Содержание к диссертации
Введение
1.Введение 7
2. Глюканазы и их роль в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей.
1. Введение 10
2. Молекулярная организация клеточной стенки дрожжей 11
2.1. Глюкан 11
2.2. Хитин 14
2.3. Маннопротеины 17
2.3.1. N-маннозилирование 17
2.3.2. О-маннозилирование 19
2.3.3. Белки, содержащие гликозил-фосфоинозитольный якорь 20
2.4. Связь макромолекул в составе клеточной стенки дрожжей 23
2.4.1. Ковалентные связи между полисахаридными компонентами в составе клеточной стенки дрожжей 23
2.4.2. Типы встраивания белков в клеточную стенку дрожжей 23
2.4.3. Модульная организация клеточной стенки дрожжей 25
3. Известные глюканазы дрожжей: основные характеристики 28
3.1. Семейство GH5 28
3.2. Семейство GH81 30
3.3. Семейство GH16 31
3.4. Семейство GH72 32
3.5. Семейство GH17 34
4. Регуляция экспрессии генов, кодирующих ферменты, обладающие глюканазной активностью 36
4.1. Зависимая от клеточного цикла регуляция экспрессии генов «глюканаз» 36
4.2. Стресс индуцируемая регуляция экспрессии генов 38
5. Функции «ГЛЮКАНАЗ» 41
6. Заключение и постановка задач исследования 44
3. Материалы и методы 46
1. Используемые в работе реактивы 46
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания 46
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов 47
3.1. Среды для выращивания Е. coli 47
3.2. Среды для выращивания дрожжей 47
4. Использованные в работе плазмиды 48
5. Определение чувствительности дрожжей к присутствию в среде культивирования Конго красного и додецилсульфату натрия 48
6. Трансформация клеток Е. coli 48
7. Трансформация клеток дрожжей 49
8. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 49
9. Выделение суммарной ДНК дрожжей 50
10. Электрофоретические методы 50
10.1. Электрофорез в агарозном геле 50
10.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 51
11. Вестерн-блот анализ 51
12. Окраска белков при помощи Кумасси 52
13. Окраска белков при помощи нитрата серебра 52
14. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения 53
15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 53
16. Выделение клеточных стенок дрожжей 54
17. Обработка клеточных стенок протеиназой К 55
18. Экстракция белков из предварительно биотинилированных клеточных стенок дрожжей (Mrsa et al., 1997) 55
19. Выделение глюкантрансферазы Bgl2p из клеточных стенок дрожжей 56
20. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков 56
21.Фракционирование клеток для получения препаратов белков изолированной плазматической мембраны и внутриклеточного содержимого 57
22. Измерение суммарного белка в препарате 57
22.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду (Bradford, 1976) 57
22.2 Определение концентрации белка по Лоури (Lowry et al., 1951) 57
23. Измерение суммарного клеточного белка (микробиуретовый метод) 58
24. Анализ карбоксипептидазы Y (СРY) 58
25. Анализ глюкозоксидазы, секретируемой клетками Н. polymorpha 58
26. Электронно-микроскопические методы 59
26.1 Электронная микроскопия клеток дрожжей 59
26.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы Bgl2p 59
27. Спектроскопия кругового дихроизма 60
28. Изучение связывания красителя Конго красного (КК) 60
29. Изучение связывания флуоресцентного красителя Thioflavine Т (ThT) 60
30. Прочие методы 60
30.1 В ходе работы применяли стандартные методики частной генетики дрожжей 60
30.2 Определение количества полисахаридных компонентов в изолированных КС дрожжей 61
4. Результаты и обсуждение 62
1. Получение изогенных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae с делениями генов BGL2 и GAS1, а так же с одновременным нарушением обоих указанных генов 62
2. Сравнительный фенотипический анализ полученных штаммов Saccharomyces cerevisiae с нарушенными генами BGL2 и GAS1 64
3. Получение и характеристика штамма дрожжей Hansenula polymorpha, лишенного гена BGL2 68
4. Получение штамма дрожжей Hansenula polymorpha с нарушенной глюкантрансферазой Gas 1 р 71
4.1. Анализ белков клеточной стенки Ауріб мутанта 76
4.2. Анализ белков цитоплазматической мембраны Аур(6 мутанта 76
4.3. Анализ вакуолярного белка карбоксипептидазы Y (CPY) 77
4.4. Анализ секретируемого белка глюкозооксидазы (ГО) 79
4.5. Фенотипический анализ штамма Aypt6 дрожжей Н. polymorpha 80
5. Выявление нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей S. cerevisiae в отсутствии глюкантрансфераз Bgl2p и Gaslp 82
6. Изучение конформационных особенностей глюкантрансферазы Bgl2p дрожжей S. cerevisiae 83
6.1. Подбор условий для экстракции Bgl2p из клеточной стенки в нативной конформации 86
6.1.1. Экстракция Bgl2p с помощью глюканазы 86
6.1.2. Экстракция Bgl2p с помощью мягких термических обработок 91
6.2. Физико-химические характеристики фибрилл, образованных in vitro глюкантрансферазой Bgl2p 95
6.2.1. Определние вторичной структуры глюкантрансферазы Bgl2p 96
6.2.2. Связывание Конго Красного 97
7. Изучение физиологической роли белка Bgl2p дрожжей Saccharomyces cerevisiae, способного формировать амилоидные фибриллы 100
Выводы 106
- Молекулярная организация клеточной стенки дрожжей
- Регуляция экспрессии генов, кодирующих ферменты, обладающие глюканазной активностью
- Электрофоретические методы
- Выявление нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей S. cerevisiae в отсутствии глюкантрансфераз Bgl2p и Gaslp
Молекулярная организация клеточной стенки дрожжей
Клеточная стенка полностью покрывает дрожжевую клетку, являясь ее наружным скелетом и обеспечивая взаимодействие между микроорганизмом и окружающей средой. КС подвергается постоянным перестройкам в течение всей жизни клетки (Калебина и Кулаев, 2001; Klis et al., 2002). В зависимости от условий роста общая масса клеточной стенки дрожжей может колебаться от 10 до 25% от массы всей клетки, толщина ее колеблется в пределах 1000-2500 A0 (Aguilar-Uscanga and Francois, 2003). Более чем на 50% она состоит из глюкана, остальная доля в основном приходится на маннопротеины ( 40%) и хитин (менее 5%) (Klis, 1994; Klis et al., 2002; Yin QY et al. 2005) (см. табл.1). Таблица 1. Компоненты клеточной стенки дрожжей. Компоненты Кол-во Основной тип Степень Мга Молекул клеточной стенки (% от КС) связи полимеризации (кДа) на клетку хЮ"6 Маннопротеины 30-50 ocl,6+al,3+al,2 от 10до 450 2,6 Глюкан (31,3-глюкан 30-45% бр1,3 1500 243 2,5 Р1,6-глюкан 5-10% бр1,6 140 23 6,6 Хитин 1,5-6% рі,4 а ориентировочная средняя величина молекулярной массы бКак правило, рі,3-глюкан содержит некоторое количество р1,6-связей. В свою очередь, в р1,6-связашюм глюкане присутствуют Р 1,3-связанные остатки глюкозы. "Данный тип глюкана в КС дрожжей, по-видимому, ковалентно связан с хитином, что обусловливает его устойчивость к воздействию кислоты и щелочи. 2.1 ГЛЮКАН Как уже была сказано ранее, глюкан является важным структурным компонентом клеточной стенки, ответственным за поддержание ее прочности. Под термином «дрожжевой глюкан» в настоящее время объединяют несколько типов молекул полисахарида, образованных в основном рі,3- и рі,6-связанньши остатками глюкозы (Manners et al., 1974; Duffus et al., 1982). Глюкан локализован как в латеральной клеточной стенке, так и в зоне почкования, которая по составу отличается от остальной поверхности главным образом высоким содержанием хитина. На долю рі,3-глюканов приходится в среднем около 50% массы стенки (Lipke and Ovalle, 1998), что составляет более 80% общего количества глюканов. рі,3-глюкан формирует сеть с длинной фибрилл около 600 нм. По-видимому, именно эта структура формирует жесткий каркас клеточной стенки (Kopecka et al., 1974). рі,6-глюкан - высокоразветвленный полимер, исполняющий роль связующего звена между отдельными модулями и компонентами КС. Данный вид глюкана представляет собой сильно разветвленные молекулы, в которых мономеры глюкозы (около 350 на молекулу полимера) соединены между собой, в основном, рі,6-связями с рі,3-связанньши остатками (до 20%) в местах разветвления (Manners et al., 1974; Kollar et al., 1997).
Часть глюкана может быть ковалентно связанна с хитином (Kollar et al., 1995). Хитин-связанные Р1,3-глюканы играют, по-видимому, основную роль в поддержании формы клетки и придают жесткость структуре КС (Kopecka et al., 1974; Fleet and Manners, 1976). Хитин-связанные Р1,6-глюканы играют важную роль в закреплении ковалентно с ними связанных GPI (Glycosyl Phosphat Inositol) -заякоренных белков преимущественно в условиях стресса для клеточной стенки (Kapteyn et al., 1997). Существует мнение, что в клеточной стенке дрожжей молекулы рі,3-глюкана могут быть напрямую ковалентно связаны с маннаном - полимером, состоящим из остатков маннозы (Klis et al., 2006). По способу экстракции глюканы можно разделить на три основных типа. Предполагается, что функции у этих типов глюканов различны. Щелочерастворимый глюкан, выделяемый из клеточных стенок дрожжей в результате их обработки раствором щелочи на холоду, впервые обнаружен у Saccharomyces cerevisiae, где на его долю приходится до 20% от исходного материала стенки (Eddy and Woodhead, 1968). Детальное изучение этой фракции глюканов показало, что она состоит в основном из р1,3-связанных остатков глюкозы и только 8-12 % остатков сахара соединены р1,6-связями. Они соединяют линейные цепи, построенные из Р1,3-связанных остатков глюкозы. Молекулярная масса данного полимера достигает 240 тыс. В этой фракции также обнаруживается глюкан, связанный с остатками маннозы (Manners et al., 1973а). рі,3-глюкановьіе цепи этого полимера легко кристаллизуются в результате возникающих вне- и внутри-молекулярных водородных связей (Phaff, 1981). Глюкан образует фибриллярную сеть КС дрожжей, выявляемую при электронномикроскопических исследованиях (Kopecka et al., 1974). Он вносит основной вклад в формирование прочностных свойств стенки. Если щелоченерастворимую фракцию дрожжей обработать разбавленной уксусной кислотой при нагревании, можно выделить кислоторастворимый глюкан, содержащий 65% рі,6-связей и около 19 % р1,3-связей (Manners et al 1973b). Этот высокоразветвленный рі,6-глюкан у дрожжей Saccharomyces cerevisiae составляет 15% от общего содержания щелоченерастворимого глюкана, а у других представителей дрожжей его может быть значительно больше (Manners et al., 1974). Предполагается, что pi,6-глюкан более пластичен по сравнению с щелоченерастворимым рі,3-полимером и, по-видимому, заполняет пространство между фиблиллами последнего (Manners et al, 1974). Часть глюкана, которая не может быть экстрагирована из КС щелочью и кислотой представляет собой рі,3-глюкан, ковалентно связанный с хитином (Kollar et al., 1995).
В толще клеточной стенки глюкан располагается между наружным и внутренним слоями маннопротеинов и сам, в свою очередь, неоднороден в своем строении и составе. Можно выделить внутреннюю - фибриллярную и внешнюю - аморфную области. Аморфный слой обогащен 1,6-глкжаном (Kopecka et al, 1974). На данный момент известно, что р1,3-глюкан КС дрожжей синтезируется локализованным в плазматической мембране глюкан синтетазным комплексом, в состав которого входят регуляторная (Rholp) и каталитическая (Fkslp) субъединицы. При делеции гена FKS1, а также при недостатке глюкозы в среде роста, в клетке может экспререссироваться другая каталитическая субъединица глюкансинтетазного комплекса -Fks2p. Клетки дрожжей становятся нежизнеспособными при одновременной делеции генов FKS1 и FKS2 (Inoue et al., 1995; Mazur et al., 1995). Глюкансинтетазный комплекс локализован в цитоплазматической мембране таким образом, что синтезируемые Р 1,3-линейные цепи глюкана поступают в периплазматическое пространство и затем в клеточную стенку в зону активного роста клетки для формирования новой клеточной стенки или в точку интеркалярного роста и растяжения клеточной стенки. В этом же участке клеточной поверхности в местах инвагинации мембраны закрепляются пучки актинового цитоскелета. Если рассматривать фибриллы pi,3- глюкана как жесткий наружный "скелет" клетки, то вполне логичным является его связь с формированием скелета внутриклеточного. В согласии с выше сказанным является тот факт, что регуляторная субъединица глюкансинтетазного комплекса Rholp принимает участие в регуляции процесса полимеризации актиновых микрофиломентов, обеспечивая тем самым координацию синтеза как внешнего (глюканового), так и внутреннего (актинового) скелета клетки. (Ayscough et al., 1999; Delley and Hall, 1999; Andrews and Stark, 2000). После того как pi,3- глюкановая фибрилла была синтезирована, клетке ее необходимо встроить в клеточную стенку. Считается, что протекание этого процесса обеспечивают глюкаиазы\глюкантрансферазы, поскольку они по своим ферментативным характеристикам способны отщепить от линейной молекулы глюкана фрагмент необходимой длинны и образовать связь между ним и уже существующей в КС глюкановой сетью фибрилл (Capellaro et al., 1998; Sestak et al., 2004).
