в деградации белков 45
2.7. UFD путь 46
2.8. Непротеолитическая роль убиквитииа и убиквитин-связывающих белков в клетке 48
2.8.1. Образование моноубиквитинилированных белков 49
2.8.2. Связывание моноубиквитииилированных белков с различными убиквиган-связывающими доменами 49
2.8.3. Альтернативные функции убиквитииа 50
2.9. Индукция УПС и каскадов протеинкиназ в ответ на тепловой шок 54
3. Енолаза - гликолитический фермент 56
2 Материалы и методы исследования 61
1. Штаммы микроорганизмов и линии клеток 64
1.1. Штаммы Escherichia coli 64
1.2. Штаммы Saccharomyces cerevisiae 64
1.3. Линия клеток человека 66
2. Условия выращивания организмов 66
3. Генно-инженерные конструкции 61
4. Генно-инженерные методы 70
4.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 70
4.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилирование 71
4.3. Лигирование 71
4.4. Обратная транскрипция и амплификация 71
5. Определение пуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера 71
6. Трансформация клеток E.coli 72
7. Трансформация Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК 73
8. Трансформация Saccharomyces cerevisiae библиотекой кДНК 74
9. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae 74
10. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток 75
11. Определение активности р-галактозидазы 75
11.1. Определение активности р-галактозидазы с помощью иммобилизации клеток на нитроцеллюлозных фильтрах 75
11.2. Определение активности р-галактозидазы с использованием раствора X-gal в 0.5% агаре 75
12. Скрещивание дрожжей 76
13. Выделение ДНК из клеток дрожжей 76
14. Выделение митохондриальных РНК из дрожжей 76
14.1.Выделение митохондрий 76
14.2. Выделение митохондриальных РНК 77
15. Выделение суммарных клеточных РНК из дрожжей 78
16. Гибридизация по Нозерну. 78
17. Western-гибридизация 79
18. Мечение тРНК для реакций импорта 80
19. Проверка амноацилирования РНК методом перйодатного окисления и мечения с использованием РНК-лигазы 81
20. Транспорт радиоактивно меченной ТРК1 в изолированные митохондрии 82
20.1. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 82
20.2. Выделение митохондрий из клеток дрожжей 83
20.3. Исследование импорта РНК в изолированные митохондрии 83
21. Выделение митохондрий из клеток человека 84
22. Выделение митохондрий из гепатоцитов быка 84
23. Измерение активности протеасомы in vitro 85
24. Локализация митохондриальных белков 85
24.1. Получение 355-меченных белков 86
24.2. Импорт "Э-меченных белков в изолированные митохондрии дрожжей 86
25. Локализация 358-меченых еполаз в митохондриальной фракции дрожжей 86
26. Конфокальная микроскопия клеток дрожжей 87
27. Определение энзиматической активности гликолитических ферментов 87
28. Выделение фракции, обогащенной внешними мембранами митохондрий дрожжей 91
29. Двумерный натжпый электрофорез по Шагеру и фон Ягову 92
29.4. Western-гибридизация BN-PAGE 93
30. Иымунопреципигация 93
31. Методы масс-спектрометрического анализа 94
З1.1. Визуализация белков в ПЛАГ 94
31.2. Расщепление белков трипсином в геле 94
31.3. MALDI- TOFанализ 95
3 Результаты и обсуждение 96
1. Поиск потенциальных факторов импорта тРНК с использованием дву тригибридных систем в дрожжах 96
1.1. Поиск белков, взаимодействующих с pre-Msklp в двугибридиой системе 96
1.1.1. Метод двугибридиой системы в дрожжах 96
1.1.2. Скрининг библиотек кДНК для поиска белков, связывающих pre-Msklp 98
1.2. Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК 101
1.3. Функциональный анализ роли потенциальных факторов импорта 108
1.3.1. Роль убиквитин-протеасомной системы в импорте тРНК 113
1.3.2. Анализ роли других потенциальных факторов импорта 129
2. Новые функции енолазы как фактора импорта тРНК 141
2.1. Анализ локализации енолазы в клетках дрожжей in vivo с использованием Western-гибридизации 144
2.2. Локализация Епо2р, меченной YFP, в клетках дрожжей 147
2.3. Енолаза, связанная с митохондриями, является функционально активной 149
3. Анализ митохондриалышх комплексов, содержащих енолазу 151
Выводы 167
- Импорт тРНК в митохондрии дрожжей
- UFD путь
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК
Введение к работе
Митохондрии осуществляют широкий спектр функций, включая обеспечение клеток энергией за счет окислительного фосфорилирования. Для митохондрий характерно наличие собственной ДНК и системы биосинтеза белка, однако большое число макромолекул импортируется в оргаиеллы из цитоплазмы. Было показано, что в ряде случаев в митохондрии транспортируются не только белки, но также и тРНК. К настоящему времени импорт тРНК в митохондрии был обнаружен у простейших, ряда растений, сумчатых млекопитающих, а также у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Механизм переноса тРНК в митохондрии и его специфичность значительно отличается от вида к виду.
