Содержание к диссертации
I. ВВЕДЕНИЕ 8
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
«СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОСИНТЕЗА ЕЕ КОМПОНЕНТОВ» 11
1.ГЛЮКАН 14
1.1. Строение и локализация глюкана в клеточной стенке 14
1.2.Биосинтез рі,3-глюкана 15
1.3. Встраивание р 1,3-глюкана в клеточную стенку 16
1.4. Биосинтез и встраивание рі,6-глюканов 19 2.ХИТИН 20
2.1. Локализация в клеточной стенке 20
2.2. Основные этапы биосинтеза хитина 1
3. БЕЛКИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ - ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И
РАЗНООБРАЗИЕ 25
3.1. Экстракция белков из клеточной стенки 25
3.2.0-маннозилированые белки 26
З.З.Ы-маннозилированые белки 27
3.4.Белки, содержащие остаток гликозил-фосфоинозитольного «якоря» 28
3.5. Основные этапы биосинтеза N- и О связанных маннозных цепей и ферменты, их осуществляющие 32 3.5.1 Биосинтез О-гликозидных цепей 3 2 3.5.2. Биосинтез N-гликозидных цепей 35
3.6. Разнообразие белков клеточной стенки дрожжей 3.6.1. Белки, экстрагируемые детергенами и тиоловыми реагентами при нагревании 38
3.6.2. Белки, экстрагируемые глюканазами 41
3.6.3. Белки, экстрагируемые щелочью 43
3.7. Регуляция экспрессии белков ковалентно связанных с глюканом клеточной стенки
дрожжей 46
4 СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИДРОЖЖЕЙ И РОЛЬ БЕЛКОВ В ФОРМИРОВАНИИ И ПОДДЕРЖАНИИ ЕЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ 49
ЗАКЛЮЧЕНИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 57
1. Используемые в работе реактивы 57
2. Используемые в работе штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 57
3. Выделение ДНК 3.1. Выделение плазмидной ДНК 59
3.2. Выделение ДНК из дрожжей 61
3.3. Выделение ДНК из грибов 61
3.4. Выделение ДНК из бактерий и архебактерий 4. Выделение РНК из дрожжей 62
5. Электрофоретические методы 5.1. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 62
5.2. Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях 63
6. Методы клонирования 64
6.1. Ферментативная обработка ДНК 64
6.2. Введение чужеродной ДНК в клетку Е. coli 6.2.1. Трансдукция Е. coli бактериофагом лямбда 64
6.2.2. Трансформация E.coli 64
6.2.3. Трансформация дрожжей 6.3. Создание геномной библиотеки Candida utilis 65
6.4. Библиотека генов Hansenula polymorpha 7. Радиоактивное мечение плазмид и фрагментов ДНК ник-трансляцией 67
8. Секвенирование ДНК 68
9. Саузерн-блот гибридизация 10. Нозерн-блот гибридизация 70
11. ПЦР-амплификация 70
12. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения 71
13. Выделение клеточных стенок дрожжей 71
14. Депротеинизация КС дрожжей с помощью трипсина и проназы, а также NaOH 72
15. Экстракция белков из КС дрожжей (Mrsa et al., 1997 в нашей модификации) 72
16. Выделение и анализ белков среды роста дрожжей 16.1. Выделение белков из среды роста дрожжей 74
16.2. Анализ устойчивости белков среды роста к действию трипсина 17. Получение внутриклеточного содержимого клеток дрожжей 74
18. Получение антител к белку с молекулярной массой 33 кДа 74 19. Вестерн-блот анализ 75
20. Определение количества компонентов в изолированных КС дрожжей 20.1. Определение количества белков в изолированных КС дрожжей 75
20.2. Определение количественного содержания полисахаридов КС 76
20.3. Определение содержания аминосахаров 76
21. Выделение и очистка белков 77
21.1. Выделение клостридиопептидазы А 77
21.1.1. Очистка клостридиопептидазы А на ДЕАЕ-целлюлозе 77
21.1.2. Очистка клостридиопептидазы А препаративным электрофорезом 77
21.2. Хроматография культуральной жидкости Bacillus brevis штамм 5.4 на
аффинных сорбентах бацитрацин-аминосилохолм и фенилборонат-сефароза 78
21.3. Выделение белков с молекулярной массой 116 и ЗЗкДа из клеточной стенки
дрожжей Candida utilis 79
21.4. Выделение хитиназы из среды роста дрожжей 80
21.4.1 Получение коллоидного хитина 80
21.4.2. Выделение хитиназы 80
22. Определение активности ферментов 81
22.1. Активность коллагеназ 81
22.2. Общая протеолитическая активность 82
22.3. Маннозидазная и глюкозидазная активности 82
22.4. Активность аминопептидаз 82
22.5 Активности Р-глюканазы, хитиназы и инвертазы 83
22.6. Определение лирической активности и обработка клеток и клеточных стенок
гидролазами 83
23. Определение количества белка 83
24. Определение числа клеток и клеточных стенок дрожжей 84
25. Определение выхода инвертазы из клеток дрожжей 84
26. Определение чувствительности клеток дрожжей к ингибиторам роста
26.1. Определение чувствительности клеток к Calcofluor white и Congo red 84
26.2. Определение чувствительности клеток дрожжей к Никомицину
27. Определение аминокислотного состава белка 85
28. Получение и анализ смеси пептидов 85
29. Определение N-концевой последовательности аминокислот
30. Вестерн-блот анализ 86
31. Микроскопические методы
31.1. Электронная микроскопия клеток и КС дрожжей 87
31.2. Окрашивание клеток дрожжей Candida utilis примулином 87
31.3. Окрашивания клеток дрожжей Калькофлюором 88 32. Зональное центрифугирование клеток дрожжей 88
