Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. Импорт макромолекул в митохондрии 10
2.1. Импорт белков в митохондрии 10
2.1.1. Сигнальные последовательности импортируемых белков 13
2.1.2. Претранслокациоішое разворачивание предшественников митохондриаль-ных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности 15
2.1.3. Транслокационный комплекс внешней митохондриальной мембраны (ТОМ) 16
2.1.4. Встраивание белков во внешнюю мембрану митохондрий при помощи SAM-комплекса 19
2.1.5. Импорт белков в межмембранное пространство митохондрий 20
2.1.6. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ23 и мотор транслокации 21
2.1.7. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ22 и малые Tim-белки межмембранного пространства 26
2.1.8. Экспорт белков из митохондриального матрикса 28
2.2. Импорт РНК в митохондрии 28
2.2.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших 31
2.2.2. Импорт тРНК в митохондрии растений 36
2.2.3. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей 37
2.2.4. Импорт РНК в митохондрии млекопитающих 41
2.3. Импорт ДНК в митохондрии 43
3. Материалы и методы исследования 44
3.1. Материалы 44
3.1.1. Реактивы 44
3.1.2. Коммерческие наборы 45
3.1.3. Антитела 46
3.1.4. Приборы и оборудование 46
3.1.5. Штаммы микроорганизмов 46
3.1.6. Питательные среды 47
3.1.7. Генно-инженерные конструкции 48
3.1.8. Олигонуклеотиды 52
3.2. Методы 54
3.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 54
3.2.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфо-рилирование 54
3.2.3. Лигирование 54
3.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера 55
3.2.5. Трансформация клеток E.coli 55
3.2.6. Трансформация клеток Saccharomyces cerevisiae 56
3.2.7. Определение фенотипов штаммов дрожжей S. cerevisiae 57
3.2.8. Измерение поглощения кислорода клетками 57
3.2.9. Исключение плазмиды, содержащей маркер URA3, из дрожжевых клеток 57
3.2.10. Выделение ДНК из клеток дрожжей 58
3.2.11. Выделение митохондрий из клеток дрожжей 58
3.2.12. Выделение дрожжевых митохондриальных РНК 59
3.2.13. Выделение суммарных дрожжевых тРНК в аминоацилированном состоянии 59
3.2.14. Нозерн-блот гибридизация 60
3.2.15. In vitro Т7-транскрипция 60
3.2.16. Радиоактивное мечениетРНК 61
3.2.17. Экспрессия рекомбинантных белков в клетках E.coli 62
3.2.18. Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии на колонках с никель-агарозой 62
3.2.19. Вестерн-блот гибридизация 63
3.2.20. Выделение белкового препарата, способного направлять импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 63
3.2.21. Транспорт радиоактивно меченных тРНК в изолированные митохондрии дрожжей 64
3.2.22. Митохондриальная трансляция in vivo 65
3.2.23. Метод задержки в геле 65
3.2.24. Футпринтинг 65
4. Результаты и обсуждение 67
4.1. Образование РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии дрожжей 67
4.2. Изучение структуры РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга 74
4.3. Поиск участков preMsklp, необходимых для направления импорта тРНК в митохондрии 84
4.4. Создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 не импортировалась бы в митохондрии, и изучение фенотипического эффекта такого дефекта 99
Выводы 114
Благодарности 115
Список цитируемой литературы 116
Приложение 132
- Претранслокациоішое разворачивание предшественников митохондриаль-ных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности
- Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ22 и малые Tim-белки межмембранного пространства
- Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфо-рилирование
- Изучение структуры РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга
Введение к работе
Митохондрии - это многофункциональные органеллы эукариотических клеток, обеспечивающие клетки энергией за счет окислительного фосфорилирования, участвующие в образовании железосерных кластеров, окислении жирных кислот, образовании некоторых аминокислот, а также играющие важную роль в апоптозе. Для митохондрий характерно наличие собственной ДНК и системы биосинтеза белка, однако большое число макромолекул импортируется в органеллы из цитоплазмы. Было показано, что в ряде случаев в митохондрии транспортируются не только белки, но также и тРНК. К настоящему времени импорт тРНК в митохондрии был обнаружен у простейших, ряда растений, сумчатых млекопитающих, а также у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Механизм переноса тРНК в митохондрии и его специфичность значительно отличается от вида к виду.
