Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Белки и гены теплового шока: общая характеристика 7
1.1.1. Гены теплового шока 7
1.1.2. Основные семейства БТП 10
1.1.3. Механизмы регуляции ответа на тепловой шок 19
1.2. Структура кластера генов бтш70 у Diptera 23
1.3. Мобильные элементы как возможный фактор эволюции генов ТШ 27
1.4. Особенности Р элемента и его использование в инсерционном мутагенезе 34
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39
2.1. Линии Drosophila 39
2.2. Модель генетического анализа 39
2.3. Выделение геномной ДНК из мух 40
2.4. Гибридизация геномной ДНК по Саузерну 40
2.5. ПЦР-анализ 41
2.6. Выделение фрагментов ДНК 42
2.7. Секвенирование ДНК 42
2.8. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени (qRT-PCR) 43 2,9 Выделение мРНК из мух и ее анализ методами электрофореза и Нозерн-гибридизации 43
2.10. Лигирование фрагментов ДНК 44
2.11. Трансформация компетентных клеток Е. соН 44
2.12. Выделение плазмидной ДНК 44
2.13. Одномерный электрофорез белков 45
2.14. Вестери-блоттинг 45
2.15. Двумерный электрофорез белков 46
2.16. Включение метионина-358 в белки слюнных желез Drosophila 47
2.17. Определение термоустойчивости мух 47
2.18. Определение фертильности трансгенных мух 48
2.19 Иммунофлуоресцентное окрашивание траискрипционых факторов 48
2.20. Статистическая обработка данных 49
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 50
3.1. Характеристика системы скрещиваний для получения инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза 50
3.2. Идентификация инсерций EPgy2 методом Саузерн-блот анализа 53
3.3 Точная локализация полученных инсерций EPgy2 56
3.4. Влияние инсерций EPgy2 на уровень транскрипции бтшЮ 64
3.5. Анализ синтеза БТШ70 в трансгенных линиях 67
3.6. Анализ инсерций EPgy2, сопровождающихся перестройками геномной ДНК 69
3.7. Базальная и индуцированная термоустойчивость транегеиных линий 72
3.8. Определение плодовитости потомства трансгенных линий 74
3.9. Вклад нмБТЩ в термоустойчивость 76
4. ВЫВОДЫ 79
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
- Белки и гены теплового шока: общая характеристика
- Модель генетического анализа
- Характеристика системы скрещиваний для получения инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза
Введение к работе
Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования адаптации организмов к воздействиям внешней среды - перепадам температуры, в частности, тепловому шоку (ТШ), химическим реагентам, инфекциям и т. д. - представляет значительный интерес для современной биологии. Наиболее универсальной генетической защитной системой, найденной у всех изученных на сегодняшний день организмов, является система генов теплового шока. Кодируемые ими белки теплового шока (БТШ) выполняют в клетке функции молекулярных шаперонов, предотвращая денатурацию и агрегацию белков. Считается, что главную защитную функцию выполняет высококонсервативыое семейство генов, кодирующих белки теплового шока массой 70 кДа (БТШ70). Гены теплового шока очень чувствительны к любым изменениям, затрагивающим их структуру, - мутации, делеции, инсерции мобильных элементов чаще всего негативно сказываются на функционировании этих генов. Соответственно, в большинстве случаев изменения, затрагивающие гены бтш70, элиминируются естественным отбором, а их высокая консервативность поддерживается механизмом внутри- и межлокусной конверсии (Ish-Horowicz D., 1981).
Одним из вопросов, привлекающих исследователей, является рассмотрение закономерностей эволюции этого семейства. В литературе накоплено много данных, свидетельствующих о том, что эволюция системы генов бтш70 могла идти как путем увеличения числа генов (Гарбуз Д.Г., 2002), так и путем инактивации некоторых их копий вследствие внедрения мобильных элементов (МЭ) (Lerman D., 2003; Zatsepina OG., 2001). Некоторые исследования указывают на то, что МЭ неслучайно перемещаются по геному в процессе транспозиции. Имеются данные, что гены бтиПО, в особенности их регуляторные зоны, являются «горячими точками» при транспозиции МЭ из-за конститутивно деконденсированного состояния хроматина таких районов ДНК.