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 89
1. Обнаружение в клеточной стенке дрожжей белков, выполняющих роль 89
структурных элементов
1.1. Выделение сериновой протеиназы из культуральной жидкости Bacillus brevis. 89
1.2. Изучение действия сериновой протеиназы из культуральной жидкости
Bacillus brevis на стенки и клетки дрожжей 98
1.3. Обнаружение в клеточной стенке дрожжей белков, гидролиз которых приводит к
деструкции клеточной стенки. 101
1.4.Идентификация и изучение роли белка с молекулярной массой 11 бкДа (Р116) из
клеточных стенок дрожжей Candida utilis 108
1.5.Идентификация белка с молекулярной массой 33 кДа (РЗЗ) как глюкантрансферазы
Bgl2p 111
1.5.1. Выделение и характеристика РЗЗ 112
1.5.2. Определение последовательности гена, кодирующего белок с молекулярной
массой 33 кДа из КС дрожжей Candida utilis 113
2. Изучение роли глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры
КС дрожжей 115
2.1. Получение штамма дрожжей S.cerevisiae, лишенного гена BGL2 115
2.2. Изучение культуральных свойств штамма с нарушенным геном BGL2 117
2.3. Сравнительный анализ количества хитина и других компонентов КС дрожжей bgl2 120
2.4. Анализ встраивания хитина в клеточные стенки дрожжей штамма bgl2 120
2.5. Выявление роли хитинсинтаз в биосинтезе "дополнительного" хитина в
штамме bg!2 122
3. Изучение роли GPI-заякоренных белков во встраивании SEP белков в КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae 123
4. Изучение роли О-маннозилированных белков в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей 128 4.1 .Выбор объекта исследования 129
4.1.1. Сравнительный анализ структурной роли белков и полисахаридов в клеточных стенках дрожжей, Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae 130
4.2. Изучение роли О-гликозилированных белков для формирования молекулярного
ансамбля клеточной стенки Hansenula polymorpha 135
4.2.1. Получение штамма Hansenula polymorpha с делецией гена РМТ1 137
4.2.2. Определение уровня О-гликозилирования у штамма Hansenula polymorpha с нару шенным геном НрРМТІ на примере хитиназы 138
4.2.3. Фенотипические проявления при нарушении гена РМТ1 у дрожжей Hansenula polymorpha 140 4.2.4. Сравнение состава клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha исходного штамма и pmtl дизруптанта.
1 4.2.5. Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha исходного штамма и pmtl дизруптанта 142
4.2.6. Электронная микроскопия дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенным геном
РМТ1 146
5. Исследование белков и геномных последовательностей дрожжей, содержащих
элементы гомологии с альфа цепью коллагена высших 150
5.1. Идентификация коллагено подобных последовательностей в белках дрожжей Candida utilis с использованием клостридиопептидазы 150
5.2. Определение влияния коллагеназы на некоторые гидролизные активности,ассоциированные с клеточной стенкой дрожжей. 152
5.3. Идентификация геномных последовательностей микроорганизмов, гомологичных
кДНК спиральной части молекулы коллагена цыпленка 155
5.4. Изучение фрагмента геномной ДНК дрожжей Candida utilis, гомологичного генам
коллагена 1 типа 159
5.4.1.Клонирование фрагмента геномной ДНК С. utilis, гомологичного кДНК спиральной
части молекулы коллагена I типа 159
5.4.2. Анализ нуклеотидной последовательности pCUl 161
5.4.3. Выявление 54 п.н.-коллагенового модуля в клонированной дрожжевой последовательности 163 V ЗАКЛЮЧЕНИЕ 166 ВЫВОДЫ 167 ПРИЛОЖЕНИЕ 168 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 172
Введение к работе
Изучение поверхности клеток микроорганизмов является в настоящее время одной из актуальных проблем молекулярной и клеточной биологии. Клеточная стенка (КС) представляет собой внешнюю часть одного из важнейших компартментов клетки дрожжей - клеточной оболочки в которую входят, также, плазматическая мембрана и так называемое периплазматическое пространство. Помимо очевидной роли наружного скелета дрожжей от которого зависит поддержание формы клетки, а также ее устойчивость к внешним воздействиям КС является физиологически активной органеллои, которая участвует в осуществлении комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей средой. В КС закрепляются рецепторы, воспринимающие сигналы из внешней среды и антигены, определяющие иммунологические свойства организма, она участвует в процессе транспорта различных соединений из внешней среды в цитоплазму и обратно, а также является компартментом, в котором начинается расщепление питательных субстратов. КС весьма динамична: перестройками в ее молекулярной структуре сопровождаются такие процессы как флоккуляция, спаривание и переход к псевдогифальному росту. КС изменяется в зависимости от стадии и условий роста культуры, а также стадии клеточного цикла дрожжей. В то же время она является весьма стабильной структурой, общий план строения и функциональная дееспособность которой поддерживаются клетками в различных, даже экстремальных условиях.