В случае дрожжей было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК - тРНКЛизСии (Martin et al. 1979) и тРНКГлн (Rinehart et al. 2005). Детальные механизмы импорта тРНК, а также функции импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе, остаются неясными. Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК (тРНКЛизсш далее тРЛ1) направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая (тРНКЛизиии тРЛ2) присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК (Entelis et al. 1998). Помимо этого, в нашей лаборатории было показано участие трех растворимых цито плазматических белков в импорте тРЛІ в митохондрии. Прежде всего, тРЛІ должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической лизил-тРНК-синтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsklp) (Tarassov et al. 1995b). Предполагается, что тРЛІ импортируется в митохондрии, будучи связанной с этим белком. Однако присутствия аминоацилированной тРЛІ и preMsklp не достаточно для импорта тРЛІ в митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов, направляющих ее импорт, так называемых факторов импорта. Один из таких факторов был недавно охарактеризован как гликолитический фермент енолаза (Entelis et al. 2006). Роль этого белка в процессе импорта тРНК в митохондрии остается неясной. Вопрос о функции тРЛІ в митохондриальном матриксе к настоящему моменту остается открытым. Существует предположение, что тРЛІ принимает участие в митохондриальной трансляции. Однако, эта гипотеза подтверждена только косвенными экспериментами (Kolesnikova et al. 2000). Более того, митохондриальная лизиновая тРНК дрожжей (с антикодоном cmnmsUUU, далее тРЛЗ) способна узнавать оба лизиновых кодона (AAA и AAG) в процессе митохондриальной трансляции.
Целью данной работы являлось изучение формирования комплекса между тРЛІ и preMsklp, и с использованием полученных данных, создание штамма дрожжей, в котором тРЛІ присутствовала бы исключительно в цитоплазме, и изучение фенотипического эффекта отсутствия тРЛІ в митохондриях.
Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
- оценить константу диссоциации комплекса тРЛІ-preMsklp в отсутствии и присутствии енолазы 2;
- определить, какие нуклеотиды тРЛІ становятся защищенными от действия нуклеаз в результате взаимодействия с preMsklp;
- оценить эффективность импорта тРЛІ, направляемого различными
мутантными версиями preMsklp in vitro и in vivo;
- в случае невозможности направления импорта тРЛІ той или иной мутантной версией preMsklp, оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей с соответствующей мутантной версией preMsklp;
- оценить эффективность митохондриального дыхания и митохондриальной трансляции в клетках штамма дрожжей, в которых ген preMsklp заменен на ортологичный ген грибов Ashbya gossypii.
Претранслокациоішое разворачивание предшественников митохондриаль-ных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности
Претранслокационному разворачиванию способствуют некоторые цитоплазматические факторы, к которым относятся белки - представители семейства шаперонов (Mihara and Omura 1996; Beddoe and Lithgow 2002). Имеются данные о том, что шаперон Hsp70 связывается с предшественниками митохондриальных белков и поддерживает их в развернутом состоянии. Было показано связывание очищенного Hsp70 с N-концевыми сигнальными последовательностями синтетических полипептидов, зависящее от амфифилыгости сигнальной спирали (Komiya et al. 1996). Другой шаперон, Hsp90, играет важную роль при взаимодействии белков, несущих внутренние сигнальные последовательности, с рецептором Тош70р (см. ниже) (Fan et al. 2006).
Функция поддержания развернутого состояния особенно важна для предшественников, склонных к спонтанному сворачиванию или агрегации. По всей видимости, для импорта таких белков особенно важен другой член семейства Hsp70, называющийся Hsc70. Показано, что в предшественниках митохондриальных белков имеется несколько сайтов для котрансляционного связывания Hsc70; это связывание предотвращает агрегацию белков (Mihara and Omura 1996).
Белок Msflp принимает участие в транспортировке белковых предшественников к поверхности митохондрий (Mihara and Omura 1996). Этот белок формирует стабильные комплексы с сигнальными последовательностями и зрелыми частями предшественников митохондриальных белков.
