Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Критерии злокачественной трансформации и возникновения опухоли 13
1.2. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (TSG) 17
1.3. Нестабильность генома и повреждения «онкозначимых» генов в опухолях 23
1.4. Роль метилирования ДНК при онкогенезе 25
1.4.1. CpG-островки в геноме человека 25
1.4.2. Гипометилирование генома опухолей 28
1.4.3.Гиперметилирование CpG-островков TSG в опухолях 30
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов 33
1.5. Основные подходы при поиске «онкозначимых» генов 36
1.5.1. Анализ аллельных делений и умножения копий гена в опухолях 38
1.5.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли 40
1.5.3. «Вычитающая» гибридизация как способ отбора онкогенов и
TSG 41
1.5.4. Применение микропанелей для скрининга генов, изменяющих копийность, метилирование или экспрессию в опухолях 45
1.5.5. Анализ метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG и онкогенов 47
2. Материалы и методы 52
2.1. Клонотека рекомбинантных космид хромосомы 13 52
2.2. Клоны хромосомы 3 52
2.3. Выделение ДНК 53
2.4. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования 55
2.5. Получение компетентных клеток E.coli JM109 и DH5a и трансформация плазмидной ДНК 56
2.6. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК 57
2.7. Окрашивание фрагментов ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ) азотнокислым серебром. 59
2.8. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклео-тидкиназы фага Т4 и гибридизация по Саузерну 59
2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.10. Определение нуклеотидной последовательности
клонированных фрагментов ДНК 61
2.11. Статистическая обработка данных скрининга панелей 62
2.12. Определение частоты встречаемости аллей и генотипов 63
2.13. Образцы первичных опухолей 63
2.14. Клеточные линии опухолей и их культивирование 65
2.15. Анализ аллельных дисбалансов (AI) полиморфных маркеров хромосомы Зр в ДНК опухолей 66
2.16. Мультиплексная ПЦР для анализа копийности фрагментов ДНК и
картирования гомозиготных делений (HD) 68
2.17. Анализ метилирования ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз 69
2.18. Бисульфитная конверсия ДНК 72
2.19. Метилспецифичиая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) 73
2.20. Бисульфитное секвенирование 75
2.21. Компьютерный анализ баз данных проекта SAGE (серийного
анализа экспрессии генов ) 76
2.22. Выделение РНК 77
2.23. Синтез кДНК 78
2.24. Полуколичественная ОТ-ПЦР 78
2.25. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) 79
2.26. Статистические методы при анализе частот AI полиморфных 82 маркеров, частот изменения уровня мРНК генов и метилирования промоторных областей
2.27. Основные компьютерные программы, использованные в работе 83
3. Результаты и их обсуждение 84
3.1. Идентификация микросателлитных маркеров на хромосомах 3
и 13 84
3.1.1. Микросателлиты на хромосоме 13 85
3.1.1.1. Частоты встречаемости и особенности распределения дитри- и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы 13 85
3.1.1.2. Субклонирование и определение нуклеотидной последова тельности микросателлитов на 13q; гетерогенность повторов 89
3.1.1.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 13 93
3.1.2. Микросателлиты на хромосоме 3 96
3.1.2.1. Частоты встречаемости и особенности распределения микросателлитов в Notl-связующих и прыжковых клонах хромосомы 3 и в космидах из области LUCA (Зр21.31) 97
3.1.2.2. Микросателлиты в Notl-связующих и прыжковых клонах как маркеры генов; структура повторов в некоторых микросателлитах 101
3.1.2.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 106
3.2. Картирование «критичных» районов Зр в эпителиальных
опухолях пяти видов 109
3.2.1. Картины аллелыюго дисбаланса полиморфных маркеров Зр в эпителиальных опухолях 109
3.2.2. Частота аллельных изменений в разных районах Зр в опухолях пяти видов; типы аллельных делений 111
3.2.3. «Критичные» районы Зр, общие для опухолей разного происхождения; идентификация новой «горячей точки» МЕСАЗ в районе Зр21.31 122
3.2.4. Повышенная частота амплификации аллелей в районе МЕСАЗ (D3S2409-D3S3667) 124
3.2.5. Сужение критичных районов АР20 и LUCA (Зр21.33, Зр21.31) 126
3.2.6. Корреляция частоты аллельных изменений в критичных районах Зр с прогрессией опухолей
3.3. Идентификация потенциальных TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ и других критичных районах Зр