КС целиком покрывает дрожжевую клетку и состоит из маннопротеинов , глюкана и хитина (Klis,1994) минорными компонентами клеточной стенки являются липиды и полифосфаты. Строение и пути биосинтеза полисахаридов КС дрожжей в основных чертах были изучены к 80-м годам прошлого столетия (Вагабов, 1988). После этого стало очевидно, что без детального знания не только полисахаридов, но и белков входящих в состав клеточной стенки невозможно понять роль отдельных компонентов в процессе формирования ее молекулярного ансамбля и, в конечном итоге, определить как устроена и как функционирует сама КС дрожжей (Farkas,1985).
К началу данной работы вопрос о существовании в КС дрожжей белков, выполняющих конкретные функции был весьма спорным. Многие исследователи полагали, что истинным местом локализации белков различной степени гликозилирования (в основном ферментов), выделяемых из препаратов КС является цитоплазматическая мембрана периплазматическое пространство или внутриклеточное содержимое. С другой стороны в ряде работ маннопротеиновый компонент КС дрожжей было принято рассматривать как пептидоманнан функции которого сводились к формированию на поверхности клетки полисахаридных антигенных детерминант. Схемы строения КС дрожжей носили формальный характер и демонстрировали лишь возможную компановку маннопротеинового и глюканового слоев без учета разнообразных функций, выполняемых этой органеллой. Практически полностью отсутствовали представления о том каким образом из полимеров, синтезированных внутри клетки и на цитоплазматической мембране происходит сборка и формирование уникального молекулярного ансамбля клеточной стенки, находящейся вне цитоплазмы, снаружи от цитоплазматической мембраны и отделенной от нее периплазматическим пространством. Подобную ситуацию, отчасти, можно было объяснить недостаточным уровнем знаний о строении, способах закрепления и функциях белков, входящих в состав клеточной стенки дрожжей.
Первыми свидетельствами важной роли белков в качестве структурного элемента явились данные о лизисе клеточных стенок протеолитическими ферментами (Obata et al 1977). К началу данной работы в литературе, также, начали появляться сведения о том, что в клеточной стенке дрожжей содержаться ферменты (Correa et al 1982;), большинство из которых является гидролазами. Тем не менее долгое время способ встраивания белков в клеточную стенку был неизвестен. Первоначально полученные данные были разрознены, и, зачастую, противоречивы, поскольку систематического изучения белков клеточной стенки дрожжей в то время не проводили.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение обнаруженных ранее и поиск новых белков, играющих важную роль в формировании КС дрожжей различной таксономической принадлежности и получение ответа на вопрос какова роль белков в создании, поддержании целостности и динамичном функционировании сложного молекулярного ансамбля КС дрожжей. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
- Обнаружение и частичная характеристика белков, входящих в состав КС дрожжей, а также выявление способов их закрепления и закономерностей встраивания.
- Изучение роли белков как структурных элементов КС, скрепляющих молекулы полисахаридов в единый молекулярный ансамбль.
- Выявление общих черт и особенностей строения КС дрожжей различной таксономической принадлежности в частности традиционно изучаемых дрожжей Saccharomyces cerevisiae и представителей так называемых «несахаромицетных» дрожжей Candida utilis и Hansenula pofymorpha, сравнительный анализ роли белков в формировании молекулярного ансамбля их КС. Сравнение способности отдельных компонентов компенсировать нарушения, происходящие в структуре их КС.
- Изучение вопроса о присутствии в белках клеточной стенки дрожжей коллагеноподобных элементов, содержащих последовательности, гомологичные важнейшему структурному белку высших эукариот - коллагену.