В случае дрожжей было показано, что из цитоплазмы в митохондрии
импортируется два вида тРНК - TPHKLysCuu (Martin et al., 1979) и тРНКС1п (Reinehardt et al.,
2005). Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух
, tvt* изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНК ^сии^направляется в митохондрии дрожжей, в
то время как вторая (TPHKLysuuu) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в
локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих
тРНК (Entelis et al., 1998). Следующий уровень селекции может быть опосредован
белками, взаимодействующими с тРНК. Ранее в нашей лаборатории было показано, что
для импорта ТРК1 должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической
лизил-тРНК-синтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником
митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (pre-Msklp) (Tarassov et al., 1995b). Однако
присутствия аминоацилированной ТРК1 и pre-Msklp не достаточно для импорта ТРК1 в
митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов,
направляющих ее импорт, так называемых факторов импорта.
Данная работа была направлена на обнаружение белков, участвующих в импорте тРНК в митохондрии дрожжей и изучение их роли в этом процессе. При выполнении данной работы были получены указания на роль убикивитин-протеасомной системы деградации белков в импорте тРНК в митохондрии. Поэтому мы анализировали влияние различных компонентов этой системы на импорт ТРК1.
Во время выполнения данной работы в нашей лаборатории были получены данные, указывающие на участие гликолитического фермента - енолазы — в импорте тРНК (Н.Энтелис, неопубликованные данные). Также недавно было показано, что енолаза в комплексе с другими гликолитическими ферментами присутствует во фракции внешних мембран митохондрий Arabidopsis thaliana (Giege et al., 2003). Помимо этого известно, что
глнколитнческие ферменты обладают рядом альтернативных функций. Поэтому мы предположили, что одной из функций * - комплекса/могло бы быть участие в импорте тРНК в митохондрии. В связи с этим мы анализировали подробнее роль енолазы в импорте тРНК, ее митохоидриальную локализацию в клетках дрожжей и осуществили поиск митохондриальных белков, образующих комплекс с енолазой.
Целью данной работы было исследование роли белковых факторов и РНК-белковых взаимодействий в импорте тРНК в митохондрии дрожжей.
Для этого в ходе исследования предполагалось выполнить следующие задачи:
Идентифицировать белковые факторы, потенциально участвующие в импорте тРНК в митохондрии дрожжей, так называемые факторы импорта, с использованием дву- и тригибридной систем в дрожжах.
Изучить влияние выявленных факторов на импорт тРНК в митохондрии дрожжей.
Исследовать роль гликолитического фермента - енолазы дрожжей - в импорте тР РІК.
Охарактеризовать митохоидриальную локализацию енолазы в клетках дрожжей и идентифицировать митохондриальные белки, взаимодействующие с енолазой.
Импорт тРНК в митохондрии дрожжей
Митохондриальный геном дрожжей Saccharomyces cerevisea кодирует полный набор тРНК, необходимых для трансляции. Вплоть до недавнего времени считалось, что в дрожжах импортируется единственная цитоплазматическая тРНК - лизиновая TPHKLyscuu. Однако недавно был описан еще один случай импорта тРНК в митохондрии дрожжей -тРНК п (Rinehart et al., 2005). Таким образом, в настоящее время предполагается наличие двух различных механизмов импорта тРНК в дрожжах. Рассмотрим их подробнее в историческом порядке. 1.2.1. Импорт лнзиновой тРНК сначала был обнаружен в результате сравнения популяции тРНК до и после гибридизации с митохондриальной ДНК. В результате бьша обнаружена только одна тРНК, присутствующая в митохондриях, но не гибридизующаяся с митохондриальной ДНК. Этой тРНК оказалась кодируемая ядерной ДНК TPHKLysCUU, далее обозначаемая как ТРК1 (Martin et al., 1979). Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae содержат еще две изоакцепторные лизиновые тРНК: цитоплазматическую тРНК с антикодоном mcmVUUU (далее ТРК2), кодируемую ядерной ДНК, но не импортируемую в митохондрии; и митохондриальную тРНК с антикодоном cmnm5UUU (обозначается далее как ТРКЗ), закодированную в митохондриальном геноме (Рис, 5). ТРК1 неравномерно распределена между цитоплазмой ( 95%) и митохондриями ( 5%) (Entelis et al., 1996). Несмотря на то, что лишь малая часть ТРК1 проникает в митохондрии, концентрация этой тРНК в органеллах сравнима с концентрацией других митохондриальных тРНК, кодируемых митохондриальной ДНК. Роль импортируемой тРНК в митохондриях не ясна. Модифицированный уридин в wobble положении антикодона ТРКЗ позволяет этой тРНК узнавать А и G в третьем положении лизиновых кодонов AAA и AAG, иными словами, теоретически, ТРКЗ достаточна для обеспечения митохондриального биосинтеза белка (Martin et al., 1990). Кроме того, осЕЮвываясь на том факте, что ТРК1 не аминоацнлнруется митохондриальной лизил-тРНК-синтетазой, было высказано предположение о том, что импортируемая ТРК1 не принимает участия о митохондриалыгом биосинтезе белка, а выполняет какую-то иную функцию (Martin et al., 1979). При анализе последовательностей РНК (Сойдла и Голованов, 1984) обнаружили частичную комплементарность последовательностей лизиновой TPKI и участков пре-мРНК, имеющих ключевое значение для сплайсинга, на основании чего авторы высказали предположение об участии ТРК1 в сплайсинге митохондриальных транскриптов у дрожжей. Согласно другой гипотезе, ТРК1 может принимать участие в обратной транскрипции или репликации ДНК в митохондриях (Martin et al., 1979).
