Введение к работе
Актуальность темы
Теломеры представляют собой нуклсопротеиновый комплекс на концах линейных хромосом. Одной из функций теломерной ДНК является компенсация деградации концевой последовательности, являющейся следе гвием процесса концевой недорепликации ДНК В 1971 году нашим соотечественником А. Оловниковым впервые была сформулирована проблема потери ДНК на концах линейных хромосом, или «проблема концевой недорепликации», и предположена защитная, буферная роль теломерной ДНК (Оловников 1971). Потеря ДНК на конце хромосомы является следствием того, что ДНК-полимераза не может полностью реплицировать концевую последовательность, в результате чего линейная хромосома укорачивается при каждом цикле репликации, и это может привести к деградации субтеломерных генов. У подавляющего большинства организмов фермент теломераза осуществляет удлинение теломеры за счет синтеза коротких последовательностей ДНК (6-11 иуклеотидов) на матрице РНК, кодируемой клеточным геном. Теломеры Drosophila образуются за счет ретротраиспозиций специализированных теломерных ретротранспозонов Во всех случаях удлинение теломер происходит с использованием механизма обратной транскрипции, т е. синтеза ДНК на матрице РНК. Это даег почву для дискуссии об общности происхождения теломеразного и ретротранспозонного способов удлинения теломер.
Механизмы контроля длины теломерной ДНК, а также формирования белковою состава теломерпого комплекса, т е поддержания гомеостаза теломеры, являются объектом активного исследования. Основные данные получены на тех организмах, у которых осуществляется теломеразный механизм поддержания теломеры. Теломерная ДНК служит платформой для связьгаапия многочисленных белков, а собственно теломера - это находящийся на концах линейных хромосом сложнейший комплекс теломерной ДНК и связанных с ней белков Функции этого комплекса, как теперь выясняется, многочисленны. К ним относятся защита конца хромосомы от деградации, определение положения хромосомы внутри ядра, взаимодействие хромосом во время деления клетки, а также осуществление контроля длины теломеры путем регуляции доступности конца хромосомы для теломеразы. Регуляция длины теломер - это комплексный процесс, зависящий от многих факторов, тем не менее, упрощенно его можно свести к титрованию белков на теломерной ДНК: снижение количества теломерных белков на укороченной теломере делает ее доступной для активности теломеразы в терминальных клетках или
является сигналом для остановки деления соматической клетки. В то же время опухолевая трансформация клетки часто сопровождается повышенной активностью теломеразы Такая клетка способна к бесконечному числу делений и является бессмертной Даже из этих кратких пояснений понятно, почему исследование регуляции длины теломер является одним из приоритетных направлений современной науки. В отличие от большинства эукариот, удлинение теломер у Drosophila происходит за счет перемещений специализированных теломерных мобильных элементов на концы хромосом. Очевидно, что для обеспечения нормальной длины теломер у дрозофилы необходим строгий контроль частоты транспозиций. В клетке существуют защитные механизмы, снижающие активность мобильных элементов. Важнейшим из них является работа системы РНК-интерференции (РНКи). Теломерные ретротранспозоны дрозофилы отличаются от разбросанных по геному и перемещающихся случайным образом мобильных элементов; они перемещаются исключительно на конец хромосомы и выполняют важнейшую функцию поддержания теломер. Тем не менее, как показали наши исследования, эти элементы также являются мишенью системы РНКи. Drosophila, у которой теломеры поддерживаются за счет ретротрапепозиций, не является исключением, список видов, у которых теломера поддерживается за счет ретроэлементов, растет, кроме того, сложные повторы являются неотъемлемой частью теломерных районов у всех организмов. Повторяющиеся элементы являются потенциальным источником двухцепочечной РНК (дцРНК) и мишенью РНКи Мы показали, что экспрессия и транспозиция теломерных ретроэлементов Drosophila melanogaster находится под контролем некоторых генов, являющихся компонентами РНКи. Показано, чго на фоне мутаций по генам РНКи происходит не только накопление транскриптов теломерных элементов в яичниках дрозофилы, но и увеличение частоты их транспозиций на конец хромосомы Полученные в работе результаты позволили сделать очень важный вывод о том, что система РНКи участвует в негативной регуляции длины теломер у дрозофилы. Исследование роли РНКи в контроле длины теломер и формировании теломерного гетерохроматина является фундаментальной проблемой и позволит по-новому рассмотреть роль повторяющихся элементов в функционировании теломеры у разных организмов
Цель и задачи исследования
Целями настоящей работы является изучение общих принципов организации теломер у D. melanogaster, а также исследование роли механизма РНКи в контроле длины теломер. Были поставлены следующие задачи.
-
Провести анализ уровня экспрессии теломериых ретротранспозонов на фоне мутаций по генам РНКи
-
Провести анализ частоты транспозиций на конец хромосомы теломериых ретротранспозонов на фоне мутаций по генам РНКи
-
Выяснить, участвует ли недавно обнаруженный в теломериых участках дрозофилы ретротранспозон TAHRE в поддержании теломер у дрозофилы
Научная новизна работы
Впервые показана роль механизма РНКи в регуляции длины теломер у эукариот. У дрозофилы РНКи учасгвует в негативной регуляции длины теломер. Система РНКи подавляет экспрессию ретротранспозонов, но позволяет сохранить количесгво транскриптов, служащих пусковым механизмом самой системы, на том низком уровне, который достаточен для осуществления относительно редких (не в каждом поколении) актов удлинения хромосом дрозофилы. Надо отметить, что большинство белков теломерного комплекса у организмов, имеющих теломеразу, также участвует именно в негативной регуляции длины теломер, не считая саму теломеразу, активность которой удлиняет теломеры. Возможно, что роль РНКи в поддержании теломер может быть универсальна для разных организмов независимо от конкретного способа удлинения теломер - с помощью теломеразы или перемещений мобильных элементов. Действительно, теломерные районы у всех организмов обогащены повторяющимися последовательностями различной природы, в том числе, и мобильными элементами. Именно геномные повторы и мобильные элементы являются излюбленной мишенью системы РНКи. Влияя на экспрессию этих повторов, система РНКи будет вмешиваться в функциональную структуру теломеры Действительно, у дрожжей механизм РНКи играет важную роль в формировании теломерного белкового комплекса Появились данные о роли этой системы в функционировании теломер инфузории Однако, данных о влиянии системы РНКи на длину теломер у организмов, использующих теломеразу, пока не получено. Хочется предположить, что начавшиеся исследования роли РНКи в функционировании теломер приведут к появлению новых данных, особенно при изучении
герминальных тканей, где у всех организмов происходит удлинение теломер и где активно работает система РНКи.
Апробация
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях' на семинарах кафедры молекулярной биологии МГУ им Ломоносова, на семинарах Отдела молекулярной генетики клетки ИМГ РАН, на международной конференции по гетерохроматипу дрозофилы (Губбио, Италия, 2005), на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (Хьюстон, США, 2006; Филадельфия, США, 2007), на конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза», Москва,2006.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных рецензируемых журналах.
Структура
Диссертация изложена на 78 страницах и включает в себя следующие разделы: Введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждения, выводы. Диссертация содержит 3 таблицы, 15 рисунков, 178 ссылок.