Дрожжевой гомолог бактериального ко-шаперона DnaJ, называющийся Ydjlp, также вовлечен в процесс импорта белковых предшественников в митохондрии (Beddoe and Lithgow 2002). Этот белок, скорее всего, принимает участие в транспортировке комплексов предшественников с Hsp70 к митохондриальной поверхности.
Необходимость разворачивания белковых глобул перед импортом в митохондрии обуславливается тем, что существенная часть белков импортируется в митохондрии пост-трансляционным образом, предварительно подвергнувшись фолдингу (Eilers et al. 1988). Однако ряд белков импортируется котрансляционно; в этом случае белки начинают импортироваться раньше, чем принимают свойственную им третичную структуру. Котрансляционный импорт был прямо показан для предшественников малатдегидрогеназы (Funfschilling and Rospert 1999) и фумаразы (Knox et al. 1998; Karniely et al. 2006). Также известно, что в цитоплазме дрожжевых клеток имеются рибосомы, ассоциированные с митохондриальной поверхностью, несущие мРНК предшественников многих митохондриальных белков и функционально активные (Ades and Butow 1980; Fujiki and Verner 1993). Предполагается, что именно локализация мРНК на поверхности митохондрий может обеспечивать эффективный импорт продуктов трансляции (Kaltimbacher et al. 2006), что также указывает на возможность ко-трансляционного импорта. В некоторых случаях для локализации мРНК на поверхности митохондрий важна ее 3 -нетранслируемая область (Sylvestre et al. 2003). С другой стороны, удаление из состава мРНК ее части, кодирующей сигнальную последовательность белкового предшественника, приводит к ослаблению ассоциации этой мРНК с митохондриями (Ahmed et al. 2006). Последние исследования в этой области показывают, что большинство белков, импортируемых в митохондриальный матрикс и во внутреннюю мембрану, действительно транслируются рибосомами, ассоциированными с митохондриальной поверхностью, тогда как практически все белки внешней мембраны и межмембранного пространства синтезируются в цитозоле (Garcia et al. 2007).
ТОМ-комплекс (от англ. Translocase of Outer Membrane, см. рис.2) переносит через внешнюю мембрану митохондрий все импортируемые в митохондрии белки (Pfanner and Geissler 2001). Он состоит из семи субъединиц. Три белка - Тот20р, Тот22р и Тот70р - несут рецепторную функцию, тогда как канальная функция возложена на остальные четыре - Тот40р (собственно канал), Тот7р, Тотбр и Тот5р (Moczkoetal. 1992).
Тот20р взаимодействует с N-концевыми сигнальными последовательностями белковых предшественников (Moczko et al. 1993); эти взаимодействия, в основном, носят гидрофобный характер (Mukhopadhyay et al. 2006). Tom20p состоит из трансмембранного и цитоплазматического доменов; последний специфически взаимодействует с митохондриальными сигнальными последовательностями (Brix et al. 1999). Четыре а-спирали белка Тот20р формируют стабильную структуру с гидрофобным желобом. Сигнальная последовательность (представляющая из себя амфифильную а-спираль) взаимодействует с этой структурой таким образом, что гидрофобная поверхность находится в желобе, а гидрофильная обращена в раствор (Abe et al. 2000). Недавние исследования показывают, что связывание с Тот20р не является обязательным для белковых предшественников с MTS; скорее всего, такие белки могут взаимодействовать и с другими рецепторами ТОМ-комплекса (Mukhopadhyay et al. 2006). Tom70p взаимодействует с белками, не содержащими N-концевых сигнальных последовательностей; эти взаимодействия носят гидрофобный характер (Brix et al. 1999). Подобно белку Tom20p, Tom70p состоит из двух доменов, один из которых закреплен во внешней мембране, а второй экспонирован в цитоплазму. В процессе транслокации одну молекулу импортируемого белка связывают сразу несколько молекул Тот70р, после чего белок переносится на Tom22p (Wiedemann et al. 2001). Tom22p