Регуляция экспрессии генов, кодирующих ферменты, обладающие глюканазной активностью
Регуляция и координация экспрессии генов играет важную роль в поддержании жизнеспособности клетки, поскольку обеспечивает своевременный биосинтез белков, необходимых клетке на данной стадии жизни (Bahler, 2005). Как уже описывалось ранее (см. таблицу 2), экспрессия практически всех на данный момент известных ферментов, обладающих глюканазной активностью, строго регулируется клеточным циклом, а в стрессовых условиях - специальными сигнальными путями, передающими импульс от рецептора, воспринимающего раздражения от внешней среды, до транскрипционного фактора, необходимого для активации или репрессии трансляции гена-мишени. Несмотря на то, что информация о том, как происходят процессы регуляции и координации экспрессии глюканаз на данный момент скудна и фрагментирована, в данном разделе будут суммированы основные принципы организации данных процессов в клетке дрожжей. В дрожжевых клетках, как в принципе и во всех эукариотических клетках существует набор зависимых от клеточного цикла транскрипционных факторов. Как видно из таблицы 2 индукция экспрессии известных ферментов, обладающих глюканазной активностью, происходит либо при переходе клетки к стадии G1, либо при споруляции. Это связано с тем, что фаза G1 клеточного цикла дрожжей совпадает со стадией отпочковывания дочерней клетки от материнской и требует наиболее серьезных перестроек в организации клеточной стенки, а именно гидролиз первичной клеточной стенки между материнской и дочерней клеткой, необходимый для расхождения клеток, а также формирование так называемого «материнского рубца» на месте отщепления дочерней клетки (Cabib et al., 2001), а стадия споруляции сопряжена с формированием стенки аско-споры. Внутренний слой такой стенки состоит главным образом из глюканов и маннопротеинов, как и КС вегетативно растущей клетки. Этот слой покрыт слоем хитозана, представляющего собой деацилированный хитин, устойчивый к действию хитиназ. Поверхностный слой представлен белковым слоем, в котором компоненты скреплены между собой посредством дитирозиновых мостиков, характерных исключительно для КС споры (D- и L-тирозины соединены между собой через фенильные боковые группы).
Все эти слои придают спорам устойчивость к действию литических ферментов, повышению температуры и другим неблагоприятным воздействиям внешней среды (Kupec et al., 1997). В связи с выше сказанным, остановимся поподробнее на транскрипционных факторах, регулирующих именно стадии клеточного цикла сопряженные с серьезными перестройками в клеточной стенке. На данный момент известно несколько систем, регулирующих транскрипцию генов на разных этапах 01фазы, а именно при переходе из стадии митоза в G1 фазу - «ранняя» G1 фаза и так называемая «поздняя» G1 фаза, завершающая процесс отделения и расхождения клеток, необходимый для перехода клетки в следующую S фазу. К настоящему времени известно, что экспрессия многих белков специфических для «ранней» G1 фазы (показано, что к таким белкам относиться глюканаза Englp (Baladron et al., 2002), а возможно и другие глюканазы, индукция экспрессии которых происходит при M/G1 переходе (см. таблицу 2)), регулируется цикл-зависимыми транскрипционными факторами Swi5 и Асе2 (McBrige et al 1999). Гены, кодирующие эти два транскрипционных фактора, транслируются на G2 стадии клеточного цикла (Dohrmann et al., 1992; Nasmyth et al., 1987). Ново-синтезированные белки Swi5 и Ace2 локализуются в цитоплазме и только на последней стадии митоза попадают в новообразованные ядра и активируют транскрипцию генов-мишений к которым кроме вышеуказанных глюканаз относиться хитиназа Ctslp, участвующая в гидролизе клеточной стенки между дочерней и материнской клеткой, что необходимо для их разделения (Dohrmann et al., 1992). После процесса активации генов, транскрипционные факторы подвергаются деградации (Nasmyth et al., 1990). Комплекс, состоящий из циклина С1пЗ и циклин-зависимой протеинкиназы Cdc28, регулирует экспрессию генов, кодирующих белки «поздней» G1 фазы (Breeden, 2003). К таким белкам относится глюкантрансфераза Gaslp (Popolo and Vai, 1999), а, возможно, и другие глюканазы, индукция экспрессии которых происходит на «поздней» G1 фазе (см. таблицу 2). Выше указанный киназный комплекс активирует транскрипционные факторы SBF и MBF. Эти факторы содержат одну общую регуляторную субъединицу Swi6 и одну из двух ДНК - связывающих субъединиц: SBF фактор содержит Swi4 субъединицу, a MBF Mbp (Breeden, 2003). SBF связывается с регуляторными последовательностями CACGAAA в течение G1 фазы и регулирует переход из G1 в S фазу клеточного цикла, а также морфогенез клетки. SBF необходим для максимальной G1-зависимой экспрессии генов CLN1, CLN2, РСЫ и PCL2, которые кодируют G1 циклины, а также генов, продукты которых участвуют в биосинтезе клеточной стенки (см. таблицу 3). Например, ген глюкантрансферазы Gaslp; гены глюкансинтетаз Fkslp Fks2p; хитинсинтетаз Chslp, Chs2p, Chs3p (Igual et al., 1996; Helliwell et al., 1994). Известно также, что транскрипционный фактор SBF может также регулироваться Mpkl-зависимым, стресс индуцированным сигнальным путем (Levin, 2005). В течение жизни дрожжевая клетка сталкивается с множеством разного типа стрессов, таких как действие экзогенных глюканаз и других литических ферментов, вырабатываемых другими микроорганизмами, гипоосмотический шок, тепловой шок и т.д. (De Nobel et al., 2000). Повреждение клеточной стенки является одним из первых эффектов, возникающих вследствие агрессивных изменений окружающей среды, поскольку именно клеточная стенка является тем первым защитным барьером, встающим между клеткой и внешней средой.