3.3.1. Скрининг кандидатов на роль TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ с помощью программы серийного анализа экспрессии генов (SAGE)
3.3.2. Изменения уровня мРНК генов DAG1, RHOAIARHA, GPX1
(МЕСАЗ) и TSG SEMA3B в клеточных линиях и первичных опухолях
3.3.3. Гомозиготные делеции в области гена GPX1 и умножение копий гена RHOAIARHA в опухолях
3.3.4. Изменение содержания альтернативных транскриптов гена USP4 в опухолях
3.3.5. Новый вариант сплайсинга и изменение копийности гена MST1R/RON в опухолях
3.3.6. Кандидаты на роль TSG из других ключевых районов Зр: изменение уровня мРНК в опухолях и структурные изменения в генах
3.4. Метилирование промоторных областей генов RASSF1A, SEMA3B, RHOA и MST1R/RON в эпителиальных опухолях разной локализации
3.4.1. TSG RASSF1A (LUCA, Зр21.31)
3.4.2. Кандидат на роль TSG, ген SEMA3B (ШСА, Зр21.31)
3.4.3. Протоонкоген RHOAIARHA (МЕСАЗ, Зр21.31)
3.4.4. Кандидат на роль протоонкогена MST1RIRON (МЕСАЗ, Зр21.31)
3.4.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров Заключение. Перспективы дальнейших исследований
Выводы
- Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (TSG)
- Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования
- Частоты встречаемости и особенности распределения дитри- и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы 13
- Сужение критичных районов АР20 и LUCA (Зр21.33, Зр21.31)
Введение к работе
Первые успехи в выявлении молекулярной природы рака вселили надежду на разработку новых более эффективных подходов к терапии онкологических заболеваний. Так как рак имеет разную этиологию и опухолевая прогрессия связана с бесконечной комбинацией генетических и эпигенетических изменений, порождающих несоизмеримый ряд аномалий, возникло убеждение, что и лечение рака должно быть таким же разнообразным, как и нарушения. Поиск оптимальной терапии онкологических заболеваний представлялся Геракловой и практически невозможной задачей. Однако эти утверждения оказались слишком пессимистичными. Несмотря на то, что злокачественные новообразования чрезвычайно разнообразны н гетерогенны, в основе этих изменений находится относительно небольшое количество критических событий, одновременное проявление которых требуется для малигнизации. Поэтому необходимо определить и понять молекулярную анатомию основных этапов опухолевого патогенеза и разработать терапевтические схемы, направленные на элиминацию этих этапов.
Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, TSG инактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей.
В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост (Чумаков, 1998, 2000). TSG могут также участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые TSG прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации.
Последнее десятилетие характеризуется открытием многих новых онкогенов и TSG. Определение нуклеотидной последовательности генома человека и создание общедоступных баз данных обеспечили мощный подъем онкогеномики и протео-мики. Согласно данным GenBank, в настоящее время известно более сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных), несколько десятков TSG и более 300 потенциальных TSG, расположенных на разных хромосомах человека. Следует отметить, что принятое разделение на онкогены и TSG достаточно условно, поскольку с появлением новых методов и подходов наши представления о роли тех или иных генов и их взаимосвязи могут значительно меняться.
Данное исследование посвящено поиску и локализации на хромосоме 3 человека новых кандидатов в TSG и онкогены. Еще два десятилетия назад было показано, что на коротком плече хромосомы 3 (Зр) геми- и гомозиготные делеции наблюдаются в разнообразных эпителиальных опухолях, причем среди других хромосом, именно Зр повреждается с наибольшей частотой в опухолях легкого и почки (Кок et al, 1997). Посредством микроклеточных гибридов и опытов по переносу субхромосомных фрагментов было показано, что определенные участки Зр характеризуется способностью к подавлению опухолевого роста.
Представленная работа направлена на идентификацию генов, вовлеченных в развитие или подавление эпителиальных опухолей. Исследованы изменения в полиморфных локусах и генах Зр в опухолях легкого, почки, яичников, молочной железы и шейки матки. Опухоли этих локализаций, как известно, широко распространены и характеризуются высокой частотой летальных исходов, которая составляет более половины от общего числа неблагоприятных исходов при онкологических заболеваниях.
Информация об онкогенах и TSG, причинно связанных с онкогенезом или ан-ти-онкогенезом, вносит важный вклад в понимание молекулярных процессов, протекающих при опухолеобразовании. Кроме того, наборы ключевых TSG и онкогенов находят применение в качестве маркеров для диагностики опухолей, прогноза рецидивов и мониторинга терапии в клинике (Зборовская, 2000; Лихтенштейн и Потапова, 2003; Белохвостое и Румянцев, 2003а,б).
Важную роль в поиске таких генов сыграли работы, направленные на локализацию наиболее часто повреждаемых, так называемых «критичных» районов Зр,
потенциально содержащих TSG и онкогены. Основной подход к локализации критичных районов основан на применении полиморфных маркеров.
При картировании отдельных хромосом человека и генома в целом важную роль сыграли полиморфные и STS-маркеры. Наиболее эффективными среди полиморфных генетических маркеров справедливо признаны микросателлиты - короткие тандемные повторы от 2 до 6 нуклеотидных пар. Если участки ДНК, окружающие повторы микросателлитов, имеют единственную локализацию (уникальны) в геноме человека, то такие локусы могут быть идентифицированы с помощью по-лимеразной цепной реакции. Высокополиморфные маркеры, локализованные на генетической карте друг относительно друга с помощью анализа сцепления, были использованы при построении и стыковке YAC-контигов генома человека. Неполиморфные STS-маркеры, охарактеризованные по их нуклеотидной последовательности, условиям их идентификации с помощью ПЦР и по локализации на хромосоме, также широко применяли при построении физических карт генома человека как на основе соматических и радиационных гибридов, так и на основе перекрывающихся клонов (космид, YAC-, РАС- и ВАС-клонов, Notl-связующих и Notl-прыжковых клонов). Полиморфные маркеры, кроме полногеномного картирования, используют для локализации генов наследственных заболеваний и других генетических повреждении, например, связанных с возникновением опухолей.
К 1993 г. генетическая карта второго поколения генома человека содержала 550 локализованных полиморфных маркеров, исключительно динуклеотидных (разрешение около 5 сМ, Weissenbach et al, 1992). Для позиционного клонирования «больных генов» требовалось увеличить количество маркеров в 5-Ю раз.
В связи с этим представлялось целесообразным провести скрининг новых ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов, в частности, на хромосомах 3 и 13, связанных с развитием онкологических и многих других генетически обусловленных заболеваний. Для хромосомы 3 человека выявлена связь с образованием эпителиальных опухолей {Кок et al, 1997). Для хромосомы 13q показана ассоциация с ретинобластомой, болезнью Вильсона, альвеолярной рабдомиосаркомой, аутосом-ной рецессивной мышечной дистрофией и другими генетическими заболеваниями. В области 13ql2 удалось локализовать второй ген, ассоциированный с развитием рака молочной железы, BRCA2, а также гены-кандидаты лимфоцитарного лейкоза.
В представленной работе идентифицированы новые полиморфные маркеры на хромосомах 3 и 13, причем некоторые из них были применены при анализе аллель-ных изменений в эпителиальных опухолях. Следует указать, что эта часть работы выполнена при поддержке Отечественной Программы «Геном человека».
В следующих разделах диссертационной работы проведены локализация районов на Зр, потенциально содержащих TSG и онкогены, и анализ генов-кандидатов по изменению уровня мРНК в опухолях, по изменению профиля метилирования промоторных областей и на основании других структурных изменений в этих генах.
В последнее десятилетие проявляется особенно повышенный интерес к вопросам, связанным с процессами эпигенетической модификации генов: число опубликованных работ превысило 14 тысяч, и число обзорных статей к 2000 г. достигло 200, а к 2007 г. - 1500. С одной стороны, вызывает интерес сложнейший механизм эпигенетической модификации, протекающей с участием многокомпонентных систем и разнообразных факторов, а с другой стороны, появилась принципиально новая платформа для отбора онкомаркеров и новые подходы к мониторингу и терапии онкозаболеваний.
В представленной работе исследована роль метилирования в изменении активности TSG RASSF1A и SEMA3B и онкогенов RHOA и MST1R/RON в эпителиальных опухолях некоторых локализаций, а также изучена связь метилирования TSG RASSF1A и SEMA3B с прогрессией определенных опухолей, что позволило наметить пути применения этих тестов в клинической онкологии.
В обзоре литературы освещены современные представления о роли TSG и онкогенов в малигнизации клеток, а также рассмотрены генетические и эпигенетические факторы, нарушающие активность генов в опухолях. В одном из разделов обзора описаны основные подходы к идентификации и исследованию TSG и онкогенов.
Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (TSG)
Предполагается, что в основе малигнизации лежит каскадный процесс генетических повреждений, затрагивающих не менее 6-20 генов {Loeb, 2001; Zochbauer-Muller et al, 2002). Хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может составлять тысячи, предполагается, что ключевую роль в возникновении указанных свойств неопластической клетки играют нарушения функции генов-супрессоров опухолевого роста (TSG) и протоонкогенов.
Развитие злокачественной опухоли может быть вызвано нарушением регуляции генов, функционирование которых в норме обеспечивает процесс клеточного деления. Эти гены регулируют ответы на ростовые факторы, на гормоны и темп делений. Протоонкогеиы находятся под тщательным и жестким контролем других генов. Мутации протоонкогенов выводят их из-под воздействия генов контроля, делая их автономными. Существует несколько механизмов, посредством которых протоонкогены приобретают способность трансформировать клетку. Так, хромосомные транслокации приводят к тому, что протоонкоген попадает под контроль действующего промотора и начинает работать непрерывно, не позволяя клетке выйти из цикла делений (туе), или направляя непрерывные сигналы от мембраны в ядро (ras), или стимулируя синтез ростовых факторов, посылающих той же клетке сигналы к делению (аутокршшая стимуляция) (Копнин, 2000). Воздействие канцерогенными веществами и облучением вызывает мутации в различных генах, в том числе и в протоонкогенах. Эти мутации могут приводить к изменению свойств белка, контролируемого этим геном. К белковым продуктам протоонкогенов относятся: факторы роста (например, PDHF/sis), рецепторные и нерецепторные тиро-зин-киназы, цитоплазматические сериновые киназы, ассоциированные с мембраной G-белки (активируемые связыванием ГТФ), факторы транскрипции и другие регуляторы (Татосян, 2000). Продукты многих протоонкогенов участвуют в передаче сигналов через мембрану и внутри клетки, что осуществляется через каскад процессов фосфорилирования. Важно, что многие протоонкогены включены в разнообразные сигнальные пути и их пересечения (Vogelstein and Kinzler, 2004). Отсюда становится понятной частая встречаемость нарушений в протоонкогенах в самых разных новообразованиях, их мутации позволяют за один шаг преодолеть несколько важных этапов опухолевой прогрессии и придать неопластической клетке сразу несколько необходимых свойств.
Гены-супрессоры опухолевого роста, по их месту в системе функционирования эукариотической клетки, можно разделить на две большие группы (Kinzler and Vogelstein, 1997). Классические TSG принимают непосредственное участие в процессе деления клеток, контролируя их вступление в ту или иную фазу клеточного цикла. Эти гены получили название "генов-хранителей клеточного цикла" ("gatekeepers"). Белковые продукты этих генов способны сдерживать прогрессию опухолевого роста, ингибируя процессы, связанные с делением клетки. Они могут участвовать в защите ткани от пролиферации посредством апоптоза на разных стадиях малигнизации (Evan and Vousden, 2001). Важную роль в подавлении роста опухолей играют и TSG, обеспечивающие межклеточные контакты и взаимодействия (Ponder, 2001; Hirohashi and Kanai, 2003). TSG второй группы - это "гены общего контроля" ("caretakers"), функция которых состоит в поддержании стабильности генома (Kinzler and Vogelstein, 1997). К группе "генов общего контроля" относят три системы восстановления целостности ДНК: 1) репарация двунитевых разрывов ДНК (BRCA1, BRCA2); 2) репарация не-спаренных оснований (MSH2, MLH1, PHS1, PHS2 и др.); эксцизионная репарация с вырезанием участков ДНК по 24-32 нуклеотида (Копнин, 2000). Так как потеря или повреждение "генов общего контроля" приводит к увеличению скорости возникновения мутаций, они также получили название мутаторных. Обычно скорость мутаций составляет 1x10"6 на ген, и нужно не менее 6 специфичных мутаций для превращения нормальной клетки в опухолевую. Вероятность такого события 1:1014, при этом реальный шанс возникновения опухоли 1014х(10 6)6, или 1:1022. При повреждении генов системы репарации скорость мутаций возрастает на три порядка (10"3) и шанс возникновения опухоли составляет 1014х(10"3)5, или 1:10. Действительно, при нарушении генов такого типа скорость мутаций может возрастать на порядки, что, в конечном счете, приводит к инактивации генов-регуляторов клеточного роста и к активации протоонкогенов (Tomlinson, 1996). Эти процессы повышают вероятность повреждения любых генов, в том числе и "генов-хранителей клеточного цикла".
К настоящему времени идентифицировано несколько десятков TSG, наиболее известные из них приведены в табл. 1. Участие TSG проявляется в контроле клеточного цикла, регуляции пролифирации, индукции апоптоза, а также в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазов (Копнин, 2000; Ровенский и Васильев, 2000; Sherr, 2000; Evan and Vousden, 2001; Comoglio and Trusolino, 2002). Кроме того, TSG могут контролировать трансдукцию сигналов и механизмы адгезии клеток (Hirohashi and Kanai, 2003; Vogelstein and Kinzler, 2004).
Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования
За последние несколько лет сильно увеличился список генов, инактивация которых связана с гиперметилированием промоторных районов. Анализ таких генов может стать одним из основных подходов к разработке ДНК-маркеров, используемых при ранней диагностике рака. Мутации, нарушающие функцию гена, часто расположены в широких пределах, в то время как позиции метилированных CpG-островков в промоторе постоянны и индивидуальны для каждого гена. Поиск изменений профиля метилирования генов может быть применен не только к образцам ДНК первичных опухолей, но и при анализе ДНК, полученной из сыворотки крови, мочи, слюны, мокроты или региональных лимфатических узлов (Esteller et al, 1999b; Palmisano et al, 2000; Sachez-Cespedes et al, 2000; Evron et al, 2001). В нормальных клетках CpG-динуклеотиды, расположенные в промоторных областях транскрибируемых генов, обычно не метилированы. В промоторных областях генов, ассоциированных с развитием опухолей, многие цитозины метилированы.
Саузерн-блот-гибридшация. Изменение профиля метилирования выявляли при исследовании геномной ДНК с помощью метилчувствительных рестриктаз и анализа по Саузерну (Issa et al, 1994). Этому методу свойственны определенные ограничения: 1) требуется большое количество высокомолекулярной ДНК, что невозможно, например, при использовании парафинированных образцов; 2) недостаточная чувствительность при поиске метилирования в гетерогенных образцах, таких как биопсия, в которых кроме опухолевых клеток значительную долю составляют нормальные клетки; 3) метод дает информацию о метилировании только тех CpG-динуклеотидов, которые относятся к участкам узнавания соответствующих рестриктаз.
Анализ метилирования фрагментов ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА). Этот метод основан на комбинировании метилчувствительных рестриктаз и ПЦР (Sadri et al, 1996). Продукт ПЦР виден только в тех случаях, когда расщепление геномной ДНК рестриктазой было запрещено метилированием. Чувствительность метода выше, чем при гибридизации по Саузерну, но он не лишен ряда минусов: 1) исследуется метилирование только тех CpG-динуклеотидов, которые входят в состав участков узнавания метилчувствительных рестриктаз; 2) зависит от полноты расщепления рестриктазами геномной ДНК; 3) недостаточная очистка ДНК от белка может приводить к ложно-положительным результатам.
Бисульфитный сиквенс. Этот метод (Frommer et al, 1992; Myohanen et al, 1994) основан на модификации ДНК, в результате которой все цитозины переходят в урацил, в отличие от метилированных 5 -метилцитозинов. Модифицированные образцы должны быть амплифицированы и секвенированы. В некоторых случаях (гетерогенность материала) требуется предварительное клонирование ПЦР-продуктов. Основными проблемами данной методики является ее трудоемкость и непригодность к быстрому скринингу больших выборок образцов. Но в то же время она позволяет наиболее точно исследовать уровень метилирования гена в опухолях и оценить степень гетерогенности материала.
Метилспецифичная ПЦР (МС-ПЦР). МС-ПЦР основана на бисульфитной конверсии метилированной или неметилированной нуклеотидной последовательности ДНК с последующей ПЦР (Herman et al, 1996). Преимуществами МС-ПЦР являются: 1) отсутствие необходимости применения рестриктаз и как следствие отсутствие проблем с неполной рестрикцией; 2) возможность анализа метилирования CpG-динуклеотидов независимо от наличия участков рестрикции. Чувствительность метода МС-ПЦР для разных генов сильно различается и колеблется от 10"5 до 10"2 (Herman et al, 1996). В целом, чувствительность МС-ПЦР выше, чем при микроса-теллитном анализе (0.5x10 ) (Wong et al, 2001). Высокая эффективность метода подтвердилась при исследовании мокроты у пациентов с плоскоклеточным раком легкого, метилирование было выявлено в промоторных районах генов p!6INK4 и MGMT почти в 100% случаев (Esteller et al, 1999а).
Комбинированный бисульфит-рестриктазный анализ (КОБРА). Метод основан на стандартной процедуре модификации ДНК бисульфитом с последующим расщеплением продуктов ПЦР рестриктазами и количественным анализом (Xiong et al, 1997). Праймеры для ПЦР не содержат в своем составе CpG-динуклеотидов, для того чтобы не зависеть от статуса метилирования исследуемого образца. При анализе продуктов ПЦР из гетерогенной популяции, результат будет отражать процентное соотношение метилированных аллелей па данном участке ДНК.
Бисулъфитная ПЦР-SSCP (BiPS) (Maekawa et al, 1999; 2001). Разработан метод, основанный на бисульфитной обработке ДНК с последующим SSCP анализом продуктов ПЦР. Праймеры подобраны таким образом, чтобы они работали независимо от статуса метилирования исходной последовательности ДНК. BiPS позволяет легко оценить уровень метилирования фрагмента ДНК и соотношение метилированных аллелей. Если все сайты в данном фрагменте в исследуемом образце метилированы, то на геле будет видна одна полоса. Однако иногда продукт виден в виде двух полос или смазан, что обусловлено неоднородностью метилирования и гетерогенностью исходного материала, и не подходит для количественного анализа.
Модификация ДНК бисульфитом в комбинации с полимеразной цепной реакцией є реальном времени (ПЦР-РВ).
На первом этапе проводится стандартная обработка геномной ДНК бисульфитом, на втором - гибридизация с пробой, содержащей на 5 - конце флуоресцентный краситель (FAM) и на 3 - гаситель (TAMRA) (Lo et al, 1999; Eads et al, 2000). К преимуществам такой комбинации методов относятся, в первую очередь, повышение чувствительности и получение количественной характеристики степени метилирования гена в образце, например, возможность оценить долю клеток, в которых ген метилирован {Lo et al, 1999).
Частоты встречаемости и особенности распределения дитри- и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы 13
Эта часть работы выполнена нами на базе лаб. проф. Е.Р. Забаровского (Каролинский Институт) и лаб. проф. B.C. Прасолова (ИМБ РАН). Для работы использовали клеточные линии рака легкого SCLC (ACC-LC5, U2020, NCI-N417, NCI-H146) и NSCLC (NCI-H157, NCI-H647, А549), почечноклеточного рака, RCC (ACHN, 786-0, КН39, Caki 1, Caki 2, ТК164, KRC/Y, А498, HN51), рака молочной железы, ВС (MCF7, MDA-MB231, MDA-MB435S, MDA-436, ВТ-20, ВТ474), карциномы яичников, ЕОС (CaOv, SK-OV-3, OVCAR-3) и рака шейки матки, СС (HeLa, CaSki, SiHa). Все использованные в работе клеточные линии человека (монослойные культуры) культивировали в специальных средах: IMDM/RPMI или DMEM (глюкоза 4.5 г/л), содержащих 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), в клеточных инкубаторах с 5% содержанием С02 при температуре 37С. Клетки пассировали в условиях, оптимизированных для пролиферации в логарифмической фазе роста; после достижения субконфлюэнта прикрепленные культуры промывали раствором PBS, открепляли от подложки смесью трипсин/EDTA (0,25 г/л трипсина 1:250 и 0,2 г/л ЭДТА из расчета 1 мл/25 см ) и снова рассеивали на чашки Петри. После открепления клеток от поверхности культуральной посуды добавляли среду DMEM (или IMDM/RPMI) с FCS и суспендировали пипетированием. Клетки рассеивали на необходимое количество чашек Петри или культуральных флаконов в нужном разведении (1:3 - 1:5). Для криоконсервации клетки (после добавления смеси трипсин/ЭДТА и после открепления от культуральной посуды) суспендировали в среде DMEM (или IMDM/RPMI) с FCS и центрифугировали 5 минут со скоростью 800 об/мин на центрифуге Jouan CR 422 при температуре 15С. Осадок суспендировали в смеси FCS + 10% DMSO и разливали по 1 мл в пробирки для криоконсервации и плотно завинчивали крышками. Пробирки с клетками помещали в пенопластовую коробку, заполненную ватой, и ставили коробку в холодильник на -70С на 15-24 часа. На следующий день пробирки переносили в холодильник с температурой -135С для продолжительного хранения. Сбор клеток для выделения РНК и ДНК осуществляли следующим образом. Клетки наращивали на 10 чашках Петри (диаметром 90 мм) до состояния монослоя, отбирали среду и промывали PBS. Для выделения РНК на клеточный монослой наливали 1.5 мл лизирующего буфера (4М гуанидинизотиоцианат) и инкубировали 30 мин. Лизат аккуратно переносили в 2 мл крио-пробирки и замораживали на -70С. Для выделения ДНК клеточный монослой обрабатывали смесью трипсин/EDTA. После открепления клеток их суспендировали в PBS и осаждали центрифугированием. Супернатант отбрасывали, а осадок либо сразу использовали для выделения ДНК, либо замораживали на -70С.