является многофункциональным компонентом ТОМ-комплекса и играет важную структурную роль в его организации (van Wilpe et al. 1999). Этот белок состоит из двух доменов - крупного цитоплазматического и небольшого межмембранного; они соединены между собой коротким трансмембранным участком. Тот22р выступает в качестве функционального посредника между рецепторами и каналом ТОМ-комплекса (Ryan et al. 1999). К тому же, трансмембранный участок Тот22р участвует во взаимодействии между индивидуальными молекулами Тот40р; помимо этого, он регулирует пропускательную способность канала импорта белков (van Wilpe et al. 1999). Tom40p является белком, формирующим во внешней митохондриалыюй мембране катион-избирательный канал для импорта белков (Vestweber et al. 1989; Hill et al. 1998). Он образует типичную структуру 0-бочки с 8 трансмембранными доменами. Две молекулы Тот40р формируют один канал в мембране; при этом полноразмерный ТОМ-комплекс имеет в своем составе два канала (Model et al. 2002). Методом электронной микроскопии с использованием негативного контрастирования установлено, что канал, образуемый Тога40р, имеет внутренний диаметр около 20А (Hill et al. 1998). Такого размера поры достаточно для поникновения внутрь нее а-спирали и даже компактно уложенной петли (Model et al. 2002). Tom40p играет активную роль в транслокации белков через внешнюю мембрану митохондрий. Он содержит участки связывания сигнальных последовательностей и способствует направленному движению белков сквозь канал (Rapaport et al. 1997). Более того, этот белок способен «отличать» интегральные белки внешней мембраны (подвергающиеся последующему встраиванию в мембрану при помощи SAM-комплекса, см. ниже) от всех других типов импортируемых белков (Sherman et al. 2006).
Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны ТІМ22 и малые Tim-белки межмембранного пространства
Второй транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны получил название TIM22 и осуществляет встраивание интегральных белков, содержащих внутренние сигнальные последовательности, во внутреннюю мембрану (Rehling et al. 2004) (см. рис.4). Этот процесс происходит без участия АТФ, но требует наличия мембранного потенциала. Транслокон состоит из двух частей - мембранный комплекс и растворимые белки межмембранного пространства (малые Tim-белки), способствующие транспорту гидрофобных предшественников интегральных мембранных белков через межмембранное пространство.
К настоящему моменту известны 4 белка, формирующие мембранный комплекс TIM23-транслокона - Tim22p, Timl8p, Tim54p и Tim 12р. Tim22p формирует во внутренней мембране канал; его диаметр, измеренный при помощи электронной микроскопии, составляет 18А. Один функциональный транслокон состоит из двух каналов (Kovermann et al. 2002). Нужно отметить, что канал, формируемый Tim22p, может находиться в двух состояниях - в полностью открытом и частично открытом (в последнем случае его диаметр составляет 11 А). Переход из одного состояния в другое регулируется мембранным потенциалом и наличием или отсутствием внутренней сигнальной последовательности; таким образом, Tim22p несет также и рецепторную функцию (Kovermann et al. 2002). О роли белков Timl8p и Tim54p известно очень мало. С использованием ко-иммунопреципитации показано, что они взаимодействуют друг с другом; при этом они не являются необходимыми компонентами транслокационного комплекса. Возможно, эти белки необходимы для принятия белком Tim22p правильной конформации (Kovermann et al. 2002). Практически ничего не известно о белке Tim 12р. Предполагается, что он способствует передаче импортируемых белков от малых Tim-белков на мембранный комплекс, однако этому белку было посвящено очень мало исследований, так что до сих пор даже не вполне ясно, является ли он компонентом мембранного комплекса или же одним из малых Tim-белков.
Четыре так называемых малых Tim-белка (Tim8p, Tim9p, Tim Юр и Tim 1 Зр) выполняют шапероно-подобную функцию, транспортируя гидрофобные предшественники через гидрофильное межмембранное пространство. Эти белки содержат два так называемых СХ С-мотива, в которых остатки цистеина разделены тремя любыми аминокислотами. Tim8p и ТітІЗр формируют гексамерный комплекс со стехиометрическим соотношением 3:3 (КоеЫег et al. 1999; Kurz et al. 1999); аналогичный комплекс формируется белками Tim9p и TimlOp (КоеЫег et al. 1998; Adam et al. 1999). СХзС-мотивы важны как для формирования этих комплексов, так и для их функциональной активности (КоеЫег et al. 1999). Комплексы Tim8piml3p и Tim9piml0p имеют разную субстратную специфичность. Единственный белок, с которым при его импорте связываются одновременно оба этих комплекса - это Tim23p, однако комплексы взаимодействуют с разными доменами этого белка (Davis et al. 2000; Davis et al. 2006). Показано также, что эти комплексы взаимодействуют с гидрофобными участками импортируемых белков (Curran et al. 2002), защищая их, тем самым, от контакта с гидрофильным межмембранным пространством.
К настоящему моменту известен механизм встраивания белков с внутренними сигнальными последовательностями во внутреннюю митохондриальную мембрану при помощи транслокона TIM22 (см. рис.4). Такие белки транспортируются через канал во внешней мембране, формируемый белком Тот40р, в виде петли (Curran et al. 2002). Как только часть импортируемого белка проникает в межмембранное пространство, с ней сразу же связываются комплексы малых Tim-белков (Wiedemann et al. 2001); затем такие комплексы транспортируются к внутренней мембране митохондрий. В отсутствии мембранного потенциала внутренние сигнальные последовательности способны взаимодействовать с Tim22p, но не могут проникнуть в канал (Kovermann et al. 2002). При повышении мембранного потенциала до половины его физиологической величины (около 60 mV) происходит частичная транслокация импортируемого белка через канал во внутренней мембране. Скорее всего, на этой стадии главную роль играют положительно заряженные внутренние сигнальные последовательности импортируемого белка, которые входят в канал под действием электрофоретической силы и оказываются экспонированы в матрикс. Нужно отметить, что две сигнальные последовательности одновременно входят в два канала одного и того же транслокона. Показано также, что один из белков, подвергающихся такому встраиванию во внутреннюю мембрану, АТФ/АДФ-переносчик, состоит из трех функциональных модулей, каждый из которых содержит по две сигнальные последовательности. Сначала в канал проникает один из модулей, и только потом -остальные два, причем если первый модуль отсутствует, то встраивания остальных двух не происходит. Наконец, при достижении нормальной величины мембранного потенциала (около 120 mV и выше) белок полностью встраивается во внутреннюю мембрану; при этом, скорее всего, происходит объединение двух каналов одного транслокона и его латеральное открывание (Rehling et al. 2004).
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфо-рилирование
Расщепление ДНК проводили в соответствующем буфере "Biolabs" в течение 1 часа при температуре 37С. Эффективность расщепления ДНК оценивали путем разделения продуктов реакции с использованием электрофореза в 8% ПААГ. Для клонирования плазмиды после расщепления эндонуклеазами рестрикции дефосфорилировали в буфере "Promega" с использованием щелочной фосфатазы из поджелудочной железы теленка (1ед) "Promega" 1 час при 37С. Депротеинизацию проводили обработкой реакционной смеси равным объемом фенола, насыщенного Трис-HCl рН 7. После встряхивания в течение 1 минуты, центрифугировали 5 минут при 12.000 g, из полученной водной фазы осаждали ДНК прибавлением 1/10 объёма 3 М ацетата натрия (рН 4,8) и трёх объёмов этанола. Лигирование продукта ПЦР с расщепленным вектором проводили в буфере "Biolabs" с помощью 20 U Т4 ДНК-лигазы (Biolabs) при +18С в течение 2,5 ч. Реакцию останавливали прогреванием 5 минут при 60С. Для денатурации ДНК смешивали 0.9 мкг плазмидной ДНК с соответствующим олигонуклеотидом и с 1 мкл 5М NaOH, инкубировали 5 минут при комнатной температуре, затем охлаждали и переосаждали этанолом по стандартной методике и растворяли в 10 мкл буфера для отжига (40мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2,50MMNaCl). В 4 пробирки эппендорф помещали по 2.5 мкл терминирующей смеси нуклеотидов, содержащей 20мкМ одного дидезоксииуклеотида "Fmol Sequencing System" (Promega) и по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидов. Инкубировали 5 минут при 37С, затем к каждой пробе добавляли 3 мкл меченой ДНК и инкубировали 5-Ю минут при 37С. Реакцию останавливали прибавлением к каждой реакции по 4 мкл раствора, содержащего ЮмМ NaOH, 0.5% формамида, 0.05% бромфенолового синего, 0.05% ксиленцианола. Далее проводили анализ проб электрофоретическим разделением в 6% ПААГ с 8М мочевиной в буфере ТБЕ. Перед разделением проб электрофоретически пробы прогревали 2-3 минуты при 98С. После проведения электрофореза гель фиксировали в 10% уксусной кислоте, высушивали и радиоавтографировали. Клетки E.coli выращивали в жидкой среде LB при температуре 37С в течение ночи при покачивании.