Предполагается, что обусловленные стрессом изменения в КС могут быть зарегистрированы при помощи сенсорных белков, расположенных в плазматической мембране. По-видимому, такими сенсорами могут являться следующие мембранные белки: Mid2p, Mtllp, Wsclp (также называемый как Slglp и Hcs77p), Wsc2p и Wsc3p (Gray et al, 1997; Verna el al, 1997; Jacoby el al, 1998; Rajavel el al., 1999; Levin, 2005). Для Mid2p показана роль в ответе на изменение КС в присутствии феромонов (Rajavel et al, 1999; De Nobel et al, 2000). Предполагают, что белки Mid2p и Wsc2p могут детектировать растяжение плазматической мембраны (Ketela et al, 1999). Однако некоторые исследователи полагают, что О-маннозилированные гидрофильные домены этих белков могут служить связующим звеном между плазматической мембраной и самой КС (Rajavel et al, 1999). Таким образом, за счет этих доменов сенсорные белки могут детектировать нарушение целостности КС дрожжей. Сенсорные белки активируют Rholp через активацию фактора Roml/2p (Levin, 2005) (см рис. 9). Rholp является ключевым ферментом MAP (Mitogen-Activated РгоІеіп)-киназного пути, регулирующего активацию экспрессии генов, и более того этот белок координирует весь комплекс реакций необходимых клетке в стрессовых условиях. Rholp может напрямую активировать: I - синтез глюкана, взаимодействуя с субъединицами глюкансинтетазного комплекса: Fkslp или Fks2p (Drgonova et al., 1996; Mazur and Baginsky, 1996; Qadota et al., 1996); 2 -полимеризацию актиновых микрофиломентов, благодаря взаимодействию с белком Bnilp, входящего в состав полярисомы (Ozaki-Kuroda et al., 2001; Levin, 2005); 3 - транскрипционный фактор Skn7, активирующий гены в промоторной зоне которых присутствует 8кп7-узнающая последовательность; (ATTTGGCC/TGGC/GCC), к таким гена относиться машюзилтрансфераза Ochlp (Li et al., 2002; Levin, 2005); 4 - направленный экзоцитоз, благодаря взаимодействию с белком Sec3, который является своеобразным маркером места направленного экзоцитоза, независимого от основного секреторного пути клетки (Finger et al., 1998); 5-а, также способен активировать Pkclp, а через нее - MAP киназный каскад (Cabib et al, 1998). Pkcl/MAP-киназный путь приводит к активации транскрипционных факторов Rlml и SBF.
Электрофоретические методы
Электрофорез ДНК в агарозиом геле с использованием ТАЕ - буфера (ТАЕ 50х : 2М Трис-ацетат, 0.1М ЭДТА) проводили при напряжении 10 V/см В течение 1-2 часов. Для анализа геномной ДНК использовали 0.8 % гель агарозы, ПЦР-продуктов и векторов -1%. В качестве маркера использовали набор фрагментов X/Pstl: 11497, 5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 803, 514,468,447 п.н. X/Hind III: 23130,9416 ,6557,4361,2322,2027,564,125. Гели окрашивали раствором бромистого этидия (1 мкг/мл) 10-15 мин и визуализировали в УФ свете. 10.2 Электрофорез белков в денатурирующих условиях. Белки анализировали электрофорезом в 7-10% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970). Электрофорез проводили в течение 1-2 часов при напряжении 100-120 В и силе тока 10-30 тА. После окончания электрофореза в некоторых случаях гель окрашивали 0.2% Кумасси G-250 в 8% уксусной кислоте с добавлением 40% этанола в течение 15 мин при 70С. Избыток краски удаляли кипячением геля в дистиллированной воде. В качестве белков-стандартов использовали маркер Low Range (BioRad): 14.5, 21.5, 30, 45, 66, 97.4,220 кДа. 11. Вестерн-блот анализ. После электрофореза в денатурирующих условиях гель промывали в воде при необходимости проводили полусухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell, 0,45um) в буфере, содержащем ЮОмМ Трис-HCl, 192мМ глицина (рН 8.0) с добавлением 20% метанола в течение 1 часа при силе тока 5 мА/ см (Towbin et al, 1979). Мембрану промывали водой, после чего инкубировали в буфере TBS (50 мМ Трис-НС1 рН 7.5, 150 мМ NaCl), дополнительно содержащем 0.05% Tween-80 (Ferax) и 5% сухого обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре. В слечае окраски антителами к белку Bgl2p мембрану инкубировали с указанными антителами (1:1000) в том же буфере в течение 1 часа, после чего отмывали буфером TBS с Tween-80 3 раза по 5 минут. Затем инкубировали 1 час с кроличьей антисывороткой (1:30) с последующей отмывкой в TBS с Tween-80. После фильтр инкубировали 1 час с мышиными антителами, конъюгированными с пероксидазным комплексом (1:200), и отмывали в TBS с Tween-80. Визуализацию проводили, инкубируя фильтр в буфере TBS, содержащем 0.3 мг/мл диаминобензидина и 0.005%) перекиси водорода. В случае биотинилированных образцов, фильтр предварительно инкубировали в буфере TBS с 0.05%) Tween-80 и 1% казеина в течение 1 часа при комнатной температуре.