Были разработаны системы импорта тРНК в митохондрии in vitro (Tarassov и Entelis, 1992) и in vivo (Entelis et al,, 1998). С использованием этих двух подходов было показано, что для импорта ТРК1 в митохондрии необходимо присутствие АТФ, разность потенциалов (AT) на митохондриальных мембранах, а также растворимые цитоплазматические белки и белки, ассоциированные с внешней митохондриальной мембраной. Биохимические и энергетические параметры импорта тРНК напоминают соответствующие условия импорта белков в митохондрии. Удаление белков, экспонированных на поверхности митохондрий, мягкой обработкой протеиназами (эластазой, протеиназой К или трипсином) ингибировало импорт тРНК, что свидетельствует об участии белковых рецепторов в этом процессе. В результате анализа дрожжей с мутациями в аппарате импорта белков в митохондрии были получены прямые доказательства того, что импорт тРНК проходит по тем же каналам, что и импорт белков. Было показано, что рецептор внешней митохондриальной мембраны Тот20 необходим для импорта ТРК1 в митохондрии, тогда как рецептор Тот70 в этом процессе не участвует (Tarassov et al., 1995а). Удаление одного из важнейших компонентов трапслоказы внутренней мембраны митохондрий белка Tim44 также препятствовало импорту TPKI в митохондрии. На основании полученных результатов было высказано предположение о том, что тРНК импортируется в митохондрии по каналам белкового импорта либо сама по себе, либо в комплексе с предшественником белка, импортируемого в митохондрии. При низкой концентрации АТФ с одновременным снятием разности электрического потенциала на внутренней митохондриальной мембране предшественники белков «застревают» в транслокационном аппарате (Sollner et al., 1991). В аналогичном опыте с тРНК прекращался импорт нуклеиновой кислоты в митохондрии.
Таким образом, тРНК, по всей видимости, импортируется в митохондрии в комплексе с белком, который «застревает» в транслокационной поре (Tarassov et al., 1995а). Поскольку для импорта ТРК1 в изолированные митохондрии требуются растворимые цитоплазматические белковые факторы, логично предположить, что они необходимы либо для транспортировки тРНК к поверхности митохондрии, либо они непосредственно участвуют в переносе тРНК через мембрану. Два цитоплазматических белковых фактора были идентифицированы. Это цигоплазматическая лизил-тРНК-синтетаза (далее KRS) и предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (далее пре-MSK) (Tarassov et al., 1995a), (Tarassov и Entelis, 1992). Идея об участии аминоацил-тРНК-синтетаз в импорте тРНК впервые была высказана японскими исследователями около 40 лет назад (Suyama и Еуег, 1967). В основе этого предположения лежит тот факт, что аминоацил-тРНК-синтетазы имеют высокое сродство к индивидуальным тРНК. Кроме того, все митохондриальные синтетазы импортируются в органеллы из цитоплазмы. Цитоплазматическая лизил-тРНК-синтетаза является необходимым фактором для транспортировки деацилированной ТРК1 в митохондрии. Антитела к этому белку препятствовали переносу деацилированной формы, но не мешали транспорту аминоацилированноЙ формы ТРК1. Вероятно, основная роль KRS заключается в аминоацилировании ТРК1, которая не может импортироваться в деацилированной форме (Tarassov et al., 1995а). pre-Msklp не аминоацилирует ТРК1 и, вероятно, образует с ней неканонический комплекс. Антитела к этому белку ингибировали импорт как деацилированной, так и аминоацилированноЙ форм ТРК1. Удаление сигнальной последовательности приводило к прекращению импорта как pre-MSK, так и ТРК1. На основании полученных данных была предложена модель импорта ТРК1 в митохондрии (Рис.6). KRS аминоацилирует ТРК1, которая затем взаимодействует с рге-Msklp с образованием РНП-комплекса, в состав которого входят, возможно, и другие белки. После диссоциации KRS РНП-комплекс транслоцируется через митохондриальную мембрану (Tarassov et al., 1995а). Какие факторы определяют селективность импорта одной из двух цитоплазматических TPHKLys, пока до конца не ясно. Поскольку последовательности ТРК1 и ТРК2 отличаются по 21 положению, было высказано предположение о том, что один или несколько отличающихся нуклеотидов могут играть роль детерминант импорта. В результате анализа химерных молекул ТРК1, содержащих фрагменты последовательности ТРК2, было показано, что основные детерминанты импорта расположены в аминоакцепторном стебле (первая пара G1-C72) (Kazakova et al., 1999) и в антикодоновой петле (С в положении 34) (Entelis et al., 1998). Кроме того было показано, что ТРК1 импортируется в митохондрии, сохраняя вторичную, а, возможно, и третичную структуру (Entelis et al., 1998). 1.2.2. Импорт глутаминовой тРНК был впервые обнаружен в дрожжах в 2005 году (Rinehart et al.} 2005).