Для получения компетентных клеток использовали культуру в логарифмической фазе роста (оптическая плотность Абоо=0.8-1.0). Далее все операции проводили в полустерильных условиях при 4С. Клетки осаждали центрифугированием 10 минут 1000 g, трижды промывали водой (половиной исходного объема культуры), затем таким же объемом раствора стерильного 10% глицерина. Осадок клеток суспендировали в небольшом объеме 10% глицерина, после чего полученные компетентные клетки охлаждали на ледяной бане и проводили электропорацию. К 50 мкл клеток прибавляли охлажденный раствор плазмидной ДНК (ок. 100 мкг), помещали в кювету "Biorad" (о!=2мм) и подвергали действию электрического тока (сопротивление 200 Ом, емкость 25 мкФ, напряжение 2,5 кВ) при помощи прибора "Bio-Rad E.coli Pulser". После электропорации к клеткам добавляли 100 мкл среды LB, инкубировали их 15 мин-1 ч при 37С при покачивании и высевали на твердую среду LB, содержащую соответствующий антибиотик. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора «Quantum Prep: Plasmid Miniprep Kit» фирмы "Bio-Rad". Клетки дрожжей выращивали в 10 мл богатой среды YPD при 30С при покачивании до Абоо=1.0.
Далее все операции проводили в полустерильных условиях при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 g в центрифуге Beckman L6-HC, дважды промывали 5 мл буфера ТЕ, содержащего ЮОмМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ ЭДТА. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл 100 мМ ацетата лития, после чего осаждали при 12.000 g в течение 15 с. Затем клетки повторно ресуспендировали в 100 мМ ацетата лития до конечного объёма 500 мкл. Приготовленные таким образом компетентные клетки немедленно трансформировали плазмидной ДНК. Для одной трансформации использовали 50 мкл суспензии компетентных клеток. Непосредственно перед трансформацией клетки осаждали центрифугированием при 12.000g в течение 15 с, супернатант сливали, а к осадку клеток прибавляли следующие растворы (в указанном порядке): 50% (w/v) ПЭГ 4000 - 240 мкл; 1 М ацетат лития - 36 мкл; ДНК спермы лосося (2 мг/мл), предварительно прогретая в течение 5 мин при 100С и немедленно охлаждённая во льду, - 50 мкл; плазмидная ДНК - 0,5 мкг, или 5 мкл; стерильная бидистилированная вода - 29 мкл; ДМСО-40мкл. Клетки тщательно ресуспендировали, трансформационную смесь инкубировали при 30С в течение 30 мин, время от времени перемешивая. Затем клетки подвергали тепловому шоку при 42С в течение 30 мин, после чего осаждали центрифугированием при 12.000 g в течение 15 с, супернатант осторожно удаляли. Клетки очень аккуратно ресуспендировали в 200 мкл стерильной воды, высевали на твёрдую среду и инкубировали при 30С в течение 2-5 сут.