Далее, в течение 1 часа в том же буфере проводили инкубацию со стрептавидином (1:2000, Sigma), фильтр отмывали и проводили визуализацию в буфере ЮОмМ Трис-НС1 (рН 9.0) с ЮмМ MgCl2, содержащем 0.692мМ BCIP и 0.734 мМ NBT. В случае использования для вестерн блот анализа антител к белкам CPY, Gaslp и глюкозоокседазе, мембрану промывали водой и проводили процедуру окрашивания соответствующими антителами с помощью набора ECL (Amersham, UK), в соответствии с прилагаемым протоколом. Антитела к белкам CPY и глюкозоокседазе были любезно предоставлены М.О. Агафоновым (Кардиологический Центр, Москва). Антитела к белку Gaslp были любезно предоставлены Говардом Ризманом (Howard Riezman) из Биоцентра Университета в Базеле, Швейцария. Антитела к белку Bgl2p были получены и Институте биофизики клетки (Пущено, Россия) О.С. Моренковым. 12. Окраска белков при помощи Кумасси. После окончания электрофореза в некоторых случаях гель окрашивали 0.2% Кумасси G-250 в 8% уксусной кислоте с добавлением 40% этанола в течение 15 мин при 70С. Избыток краски удаляли кипячением геля в дистиллированной воде. 13. Окраска белков при помощи нитрата серебра. После окончания электрофоретического разделения полиакриламидный гель, содержащий белки, последовательно переносят: в фиксирующий раствор и инкубируют 30 минут при слабом покачивании, в промывающий раствор и инкубируют 15 минут при слабом покачивании, промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд, переносят в раствор тиосульфата натрия и инкубируют 3 минуты, три раза промывают дистиллированной водой в течение 10 минут, переносят в раствор нитрата серебра и инкубируют 15 минут при слабом покачивании, промывают дистиллированной водой в течение 10 секунд и переносят в проявляющий раствор до проявления белковых полос. При достижении достаточного проявления белковых полос гель переносят в останавливающий раствор и инкубируют 20 минут при слабом покачивании, затем промывают дистиллированной водой и высушивают. Состав реагентов: Фиксирующий раствор содержит: 500 мл этанола, 100 мл уксусной кислоты, довести дистиллированной вода до 1 литра. Промывающий раствор содержит: 100 мл этанола, 50 мл уксусной кислоты, дистиллированной вода до 1 литра. Раствор тиосульфата натрия: 250мг тиосульфата натрия (Na2SC 3 5H20) на 1 литр дистиллированной воды. Раствор нитрата серебра: 1г нитрата серебра на 1 литр дистиллированной воды. Проявляющий раствор содержит: 29.7г карбоната натрия растворить в 900 мл дистиллированной воды, добавить 0.5мл формальдегида (37%), 12.5мл раствора тиосульфата натрия, довести дистиллированной водой до 1 литра. Останавливающий раствор содержит: 121.75г лимонной кислоты растворить в 1 литре дистиллированной воды. 14. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения. Экстракцию ДНК из агарозного геля проводили с использованием набора реактивов «Geneclean» фирмы Віо-101 в соответствии с рекоммендациями фирмы-производителя. После проведения электрофореза вырезали агарозный блок, содержащий необходимый фрагмент ДНК, который растворяли в тройном объеме 6 М Nal при температуре 65С. К раствору добавляли 1-3 мкл суспензии «Glassmilk». В течение 10 минут проводили адсорбцию ДНК на сорбенте. Сорбент со связанной на нем ДНК осаждали центрифугированием. Осадок дважды промывали составом New Wash (Віо-101), после чего высушивали при 37С, и ДНК растворяли в воде.
Растворенную ДНК отделяли от сорбента при помощи центрифугирования. 15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для получения конструкции для нарушения гена BGL2 дрожжей S.cerevisiae использовали праймеры F1 и Rl: (F1) 5 ATCGATATTTGTTATTTGATTT 3 (R1) 5 TCTAGATAAAATAAAGCCCTAAAT 3 Для ПЦР-амплификации фрагмента гена BGL2 дрожжей Я polymorpha использовали следующую пару праймеров: (Hpbl): GCCGGATAATTGATGAGGTA (Hpb2): CTGATTTGGACACGATCTCC Для проверки встраивания трансформирующей конструкции в геном Я. polymorpha использовали другую пару праймеров, один из которых отжигался на геномной ДНК, а другой - на встраивающейся конструкции: (Hpb32): ACTGATCGTGGACACTGGAG (НриЗ): AATCTAGTCCAGGTCTCCGA Для ПЦР-амплификации гена YPT6 дрожжей Hansenula polymorpha использовали следующую пару праймеров: (yptl) GGCATCAAGAAGAGCGGTAA (ypt2) TCGTTTCGCTGTGTGCAAGG Реакцию проводили в пробирках объемом 0.7 мл на амплификаторе Cyclotemp-5 с использованием реактивов фирм Fermentas и Promega. Для получения ПЦР-продукта с использованием праймеров F1 и R1 использовали следующие параметры температурных циклов: 1-й цикл - 94С -2 мин., 54С - 1 мин., 72"С - 1 мин.; последующие 30 циклов - 94С - 1 мин., 54С - 40 сек., 72С - 1 мин; заключительный цикл 72С - 5 мин. Амплификацию с использованием остальных пар праймеров проводили в тех же условиях, изменяя в зависимости от длины ожидаемого фрагмента время элонгации. 16. Выделение клеточных стенок дрожжей. Клетки дрожжей выращенные до поздней логарифмической фазы (19 ч роста), осаждали центрифугированием 10 мин при 4000 об/мин, дважды промывали буфером 0.05М трис-HCl рН 7.5 с 4мМ СаСЬ и разрушали на шейкере Heidolph (Германия) с помощью стеклянных шариков баллотини (0.5 мм; Sigma), при охлаждении. Центирифугированием на "Microcentrifuge eppendorf 5414S" при 5000об/мин. отделяли клеточные стенки от внутриклеточного содержимого, неразрушенных клеток и шариков. Далее полученный препатат клеточных стенок промывали два раза водой, 3 раза 1% NaCl, 3 раза 1% сахарозой, 5 раз водой, 1 раз 0.05М трис-HCl буфером (рН 7.5). Степень чистоты получаемого препарата клеточных стенок контролировали с помощью светового микроскопа obton.
Выявление нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей S. cerevisiae в отсутствии глюкантрансфераз Bgl2p и Gaslp
На следующем этапе работы мы провели изучение роли глюкантрансфераз Gaslp и Bgl2p во встраивании белков в клеточную стенку дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Результаты эксперимента представлены на рисунке 19. Было обнаружено, что отсутствие BgI2p приводит к нарушению встраивания трех из пяти GPI-заякоренных белков (см. рис.19), присутствующих в КС дрожжей при вегетативном росте, поскольку эти белки детектироваться при стандартных условиях выделения. Возможно два объяснения этого явления: GPI-белки могут в отсутствии Bgl2p вообще не встраиваться в КС, а могут встраиваться другим способом, что придает им устойчивость к действию ламинариназы и блокирует экстракцию при стандартных условиях. Второе предположение по нашему мнению более вероятно, поскольку в литературе есть данные, свидетельствующие в пользу того, что полное отсутствие GPI-белков в ламинариназо-экстрагируемом экстракте штамма Agasl не сопровождается отсутствием этих белков в КС, поскольку они начинают встраиваться, закрепляясь за хитин (Kapteyn et al., 1997), количество которого благодаря системе «хитиновой репарации» сильно увеличено в латеральной КС этого мутанта, также как и штамма Abgl2. Следует отметить, что нарушение как гена BGL2, так и GAS1 не приводило к изменению наборов остальных групп маныопротеинов КС. Эти данные позволяют заключить, что и глюкантрансфераза Bgl2p, и Gaslp принимают участие во встраивание только GPI-заякоренных белков клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, что является прямым доказательством существующей в литературе схемы Лауры Пополо о встраивании белков данного типа. В отличие от глюкантрансферазы Gaslp, которая представляет собой GPI-заякоренный белок плазматической мембраны, Bgl2p является одним из SEP белков клеточной стенки, а, следовательно, входит в состав этой органеллы. Отмеченные ранее факты: значительное количество Bgl2p в клеточной стенке и конститутивный характер синтеза заставляют рассматривать его в качестве претендента на роль важного структурного модуля, функция которого до настоящего времени далека от выяснения. В связи с этим интересны данные о стабильности белка Bgl2p к протеолитическому расщеплению. Так, например, ранее в нашей лаборатории было установлено, что трипсин не способен гидролизовать этот белок, когда последний находится в составе клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae, но при этом данная протеиназа полностью гидролизует все остальные белки этой фракции (Калебина и др., 1998; Kalebina et al., 2003). Известно, что трипсин расщепляет белки по аминокислотам лизин и аргинин.