В данной работе была предпринята попытка ответить на вопрос - являются ли гены бтшЮ «горячими точками)) инсерций МЭ, Исследовали перемещение конструкции EPgy2, полученной на основе Р элемента, на модельной системе D. mekmogaster. Выявление мест встраиваний и оценка влияния МЭ на функционирование генов бтш70 позволяет изучить возможный путь эволюции основной защитной системы организмов, а также установить роль мобильных элементов в процессах микроэволюции и адаптации. Р элемент является одним из наиболее хорошо изученных эукариотических транспозонов; в ряде работ используется его способность перемещаться в близкорасположенные сайты с увеличением числа копий и сохранением стартового элемента. Такие особенности локальных перемещений можно использовать in vivo для получения транспозиций в гены бтш.70 методом Р-инеерционного мутагенеза. Целью данной работы было: выявление специфичности встраивания Р элемента в локус, кодирующий белки БТШ70 у дрозофилы; исследование влияния инсерций Р элемента на функционирование генов бгтиЮ; рассмотрение роли различных семейств генов ТШ в адаптации к гипертермии. В соответствии с целями были поставлены следующие задачи:
Разработать экспериментальный подход для регистрации и точной локализации инсерций конструкции на основе Р элемента {EPgyl) в район генов, кодирующих БТШ70 Drosophila melanogaster.
Локализовать инсерций EPgyl.
Исследовать влияние инсерций EPgyl на функционирование генов бтш70 на уровне транскрипции и трансляции.
Рассмотреть влияние инсерций EPgyl в гены бтиПО на термоустойчивость и плодовитость потомства трансгенных линий.
5) Изучить вклад низкомолекулярных белков теплового шока (нмБТШ) в формирование термоустойчивости на примере трансгенных линий и представителей других видов Drosophila.
Белки и гены теплового шока: общая характеристика
Помимо генов, постоянно транскрибирующихся или закономерно включающихся и выключающихся в процессе нормальной жизнедеятельности клетки, существует специфическая группа генов, расположенных в разных хромосомах, активирующаяся при воздействии различных стрессовых факторов, в частности, при повышении температуры выше физиологической на 5 - 15С (тепловой шок, ТШ) и др. воздействиях, - группа генов ТШ. В стрессовых условиях продукты этих генов, белки теплового шока, повышают устойчивость клетки и защищают ее благодаря предотвращению необратимой агрегации белков и последующему протеолизу поврежденных белков. В нестрессовых условиях БТШ выполняют множество жизненно важных функций в клетке: фолдинг и транспорт новосинтезированных белков, активацию специфических регуляториых белков, деградацию белков; участвуют в процессах внутриклеточной сигнализации и в клеточном апоитозе. К настоящему времени гены и белки теплового шока обнаружены во всех изученных организмах (Маргулис Б.А.,2000; Ульмасов Х.А, 1993)
Многие гены ТШ и их продукты объединены в семейства на основании гомологии их последовательностей и по молекулярному весу продуктов (см. ниже). У эукариотических организмов многие семейства содержат несколько членов, различающихся по степени индуцибельности, внутриклеточной локализации и функциям. Например, семейство БТШ70 у человека содержит 14 геггов (hUp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/hLiman/), у нематоды Caenorhabdilis elegans - 13 генов (http://www.ncbi.nih.gov/PMGifs/Genomes/6239.html), у Drosophila - до 9 генов (http://flybase.bi о. indiana.edu/).
Семейство генов, кодирующих белки теплового шока массой 70кДа (БТШ70), считается одним из наиболее многочисленных и высоко консервативных семейств генов истинные гены теплового шока (индуцибельные) - экспрессируются только в условиях стресса.