UFD путь
Белки, направляемые на деградацию в протеасому, содержат цепи полиубиквитина, которые присоединеняются либо к аминогруппе одного из лизинов субстрата (тогда убиквитин-протеинлигаза связана с N-концом субстрата, так называемое "N-концевое правило"), либо к N-концевой аминогруппе субстрата - TJFD путь (от англ. Ubiquitin Fusion Degradation). Механизм второго пути пока до конца не ясен, однако известны основные участники этого процесса (см. таблицу 2). Табл. 2. Компоненты UFD-системы, идентифицированные Джонсоном и сотрудниками (Johnson et Как видно из таблицы 2, функции всех известных компонентов UFD-пути в той или иной мере раскрыты. Для ортологов Doal известно широкое разнообразие функций в клетках -контроль синтеза простогландинов и активности фосфолипазы А2 (Keil et al,t 1996), составляющий компонент мышиной гистондеацетилазы (Seigneurin-Berny et al,, 2001), обеспечение устойчивости клеток к некоторым летучим анестетикам (Wolfe et al., 1999), репарация двуцепочечных разрывов в ДНК (Wilson, 2002). Однако функция Doal в дрожжах по-прежнему остаётся загадкой. Джонсон и сотрудники предположили, что влияние Doal на расщепление UFD-субстратов косвенно и заключается лишь в регуляции уровня свободного убиквитииа в клетке (Johnson et al., 1995). Действительно, они показали, что в мутантах по гену этого белка уровень убикпитина сильно снижен, при этом значительно возрастает характерное время полужизни UFD-субстратов. Этот фенотип может быть восстановлен повышенной экспрессией полиубиквитина Ubi4. Однако мутации в гене DOA1 (вплоть до полной делеции) никак не повлияли на скорость деградации субстратов «N-концевого правила», что заставляет задуматься о более прямом участии Doal в UFD-пути. Взаимосвязь Doal с другими компонентами UFD-пути стала более очевидной, когда обнаружили, что он, с одной стороны, взаимодействует с Cdc48 (Ghislain et al., 1996), а с другой - с полиубиквитиповыми цепями, соединёнными через лизин-29 (Russell и Wilkinson, 2004). Более того, оказалось, что Doal является основным белком, связывающим такой тип полиубиквитиновых цепей. Выше уже отмечалось, что в подавляющем большинстве случаев присоединение новых остатков убиквитина ведётся через лизин-48 (Schnell и Hicke, 2003). Если вспомнить, что специфическая убиквитин-протеинлигаза UFD-пути (Ufd4) создаёт именно 29-соединённые цепи, то всё становится на свои места: Doal непосредственно участвует в UFD-убиквитинировании. В структуре Doal, несмотря на способность взаимодействовать с полиубиквитиновыми цепями, отсутствуют известные убиквитин-связывагощие домены.
Однако на N-конце присутствуют домен, содержащий семь WD40 повторов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях. Интересно, что все описанные семейства мультисубъединичных убиквитин-протеинлигаз используют именно WD40 домены для создания субстратной специфичности (Glickman и Ciechanover, 2002). Все эти комплексы характеризуются наличием следующих компонентов: структурный белок, обеспечивающий целостность комплекса и пространственную сближенность субъединиц; белок, участвующий в распознавании субстрата; Е2-фермент, осуществляющий убиквитинилирование субстрата. На основании анализа литературы нами выдвинута гипотеза, что Doal также может являться частью мультисубъединичной убиквитин-протеинлигазы на основе Cdc48. В пользу нашего предположения говорят следующие факты: Cdc48 связывает множество различных адаптеров, при этом непосредственно не участвуя в реакциях убиквитинилирования; адаптеры Cdc48 являются взаимоисключающими, что позволяет модифицировать активность и субстратную специфичность комплекса, - этот же приём используется комплексами SCF-семейства, создавая огромное разнообразие ЕЗ-фермептов; Doal взаимодействует с Cdc48 и обладает WD40 повторами, подобно субстрат-распознающим субъединицам сложных ЕЗ; « Cdc48 направляет деградацию различных белков в комплексе с Ufdl, NpI4 и Ufd2; подобно многим ЕЗ-ферментам (в том числе Ufd4), комплекс Cdc48 физически ассоциирован с протеасомой (Xie и Varshavsky, 2000); удалось выделить комплекс, включающий Cdc48, Doal, NpI4, Shpl и Ufdl. Вместе с тем, открытым остаётся вопрос о ферменте, непосредственно осуществляющем убиквитинилирование. Ufd2, обнаруженный в составе комплекса с Cdc48 (Richly et al,, 2005), катализирует образование Лиз-48-соединенных цепей, что не согласуется с фактами, изложенными выше. Л взаимодействие Ufd4 с Cdc48 показано не было, более того Ufd4 относится к НЕСТ-семейству ЕЗ-ферментов, а все известные мультисубъединичные убиквитин-протеинлигазы - члены RING-семейства. 2.8.