Анализ аллельных дисбалансов (AI) полиморфных маркеров хромосомы Зр в ДНК опухолей проводили с использованием 24 высокополиморфных микросател-литных маркеров, а именно 10 три- и тетрамерных маркеров, выбранных из базы данных CHLC (Cooperative Human Linkage Center), 13 динуклеотидных маркеров из базы данных GDB (Genome Data Base) и одного динуклеотидного маркера D3S4285/NL1-024, идентифицированного нами (Брага и др., 1997, см. ниже 3.1.2.). Параметры маркеров приведены в таблице 4.
В дополнение к широко применяемым повторам (СА)п применены три- и тет-рамерные маркеры. В отличие от димерных повторов картины электрофоретиче-ского разделения три- и тетрамеров не содержат теневых полос. Эти маркеры характеризует высокая гетерозиготность и простота электрофоретического разделения продуктов ПЦР при более высоком разрешении, чем в случае димерных повторов.
Расположение маркеров на Зр взято из базы данных NCBI (Build 33) и согласуется с UCSC Browser. Праймеры и условия ПЦР взяты из базы данных GenBank Amplicon. Разделение продуктов ПЦР проводили в 8-20% полиакриламидном геле (см. ниже) с последующим окрашиванием геля раствором серебра. Интенсивность полос на гелях анализировали с помощью видео системы Gel Imager и программы Gel Analysis (ДНК-Технология, Москва, Россия).
Синтез олигонуклеотидных праймеров выполнен на фирмах ЗАО Синтол, Ли-тех и Life Technologies.
Для анализа изменения копийности (например, амплификации) фрагментов генов в опухолях и идентификации новых HD также применяли мультиплексную ПЦР. Использовали контрольные праймеры на сохранность ДНК. ПЦР проводили на приборе Терцик (ДНК-Технология, Москва, Россия). Продукты мультиплексной ПЦР исследуемого и контрольного фрагментов генов разделяли электрофорезом в 1.5%-ном агарозном геле. Интенсивность полос анализировали с помощью видео системы Gel Imager и программы Gel Analysis (ДНК-Технология, Москва, Россия). Для подтверждения HD в составе гена использовали две пары праймеров к каждому гену и праймеры - к контрольному локусу (табл. 6).
Метод МЧРА основан па способности метилчувствительных рестриктаз расщеплять участки узнавания на ДНК, содержащие цитозин, в отличие от 5-метилцитозина. ДНК последовательно инкубировали с НраІІ (CCGG), Hhal (GCGC), Acil (CCGC/GCGG) и Bshl236I (CGCG), полученные фрагменты использовали в качестве матрицы для ПЦР. С этой целью 0.5 мкг геномной ДНК обрабатывали 5 ед. рестриктазы в 25 мкл инкубационной смеси в течение ночи. Расщепление ДНК рестриктазами Hhal и НраІІ проводили в буфере Y, Bshl236I - в буфере
R, Acil - в "NEBuffer №3" при 37 С. Состав буферов приведен в протоколах фирм "MBI Fermentas", "BioLabs" и "СибЭнзим".