Это результат был очень неожиданным, поскольку в молекуле Bgl2p дрожжей S. cerevisiae содержится двадцать сайтов для гидролиза этой протеиназой. Этот факт позволил нам предположить, что молекула Bgl2p находиться в клеточной стенке в необычной конформации, и эта конформация, возможно, обеспечивает структурную роль Bgl2p в КС, но так же возможно, что молекула этой глюкантрансферазы закрыта полисахаридными фибриллами от действия трипсина. В нашей работе мы продемонстрировали еще несколько специфических свойств Bgl2p, которые отличали этот белок от других SEP белков клеточной стенки дрожжей: 1-Bgl2p является единственным белком этой фракции, который продолжает оставаться в КС даже после длительной обработки последней 1% ДСН при 37С и слабом помешивание (см. рис. 20 А дорожки 1 и 2); 2- молекула Bgl2p, в отличие от других белков клеточной стенки, устойчива не только к трипсину, но и к более мощному литическому ферменту, протеиназе К, поскольку детектируется и окрашиванием Кумасси (рис. 20 А дорожка 3), и с антителами против Bgl2p (рис. 20 Б дорожка 1) в составе КС даже после обработки последней 10 мг/мл протеиназы К в течение 30 мин. при 37С. Следует отметить, что при таких условиях из клеточных стенок, обработанных протеиназой, в супернатант выходит фрагмент около 14 кДа, также окрашиваемый антителами к Bgl2p (рис. 20 Б дорожка 2). Дальнейшее расщепление этого белкового фрагмента не детектируется вне зависимости от времени инкубации и количества присутствующего в инкубационной среде фермента. Мы полагаем, что, по-видимому, под действием протеиназы К, Bgl2p частично выходит в раствор и сохраняется в нем в виде кора 14 кДа, устойчивого к действию протеиназы К. Мы показали, что клеточные стенки дрожжей S. cerevisiae обладают способностью связывать Thioflavine Т (ThT), который является специфическим флуоресцентным красителем, окрашивающим амилоиды. Они сохраняют эту способность даже после обработки протеиназой К, в том случае, если в них находиться Bgl2p. Клеточные стенки, полученные из мутантного штамма, лишенного данной глюкантрансферазы, не связываютТЪТ после обработки протеиназой К (рис. 21). Результаты данного эксперимента позволяют предположить, что в составе клеточных стенок дрожжей дикого типа присутствует устойчивый к действию протеиназы К белок, способный формировать амилоидо-подобные фибриллы. В клеточных стенках мутантного штамма Abgl2 возможно также присутствуют белки, способные формировать подобные структуры, но, так как повышенная устойчивость к действию протеиназ и детергентов считается неотъемлемым свойством, характерным для амилоидо-подобных белков, к истинно амилоидным их отнести нельзя (Nilsson, 2004). Поскольку Bgl2p является единственным белком, способным сохраниться в значительном количестве в составе клеточной стенки после обработки последней протеиназой К, мы полагаем, что именно этот белок обеспечивает специфическое связывание ThT с клеточными стенками в этих условиях, что в свою очередь является прямым свидетельством в пользу амилоидной природы глюкантрансферазы Bgl2p.
Как уже многократно упоминалось Bgl2p относиться к группе SEP-белков клеточной стенки дрожжей и, следовательно, может быть экстрагирован из ее состава под действием детергентов и тиоловых реагентов при нагревание до 100С. Ранее в литературе был разработан более мягкий тип экстракции Bgl2p, при этом клеточной стенки нагревали в 5 мМ трис-HCl буфере рН 7,4 до 90С, однако было обнаружено, что при таких условиях белок денатурирует как минимум на 90% (Klebl & Tanner, 1989; Mrsa et al., 1993). Более того, в этих же условиях из клеточной стенки экстрагируются практически все многочисленные белки SEP-группы. Таким образом, описанный ранее тип экстракции позволяет получить практически полностью денатурированный белок, для анализа конформационных особенностей и образования амилоидных фибрилл такой метод не подходит. Следовательно, на следующим этапе работы перед нами стояла задача подобрать условия для экстракции Bgl2p из клеточной стенки в максимально нативном виде. 6.1.1 Экстракция Bgl2p с помощью глюканазы. Благодоря тому, что белок Bgl2p, в отличие от других SEP-белков клеточной стенки, обладает повышенной устойчивостью к детергентам, нам удалось разработать способ удаления всех SEP-белков из КС кроме Bgl2p. Для этого изолированные клеточные стенки инкубировались 1 час в 1% ДСН при 37С (см. рис. 20А). Далее вставал вопрос, как экстрагировать из КС оставшийся в них Bgl2p, чтобы не денатурировать его конформацию. Для начала мы решили воспользоваться литическими ферментами (ламинариназой и хитиназой), чтобы разгидролизовать полисахаридный каркас КС. Мы обнаружили, что после обработки в течение ночи клеточных стенок ламинариназой, которая гидролизует глюкановые фибриллы, клеточные стенки полностью растворяются, и Bgl2p, скорее всего, должен выходит в раствор в нативной конформации, и в случае если Bgl2p способен формировать амилоидные фибриллы, такие фибриллы не должны быть разрушены. Для того чтобы в этом удостовериться мы провели следующий эксперимент. Мы добавили к глюканазному перевару буфер Laemmli (Laemmli, 1970) и в одном случае прокипятили образец, таким образом подготовив препарат для стандартного электрофоретического разделения в денатурирующих условиях, а в другом случае не прокипятили, а сразу нанесли образец на ПААГ. Такая модификация электрофореза разработана специально для того, чтобы детектировать амилоидные фибриллы, поскольку без кипячения в буфере Laemmli они не разрушаются (Kryndushkin et al., 2003).