Непротеолитическая роль убиквитина и убиквитин-связывающих белков в клетке На протяжения многих лет основной функцией убиквитина считалась направление белков к протеасоме для деградации. Однако, как уже упоминалось выше для моноубиквитинилированных белков, эта ковалентная модификация может играть регуляторную роль в клетке, изменяя локализацию, активность белка и его взаимодействие с другими белками. Остановимся на этом подробнее. Интересно, как образуются моноубиквитинилированные белки, почему они не превращаются в полиубиквитинилированные производные? Видимо, этот процесс регулируется ферментами убиквитин-конъюгирующей системы. Показано, что некоторые ЕЗ-ферменты способны моно- и полиубиквитинилировать субстраты, как лигаза Rps5p (Rotin et al., 2000). Было также высказано предположение, что моноубиквитин-связывающий домен в cis- или /гап5-положении оказывает ингибирующий эффект на реакцию удлинения полицепей убиквитина (Madura, 2002). Другим вариантом является образование моноубиквитинилированных белков из ранее модифицированных субстратов, так как многие деубиквитинилирующие ферменты катализируют отщепление убиквитина . от его полицепей. Это делает убиквитинилирование обратимым процессом и представляет собой еще один уровень регуляции функции белков, сходный с фосфорилированием (Wilkinson, 2000). 2.8.2. Связывание моноубиквитинилированных белков с различными убиквитин-связывающими доменами Убиквитин является своего рода трехмерным специфическим сигналом, узнающимся белками, выполняющими разнообразие функции в клетке, что косвенно указывает на широкий спектр непротеолитических функций убиквитина. Возникает вопрос, в чем проявляется различие в связывании моно- и полиубиквитиновых сигналов с различными убиквитин-связывающими доменами? In vitro было показано, что многие белки, связывающиеся с мопоубиквитином, также способны связываться с полиубиквнтином, причем для некоторых доменов афинность к полиубиквитину выше, даже если данные, полученные генетическими методами указывают на то, что в клетке этот домен связывается с мопоубиквитином (Polo et al., 2002). Объяснением этому может служить тот факт, что in vitro гидрофобная поверхность каждого из убиквитинов, входящих в состав полиубиквитшговой цепи, связывается со специфическим доменом белка, то есть наблюдается мультивалентное взаимодействие.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Реакцию амплификации проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ КС1, 2,5 мМ MgCb., по 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 20 пмоль соответствующих праймеров и 5 единиц Taq полимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе "CycloTemp-5" или «Primus 96 plus» (MWG AG Biotech) в соответствии со стандартной программой. Полученные ПЦР-продукты очищали на колонке "QIAquick Spin Columns" QIAgen и затем разделяли с помощью электрофореза в 12% ПААГ в буфере ТБЕ (89мМ трис-борат, 89мМ борная кислота, 2мМ ЭДТА). Для определения размеров фрагментов ДНК использовали фирменный маркер 1 kb Ladder "Promega". По окончании электрофореза гель окрашивали бромистым этидием (1 мг/л) и фотографировали с использованием прибора Baby-Imager. Расщепление ДНК проводили в соответствующем буфере "Biolabs" в течение 1 часа при температуре 37С. Эффективность расщепления ДНК оценивали путем разделения продуктов реакции с использованием электрофореза в 8% ПААГ, Для клоиирования плазмиды после расщепления эндонуклеазами рестрикции дефосфорилировали в буфере "Promega" с использованием щелочной фосфатазы из поджелудочной железы теленка (1ед) "Promega" 1 час при 37С. Депротеинизациго проводили обработкой реакционной смеси равным объемом фенола, насыщенного Трис-HCl. После встряхивания в течение 1 минуты, центрифугировали 5 минут при 12.000 g, из полученной водной фазы осаждали ДНК прибавлением 1/10 объёма З М ацетата натрия (рН 4,8) и трёх объёмов этанола. 4.3. Лигирование продукта ПЦР с расщепленным вектором проводили в буфере "Biolabs" с помощью 20 U Т4 ДНК-лигазы (Biolabs) при +18С в течение 2,5 ч. Реакцию останавливали прогреванием 5 минут при 60С. 4.4. Обратная транскрипция и амплификация Для обратной транскрипции с последующей ПЦР использовали набор "one-step RT-PCR" фирмы Qiagen или набор фирмы GibcoBRL. В качестве матрицы использовали РНК, выделенную методом «горячего фенола» {раздел 15.1) из комплексов митохондриальных белков, изолированных в результате иммунопреципитации с антителами к енолазе (раздел 30). Продукты реакции разделяли электрофоретически в 10 % ПААГ. 5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера.
Для денатурации ДНК смешивали 0.9 мкг плазмидной ДНК с соответствующим олигонуклеотидом и с 1 мкл 5М NaOH, инкубировали 5 минут при комнатной температуре, затем охлаждали и переосаждали этанолом по стандартной методике и растворяли в 10 мкл буфера для отжига (40мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCb, 50 мМ NaCl). Реакция мечения ДНК. К Юмкл раствора ДНК в буфере для отжига прибавляли: ДТТ ЮОнМ 2 мкл [a-35S]-MTO 1 мкКю Т7-ДНКполимеразу (Promega) 5 ед. дЦТФ, дГТФ, дТТФ по 7,5мкМ 0.4 мкл инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Реакция терми нации. В 4 пробирки эппендорф помещали по 2.5 мкл терминирующей смеси нуклеотидов, содержащей 20мкМ одного дидезоксинуклеотида "Fmol Sequencing System" (Promega) и по 200 мкМ каждого из дезоксииуклеотидов. Инкубировали 5 минут при 37С, затем к каждой пробе добавляли 3 мкл меченой ДНК и инкубировали 5-Ю минут при 37С. Реакцию останавливали прибавлением к каждой реакции по 4 мкл раствора, содержащего ЮмМ NaOH, 0.5% формамида, 0.05% бромфенолового синего, 0.05% ксиленциаыола. Далее проводили анализ проб электрофоретическим разделением в 6% ПААГ с 8М мочевиной в буфере ТБЕ. Перед разделением проб электрофоретически пробы прогревали 2-3 минуты при 98С. После проведения электрофореза гель фиксировали в 10% уксусной кислоте, высушивали и радиоавтографировали. 6. Трансформация клеток E.coli Клетки E.coli штамма XL 1 Blue выращивали в жидкой среде LB при температуре 37"С в течение ночи при покачивании. Для получения компетентных клеток использовали культуру в логарифмической фазе роста (оптическая плотность Аеоо =0.8-1,0). Далее все операции проводили в полустерильных условиях при 4 С. Клетки осаждали центрифугированием 10 минут 1000 g, трижды промывали водой (половиной исходного объема культуры), затем таким же объемом раствора стерильного 10% глицерина. Осадок клеток суспендировали в небольшом объеме 10% глицерина, после чего полученные компетентные клетки охлаждали на ледяной бане и проводили электропорацию. К 50 мкл клеток прибавляли охлажденный раствор плазмидной ДНК (ок. 100 мкг), помещали в кювету "Biorad" (е1=2мм) и подвергали действию электрического тока (сопротивление 200 Ом, емкость 25 мкФ, напряжение 2,5 кВ) при помощи прибора "Bio-Rad Exoli Pulser". После электропорации к клеткам добавляли 100 мкл среды LB, инкубировали их 15 мин-ї ч при 37С при покачивании для фенотипической экспрессии гена устойчивости к ампициллину и высевали на твердую среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора «Quantum Prep: Plasmid Miniprep Kit» фирмы "Bio-Rad", 7.