Сужение критичных районов АР20 и LUCA (Зр21.33, Зр21.31)
Так как хромосома 13 содержит гены рибосомных РНК, можно предположить, что роль такой последовательности принадлежит семейству генов рРНК. Тем более, что размер повторяющейся единицы рДНК человека составляет 43 т.п.н. {Gonzales et al, 1995) и нетранскрибируемый спейсер генов рРНК млекопитающих, как известно, содержит множество мини- и микросателлитов (Braga et al, 1985; Yava-chev et al, 1986). Чтобы выявить космиды, содержащие последовательности рДНК, был проведен скрининг панели клонов с двумя типами зондов на рДНК. В качестве одного из зондов был использован олигонуклеотид, соответствующий участку узнавания интрон-специфической эндонуклеазы iPpol, характерной для 28S рДНК. В качестве второго зонда использовали суммарную ДНК пяти космид, локализованных в области ядрышкового организатора (Кост и др., 1994). С учетом этих данных был проведен анализ встречаемости микросателлитов в области рДНК.
Обращает на себя внимание тот факт, что в клонах, содержащих рДНК и составляющих лишь около 2% от всех космид, выявляется непропорционально большое количество микросателлитов. С учетом размера вставки (35.4 т.п.н.) было рассчитано среднее расстояние между соседними локусами для каждого из семи мотивов в области рДНК. Эта величина для пяти мотивов (GACA, GACT, ТСС, САС и GA) составила 20-40 т.п.н. С учетом этих данных, хромосома 13, использованная для конструирования космидной клонотеки, содержит около 60 повторяющихся единиц рДНК (табл. 14). Кластер рДНК, имеющий протяженность 2.6 млн.п.н., содержит 1 локус GATG и от 60 до 120 локусов мотивов GACA, GACT, ТСС, САС и GA.
Учитывая соотношение размеров вставки и повторяющейся единицы рДНК, было рассчитано число копий рДНК, содержащих микросателлит данного мотива (табл. 14). Из 60 повторов рДНК на хромосоме 13 практически все содержат микросателлиты мотивов ТСС, GACA и GA, каждый второй содержит мотивы САС и GACT, каждый пятый - мотив TCG и лишь один повтор из 60 содержит мотив GATG.
Вне области рДНК, то есть на основной части хромосомы 13, средние расстояния между соседними локусами для 7 мотивов составили 1-2 млн.п.н. Для пяти мотивов (GACA, GACT, С AC, ТСС и GA) эти величины на 1-2 порядка больше, чем в области рДНК (табл. 14). Среднее расстояние между локусами мотива GATG не зависит от их принадлежности к области рДНК.
Локусы, принадлежащие области рДНК, являются структурным элементом повторяющейся последовательности более крупного размера и поэтому не могут быть использованы для создания генетических маркеров. Мотив GATG распределен независимо от семейства средне повторяющихся последовательностей рДНК и может быть применен для картирования хромосомы 13 и других ядрышкообра-зующих хромосом - 14, 15, 21 и 22.
Субклонирование и определение нуклеотидной последовательности микросателлитов на 13q; гетерогенность повторов.
Статистический анализ данных гибридизации упорядоченных панелей клоно-теки позволил нам выбрать 120 клонов, гибридизующихся с зондами на мотивы GACT и GATG, но негативных по гибридизации с зондами рДНК. Эти клоны исследовали методом гибридизации по Саузерну с пробами на повторы. Наличие ло-кусов микросателлитов подтверждено у 40 космид (33% от общего числа позитивных клонов). Большинство GACT-позитивных космид содержали кластеры из ло-кусов (GACT)n, в то время как 15 из 22 GATG-позитивных космид (-70%) содержали единственный локус повтора. Семь GATG-позитивных космид (-30%) содержали несколько локусов (GATG)n (рис. 7), что указывает на значительно меньшую степень кластеризации этого мотива и подтверждает целесообразность его применения для формирования маркеров.
Положение GATG- и GACT-позитивных космид определяли методом флуоресцентной гибридизации in situ (в лаборатории проф. А.В. Зеленина, ИМБ РАН). Оказалось, что большинство GACT-позитивных космид относятся к области яд-рышкового организатора, напротив, все GATG-позитивные космиды, в том числе и содержащие кластеры из локусов (GATG)n, были локализованы на длинном плече хромосомы 13. Распределение повторов (GATG)n вдоль плеча 13q нельзя назвать равномерным, так как большинство локусов (11 из 15) относятся к району 13q31— q34, т.е. к дистальной части длинного плеча хромосомы 13. В той же области (13q32—q34) ранее был выявлен избыток СА-повторов (Gerken et ah, 1993). По-видимому, для теломерного района хромосомы 13 характерно повышенное содержание микросателлитов определенных мотивов. Причем, согласно нашим данным, и в этой области хромосомы 13 (вне рДНК) локусы микросателлитов, например, мотива GATG могут быть сблочены.