Изучение структуры РНК-белкового комплекса, приводящего к импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга
При образовании РНК-белковых комплексов те нуклеотиды РНК, которые непосредственно вовлечены во взаимодействие с аминокислотами белка, становятся защищенными от действия РНКаз. Помимо этого, некоторые нуклеотиды могут становиться более доступными для РНКаз в результате взаимодействия РНК с белком. Именно на этом основан метод футпринтинга. Мы обрабатывали РНКазами комплексы тРЛІ с Krslp и preMskl, tr93 с preMskl, а также свободные тРНК. Перед образованием комплекса с preMskl тРЛІ была предварительно аминоацилирована при помощи рекомбинантной Krslp, в то время как tr93 импортируется в деацилированной форме и не нуждается в предварительном аминоацилировании. Мы использовали несколько различных РНКаз: 1. Химическую нуклеазу Fe /Н2О2/ЭДТА, разрезающую РНК независимо от ее вторичной структуры; 2. Нуклеазу ТІ, специфически действующую на остатки гуанина в РНК; 3. Нуклеазу S1, действующую только на неспаренные нуклеотиды РНК; 4. Нуклеазу VI, действующую только на спаренные нуклеотиды РНК. Две последние РНКазы использовались для оценки изменения вторичной структуры тРЛІ в результате ее взаимодействия с белками. тРНК фосфорилировались радиоактивным Р как с 5 -, так и с 3 -конца, так как фрагменты РНК длиной 45-50 нуклеотидов и более невозможно отделить друг от друга с достаточным разрешением в используемой электрофоретической системе. Таким образом, информация о первых 35-40 нуклеотидах тРНК поступала из опытов с 5 -меченной тРНК, а об остальной части тРЛІ - из опытов с З -меченной тРНК. Ниже представлены результаты экспериментов по футпринтингу. Эксперименты по комплексообразованию и футпринтингу были повторены минимум три раза для каждой пары тРНК-белок. После обсчета результатов (количественной оценки защищенности/выставленности нуклеотидов при помощи программы MacBas2000) для каждого нуклеотида тРНК была получена информация о его взаимодействии с белком. Результаты подсчета представлены на рис. 24-26.
Для того, чтобы оценить достоверность метода футпринтинга, мы провели исследование комплекса тРЛ1 с Krslp. Этот белок принадлежит к классу 2Ь аминоацил-тРНК-синтетаз; для дрожжевой аспартил-тРНК-синтетазы, принадлежащей к тому же классу, известна кристаллическая структура ее комплекса с соответствующей тРНК (Cavarelli et al. 1993), а также информация по изучению данного комплекса методом футпринтинга (Rudinger et al. 1992). Мы предположили, что структура комплекса тРЛ1- Krslp должна в той или иной мере быть схожей со структурой аспартил-тРНК-синтетазы с тРНКАсп (см. рис. 27). Полученные нами данные говорят о том, что такая схожесть действительно имеет место. Единственное значимое отличие заключается в том, что нуклеотиды антикодоновой петли (33, 34, 35), которые должны быть вовлечены во взаимодействие с аминоацил-тРНК-синтетазой, в случае тРЛ1, напротив, становятся экспонированы в результате взаимодействия с Krslp. Это можно объяснить тем, что химическая нуклеаза Fe2+/H2(V3fl,TA, которая использовалась в нашей работе, обладает слабой чувствительностью к нуклеотидам, вовлеченным в стэкинг-взаимодействия. Известно, что именно эти три нуклеотида образуют стэкинг-структуру, которая нарушается в результате взаимодействия с аминоацил-тРНК-синтетазой. Возможно, именно поэтому нуклеаза обладает повышенным сродством к ним. Убедившись, что с помощью данного метода можно исследовать структуру РНК-белковых комплексов, мы приступили к изучению комплексов тРЛІ-preMsklp и tr93- preMsklp. Оказалось, что комплекс тРЛІ-preMsklp значительно отличается от комплекса тРЛ1-Krslp.
Подавляющее большинство нуклеотидов тРЛ1 становятся защищенными от действия нуклеаз в результате взаимодействия с preMsklp. Судя по всему, можно говорить об «обволакивании» тРЛ1, так, что большая ее часть находиться как бы «внутри» preMsklp. С одной стороны, такая структура комплекса должна обеспечивать экранирование отрицательных зарядов молекулы тРЛ1 при ее импорте в митохондрии (что, скорее всего, является необходимым в связи с тем, что митохондриальные мембраны также заряжены отрицательно). Возможно, две молекулы preMsklp одновременно связываются с одной молекулой тРЛ1.