Трансформация Saccharomyces cerevisiae плазмидной ДНК Стандартную трансформацию клеток дрожжей S. cerevisiae проводили как описано в НШ etal, 1991. Клетки дрожжей выращивали в 10 мл богатой среды YPD при 30С при покачивании до Аеоо =1.0. Далее все операции проводили в полустерильных условиях при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 g в центрифуге Beckman L6-HC, дважды промывали 5 мл буфера ТЕ, содержащего ЮОмМ Трис-HCI (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл 100 мМ ацетата лития, после чего осаждали при 12.000 g в течение 15 с. Затем клетки повторно ресуспендировали в 100 мМ ацетата лития до конечного объёма 500 мкл. Приготовленные таким образом компетентные клетки немедленно трансформировали плазмидной ДНК. Для одной трансформации использовали 50 мкл суспензии компетентных клеток. Непосредственно перед трансформацией клетки осаждали центрифугированием при 12.000g в течение 15 с, супернатант сливали, а к осадку клеток прибавляли следующие растворы (в указанном порядке): 50% (w/v) полютилентликоль-4000 - 240 мкл; 1 М ацетат лития - 36 мкл; ДНК спермы лосося (2 мг/мл), предварительно прогретая в течение 5 мин при 100С и немедленно охлаждённая во льду, - 50 мкл; Плазмидная ДНК - 0,5 мкг, или 5 мкл; стерильная бидистилированная вода - 29 мкл; ДМСО - 40мкл. Клетки тщательно ресуспендировали, трансформационную смесь инкубировали при 30С в течение 30 мин, время от времени перемешивая. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42С в течение 30 мин, после чего осаждали центрифугированием при 12.000 g в течение 15 с, супернатант осторожно удаляли. Клетки очень аккуратно ресуспендировали в 200 мкл стерильной воды, высевали на твёрдую среду и инкубировали при 30С в течение 2-5 сут. Трансформацию дрожжей плазмидой pGAD-GH, в которую клонирована библиотека кДНК, проводили как описано в Kraemer et al, 2000. Клетки дрожжей выращивали в 1.5 л богатой среды YPD при 30С при покачивании до Абоо =0.5-0.8. Далее все операции проводили в полустерильных условиях при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием 5 минут при 2.500 g, промывали бидистилированной стерильной водой, ресуспендировали в 150 мл раствора Lisorb (100 мМ ацетат лития, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1мМ ЭДТА, 1М сорбит) и инкубировали 15 мин при 30С. Затем клетки центрифугировали в тех же условиях, ресуспендировали в 1.5 мл раствора Lisorb, охлаждали во льду и прибавляли смесь ДНК, состоящую из 600 мкл денатурированной высокомолекулярной ДНК из спермы лосося (20 мг/мл), 2.4 мл раствора Lisorb и 100 мкг библиотеки кДНК.
Поиск белков, взаимодействующих с импортируемой тРНК
Вторым подходом, направленным на идентификацию факторов импорта, был поиск белков, с которыми специфически взаимодействует импортируемая лизиновая тРНК дрожжей, с использованием тригибридной системы в дрожжах. Этот метод находит широкое применение для исследования разнообразных процессов с участием РНК-белковых взаимодействий. Тригибридная система используется для обнаружения белков, связывающихся с известной последовательностью РНК, для подтверждения взаимодействия РНК с известными белками и анализа эффективности связывания мутантных РНК с белками in vivo (Kraemer et al., 2000). Были опубликованы работы, в которых данный метод использовался для обнаружения РНК, взаимодействующих с определенным РНК-связывающим белком (SenGupta et al., 1996), и для поиска белковых компонентов мультибелковых комплексов с РНК (Sonoda и Wharton, 1999). Для поиска белков, взаимодействующих с тРНК, тригибридная система ранее не использовалась. Единственной работой, в которой проводился анализ взаимодействия тРНК с белком, является работа, посвященная изучению специфичности взаимодействия бета субъединицы лейцил-тРНК-синтетазы Aguifex aeolicus с TPHKLC11 (Zheng et al., 2004). Принцип метода тригибридной системы представлен на рисунке (Рис.24). Один гибридный белок состоит из ДНК-связывающего домена белка LexA Е. coli, слитого с РНК-связывающим доменом белка оболочки бактериофага MS2, который взаимодействует с участком бифункциональной («гибридной») молекулы РНК. Другая часть этой РНК - ТРК1- взаимодействует со вторым гибридным белком, кодируемым случайным фрагментом библиотеки кДНК, слитым с доменом активации транскрипции дрожжевого фактора транскрипции Gal4. В случае образования такого тройственного комплекса и его взаимодействия с промоторной областью репортерных генов HIS3 и LacZ, происходи активация транскрипции последних. Экспериментальной задачей была идентификация в библиотеке последовательностей кДНК S. cerevisiae открытых рамок считывания, продукты трансляции которых взаимодействовали с ТРК1. Для этого дрожжи штамма L coat трансформировали плазмидой на основе вектора pIll/MS2-l, несущей ген гибридной РНК (Рис. 2S), состоящей из лидерной последовательности РНКазы Р, РНК фага MS2 и ТРК1 (далее pIII/MS2-l/TPKl). Клетки отбирали на среде без триптофана и урацила, поскольку данная плазмида несет селективный маркер URA3, а ген TRP1 интегрирован в геном штамма L4ocoat вместе с геном гибридного белка "LexA-MS2caat". Рнс. 2ЇГ.
