Введение к работе
Актуальность проблемы. Геми- и гомозиготные делеции на коротком плече хромосомы 3 (Зр) встречаются в большинстве опухолей разной локализации. Кроме того, эти генетические изменения являются ранними событиями в патогенезе множества злокачественных новообразований, так как выявляются в доброкачественных опухолях и предраковьж дисплазиях. Частые геми- и гомозиготные делеции и способность субхромосомньж фрагментов Зр подавлять рост опухолей, позволяют предположить локализацию в этом протяженном районе нескольких генов-супрессоров опухолевого роста. Хотя данные, свидетельствующие о важной роли Зр-плеча в патогенезе опухолей, были опубликованы более десяти лет назад, значительные успехи в идентификации генов, обладающих супрессор-ными функциями, были достигнуты недавно. Значительным успехом было определение эпигенетического механизма инактивации генов. Эти достижения ведут к развитию новьж диагностических и терапевтических стратегий, направленных на предотвращение и лечение опухолевых новообразований. На данный момент известно, что генетические и эпигенетические изменения некоторых генов, расположенньж на коротком плече хромосомы 3, играют значительную роль в канцерогенезе. Но все еще не ясно, сколько же генов-супрессоров находится на коротком плече хромосомы 3, и кто из многочисленных кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста играет ключевую роль в опухолевом патогенезе.
Цель и задачи исследования.
Представленная работа посвящена идентификации и характеристике новьж кандидатов в гены супрессоры опухолевого роста и определению возможных путей их инактивации. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
Определить уровень метилирования гена-супрессора опухолевого роста RASSF1A в плоскоклеточных карциномах шейки матки (SCC) и сравнить частоту метилирования промогорного района гена RASSF1A и геми- и гомозиготных делеции в полиморфных и неполиморфньж локусах, окружающих этот ген (D3S1568, D3S4614 и NL3-001).
Исследовать уровень метилирования промогорного района предполагаемого гена-супрессора опухолевого роста Sema3B в эпителиальных опухолях разной локализации.
Определить уровень экспрессии генов RBSP3 и USP4 в опухолевых клетках.
Оценить влияние соматических мутаций генов RBSP3 и USP4 на их инактивацию.
Изучить влияние белковых продуктов генов RBSP3 и USP4 на измепение содержания в клетке фосфорилированной и дефосфорилированной формы белка RB.
1 ! _2і*/УІ
Научная новизна работы.
В данной работе проведен анализ метилирования промоторных районов генов SemaSB и RASSFIA в эпигелиальньж опухолях различной локализации. Проведенные исследования позволяют оценить вклад эпигенетической модификации генов Sema3B и RASSFIA на их инактивацию и определить взаимосвязь метилирования с опухолевой прогрессией. Для гена RBSP3 уточнена последовательность 5" района и определены два варианта альтернативного сплайсинга. Для генов RBSP3 и USP4 впервые определен относительный уровень экспрессии в клеточньж линиях эпигелиальньж опухолей и первичньж опухолях. Экспрессия данньж генов была снижена во многих опухолях по сравнению с клетками нормальной ткани. Для гена RBSP3 были найдены мутации в клеточньж линиях и первичньж опухолях разной локализации. С целью выяснения функций белковых продуктов генов RBSP3 и USP4 в клетке изучено их влияние на активную и неактивную формы белка RB. Показано, что транзиентная экспрессия RBSP3 приводит к снижению содержания фосфо-рилированной формы белка RB в клетках, и, следовательно, к остановке клеточного цикла на границе перехода из G1 в S фазу. Практическая ценность работы.
Разработка новьж онкомаркеров доклинической диагностики и маркеров, выявляющих изменения в опухолевых клетках, которые приводят к ухудшению клинического прогноза, очень актуальна- Не менее актуален поиск генов, вовлеченных в развитие и прогрессию опухолей. Идентификация генов с аномальным метилированием их промоторных районов, открывает широкие перспективы для создания принципиально-новьж подходов к диагностике и прогнозированию распространенных и социально значимых онкологических заболеваний (таких как рак легкого, почки, молочной железы, яичников и шейки матки). Определение новьж генов-супрессоров опухолевого роста и изучение их функциональной активности может способствовать решению задач генной терапии. Апробация работы.
Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ Генетика" от 13 января 2004 г.
Результаты настоящей работы докладывались на конференциях программы РФ «Геном человека», (Москва 2000 и 2002 г.), на конгрессе Международной организации по изучению генома человека HGM* 2002 (Шанхай, Китайская народная республика, 2002 г.), на конференции Федерации Европейского Биохимического общества (FEBS 2002 г., Стамбул, Турция), на конгрессах Американской ассоциации раковьж исследований (AACR: Бостон, США, 2002 г., Торонто, Канада, 2003 г.).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 4 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.
Структура диссертации: Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованньж материалов и методов, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на ПО страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 24 рисунка.