- когнатные гены (родственные) - синтезируются в клетке независимо от стресса, а при стрессе уровень их экспрессии может как возрастать, так и не меняться. На различных экспериментальных моделях показано, что существует определенная функциональная взаимозаменяемость индуцибельиых и когнатных генов, но за жизнедеятельность отвечает вся совокупность родственных белков семейства БТШ70 (Fedcr ME, Blair N., 1997).
Семейства генов располагаются в различных хромосомных локусах в виде кластера или тандемных повторов (у некоторых одноклеточных паразитов), что облегчает их регуляцию.
Хронологически первой и наиболее полно изученной является система генов ТШ у Drosophila. В ее геноме в зависимости от молекулярной массы кодируемых белков выделяют следующие семейства генов ТШ: бтш40, бтиПО, бтш83 и семейство низкомолскулярных бтш (кодируют БТШ с молекулярными массами 19-27 кДа). Для большинства индуцибельиых генов ТШ характерно отсутствие нитронов. Такая структура позволяет транскрибироваться мРНК в условиях ТШ, когда нарушается система сплайсинга, и быстро поступать из ядра в цитоплазму.
Модель генетического анализа
В работе был использован метод Р-инсерциоыыого мутагенеза для выявления «горячих точек» встраивания Р элемента в гены бтиЛО. Для этого была использована система скрещиваний, примененная Тимаковым и соавт. (Timakov et al, 2002) с некоторыми изменениями (см. рис 4а): были проведены массовые скрещивания самок линий US-4 или US-2, содержащих исходную конструкцию EPgy2y с самцами линии Д 2-3, несущими транспозазу (более подробно см. главу 3,1). Успешность получения транспозиций EPgy2 в локус генов бтш70 связано с активностью используемой транспозазы в клетках зародышевого пути и с экспрессией генов бтшЮ на ранних стадиях сперматогенеза (Lakhotia S., 2002). Соответственно, локальные перемещения EPgy2 происходили в самцах F]. Выявление дополнительных копий EPgy осуществлялось в самцах Рг благодаря экспрессии маркерного гена mini-white, входящего в состав конструкции (рис. 2, 4). Линии, содержащие дополнительные копии конструкции, далее анализировались молекулярио-геиетическими методами.
Характеристика системы скрещиваний для получения инсерций конструкции на основе Р элемента в гены бтш70 методом Р-инсерционного мутагенеза
Метод инсерционного мутагенеза - один из наиболее распространенных методов генетической инженерии, использующийся для получения различных мутаций в определенном гене и для изучения свойств генов. Так, например, использование различных модификаций Р элемента лежит в основе получения разнообразных мутаций в геноме Drosophila - Berkeley Drosophila Genome Project.
В данной работе была использована модель целенаправленного получения транспозиций конструкции на основе Р элемента, EPgy2, в локус генов теплового шока, примененная Тимаковым и соавт. при изучении малых генов ТШ (Timakov В., 2002), с некоторыми изменениями.
В основе разработанного подхода лежат два положения. Первое заключается в известной способности Р элемента к локальным перемещениям с сохранением копии стартового элемента (Tower, 1993; Zhang, 1993). Кроме того, перемещения Р элемента носят неслучайный характер, существуют предпочтительные места встраиваний - 5 -участки транскрипционно активных генов (Spradling, 1995). Исходя из литературных данных, эти свойства Р элемента объясняются сочетанием нескольких факторов - особой структурой хроматина и ДНК тех областей, в которые происходят инсерций, расположением ДНК-связывающих белков, и, в меньшей степени, ыуклеотидной последовательностью ДНК (см. главу 1.4). В данной работе нами была продемонстрирована возможность использования локальных транспозиций конструкции EPgy2 для выявления предпочтительных сайтов встраивания, с точностью до отдельного нуклеотида. Второе положение основано на особенностях использованной для мутагенеза.