Структура гибридной РНК. Цветом обозначены: Черным - лидерная последовательности РНКазы Р, красным - РНК фага MS2, синим - тРНК. Ранее в нашей лаборатории было обнаружено, что для импорта ТРК1 в митохондрии необходимо ее правильное сворачивание и аминоацилирование цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазой (bCrslp) (Tarassov и Entelis, 1992). В связи с этим необходимо было показать, что тРНК в составе гибридной РНК, использованной нами для поиска факторов импорта, способна правильно аминоацилироваться. Для этого применили метод мечения РНК с использованием периодатного окисления, который позволяет оценить уровень аминоацилирования РНК в клетках дрожжей (Borner et al., 1996b). Данный метод основан на том, что аминоацилирование защищает 3 -конец тРНК, в данном случае в составе гибридной РНК, от окисления периодатом натрия, Гибридные РНК выделяли в условиях, которые позволяли сохранить интактность аминоацилирования РНК, и потом окисляли периодатом натрия. Это приводило к окислению 2 - и 3 -гидроксигрупп тРНК в случае, если последняя была не аминоацнлирована. Затем РНК деацилировали и метили с использованием [Р32]-5 -3 -ЦДФ и Т4-РНК-лигазы, разделяли электрофоретически в денатурирующем ЛААГ и гель радоавтографировали. Для проверки уровня аминоацилирования гибридной РНК в клетках дрожжей, выделяли и анализировали общеклеточпые РНК из дрожжей штаммов YPH501 и Ljocoat, трансформированных плазмидой pIII/MS2-l/TPKl, методом мечения РНК с использованием периодатного окисления (Рис.26). На данном радиоавтографе видно, что только в клетках, несущих ген гибридной РНК, присутствует продукт мечения РНК, имеющий большую молекулярную массу, чем 5S РНК. Данные результаты свидетельствуют о том, что в штамме L ocoat ТРК1 в составе гибридной РНК успешно Клетки дрожжей штамма L coat, несущие плазмиду pIII/MS2-l/TPKl, трансформировали плазмидой pGAD/cDNA. Клоны дрожжей, где происходило взаимодействие тРНК с белками, кодируемыми фрагментами библиотеки кДНК, отбирали на селективной среде. В результате было получено 1,4 млн. клонов, что превосходит представительность библиотеки кДНК примерно в 2,3 раза. Следует отметить, что на этой стадии эксперимента клетки, в которых активация репортерного гена не зависела от присутствия гибридной РНК, исключили плазмиду pIII/MS2-l/TPKl. После этого клетки дрожжей переносили методом реплик на селективную среду без урацила, на которой способны расти только клетки, имеющие плазмиду pIII/MS2-1/ТРК1, и определяли активность Р-галактозидазы в них. Для того чтобы убедиться, что в полученных клонах активность репортерных генов зависит от присутствия гибридной РНК, из клеток дрожжей удаляли плазмиду pIII/MS2-l/TPKl и определяли активность обоих репортерных генов.
Для этого клетки пересевали с селективной среды на среду, содержащую 5-фтор-оротовую кислоту, оказывающую токсическое действие на клетки, содержащие фермент биосинтеза урацила, кодируемый геном URA3 присутствующем в плазмиде pIII/MS2-l/TPKl. После определения активности (3-галактозидазы отбирали те клоны, где фермент был активен при наличии плазмиды pIII/MS2-l/TPKl и переставал быть активным после ее потери. В результате было отобрано около 400 клонов дрожжей. Для того чтобы исключить из рассмотрения белки, неспецифически взаимодействующие с РНК, проводили скрещивание дрожжей, содержащих плазмиду pGAD/cDNA, с дрожжами, несущими плазмиду pIII/MS2-l/TPKl, или pIII/MS2-l/TPK2, содержащую ген неимпортируемой лизиновой тРНК (ТРК2), или pIII/MS2-l без гена тРНК (Рис.27). В клонах дрожжей, полученных в результате скрещивания, определяли активность обоих репортерных генов. В большинстве проанализированных клонов наблюдалось взаимодействие со всеми тремя гибридными РНК, поэтому они далее исключались нами из анализа. Было обнаружено 2 клона, активных только с ТРК1, 12 клонов - с ТРК1 и ТРК2, и 14 клонов - с ТРК1 и с РНК фага MS2. Одним из возможных путей поиска факторов импорта является сравнение результатов, полученных с использованием дву- и тригибридной систем в дрожжах. По результатам двух скринингов мы сформировали группу белков, являющихся потенциальными факторами импорта (Таблица 5). Это группа включает в себя белки, взаимодействовавшие специфически с ТРК1 (Leu9p и Pnclp), три белка, участвующих в метаболизме убиквитина (RpnSp - связывался с ТРК1 и ТРК2, Rpnl3p и Doalp - с preMsklp и с ее N-концевым доменом), и белки, идентифицированные в двугибридной системе (Alrlp, Mthlp и Pillp). Следующим шагом в изучении роли этих белков в импорте тРНК является функциональный анализ штаммов дрожжей, в которых интересующие нас гены делетированы. Данные штаммы (кроме случаев, где делеция генов является летальной -ALRI, DRS1, RPN8 и SEN1) были получены нами из компании «Euroscarf» (EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional analysis, Франкфурт, Германия).