П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ И ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОСИНТЕЇА ЕЕ КОМПОНЕНТОВ
Клеточная стенка целиком покрывает дрожжевую клетку, нарушая монотонность своего строения только в области образования и отделения дочерней клетки. V наиболее интенсивно изучаемых дрожжей, размножающихся почкованием, (в первую очередь Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans) эта область носит название зоны почкования. От цитоплазматической мембраны клеточная стенка отделена периплазматическим пространством .
Электронная фотография клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae (хЮОООО). МПС- маннопротеиновый слой; ГС -глюкановый слой; ЦПМ - цитоплазматическая мембрана; ПП периплазматическое пространство.
Общая масса клеточной стенки дрожжей может достигать 25% от массы всей клетки, толщина ее колеблется в пределах 1000-2500 А° Она состоит на 40-50% из маннопротеинов и на 2% - из хитина; остальное приходится на полимер глюкозы глюкан (Klis, 1994) .
Как правило, рі,3-глюкан содержит некоторое количество р1,6-связей. В свою очередь, в рі,6-связанном глюкане присутствуют Р1,3-связанные остатки глюкозы. вДанный тип глюкана в КС дрожжей, по-видимому, ковалентно связан с хитином, что обусловливает его устойчивость к воздействию кислоты и щелочи.
Глюкан является важным структурным компонентом клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности. Под термином «дрожжевой глюкан» в настоящее время объединяют несколько типов молекул полисахарида, образованных в основном pl,3- и Р1,6-связанными остатками глюкозы (Manners et al., 1974; Duffus et al., 1982). Глюкан локализован как в латеральной клеточной стенке, так и в зоне почкования, которая по составу отличается от остальной поверхности главным образом высоким содержанием хитина.
Хитин - минорный, но чрезвычайно важный компонент клеточной стенки дрожжей - представляет собой полимер с Р1,4-связанными остатками N-ацетилглюкозамина. Примерно 90% этого соединения находится в области образования и отделения дочерних клеток - почек. В этой зоне хитин участвует в построении первичной перегородки - септы между материнской и дочерней клетками и образует жесткое кольцо, защищающее канал между ними. В латеральной клеточной стенке локализовано примерно 10% хитина.
Маннопротеиновый компонент клеточной стенки долгое время считали пептидоманнаном, а саму клеточную стенку представляли как инертную структуру, состоящую в основном из полисахаридов, основная роль которой сводится к защите протопласта от механического повреждения.
Электронная микроскопия дала исследователям первые представления о взаимном расположении отдельных компонентов КС. Было показано, что глюкан и хитин формируют внутренний, менее электронноплотный слой, наблюдаемый при электронной микроскопии. Наружный, более электронноплотный слой, сфомирован маннопротеинами.
В последнее время наметился существенный прогресс в развитии наших представлений о строении и функциях клеточной стенки дрожжей. Показано, что она представляет собой динамичную, полифункциональную и физиологически активную органеллу, которая отвечает за осуществление комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей средой. Клеточная стенка выполняет функцию наружного скелета. В КС располагаются рецепторы и она играет важную роль в иммунологических реакциях и, кроме того, она участвует в осуществлении контроля метаболических процессов факторами внешней среды. В значительной степени этот прогресс связан с успехами, достигнутыми в последние годы в области изучения структуры и функций белков различной степени гликозилирования, которые формируют маннопротеиновй компонент этой органеллы.
Еще не так давно весьма спорным вопросом было само существование белков в клеточной стенке дрожжей. Многие исследователи полагали, что как ферменты, так и структурные белки, выделяемые из препаратов клеточной стенки, являются примесями внутриклеточного содержимого. Совершенствование методов биохимии и молекулярной биологии привело к резкому увеличению объема информации о структуре белков клеточной стенки дрожжей и той роли, которую они играют в формировании молекулярного ансамбля этой органеллы. Накопленный фактический материал, позволяет более полно представить не только роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей, но и дополнить представления о ее структуре.
В данном обзоре сделана попытка обобщить и проаналировать накопленные к настоящему времени данные о строении отдельных компонентов и структуре самой КС дрожжей, а также роли белков в формировании и поддержании целостности ее молекулярного ансамбля. В обзоре литературы приведены сведения представляющие современное состояние освещаемых вопросов, а также результаты исследований полученные (в основном) в последние годы. В первую очередь сказанное относится к работам, посвященным изучению белков клеточной стенки. В начале нашего исследования данные о белках клеточной стенки дрожжей в литературе практически отсутствовали Все результаты , описанные в разделе, посвященном белкам клеточной стенки были получены и опубликованы в то время, когда мы начали и активно осуществляли наши исследования.
Похожие диссертации на Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей
